[doc格式] 脱氮硫杆菌的分离鉴定和反硝化特性研究

[doc格式] 脱氮硫杆菌的分离鉴定和反硝化特性研究 脱氮硫杆菌的分离鉴定和反硝化特性研究 第29卷第1O期2008年10月环境科学 ENVIRONMENTALSCIENCE Vo1.29.No.10 0ct..2008 脱氮硫杆菌的分离鉴定和反硝化特性研究 车轩,罗国芝.,谭洪新,吴嘉敏,蒋燕,齐巨龙,孙大川 (1.上海水产大学生命科学与技术学院,上海200090;2.中国水产科学研究院渔业机械仪器研究所,上海200092) 摘要:从土壤中分离到1株高活性自养反硝化菌TD,并对其进行了鉴定和硝酸盐还原特性研究.该菌株为革兰氏阴性短杆 菌,严格自养.16SrDNA序列分析明,该菌株与Thiobacillusdenitrificans相似性为99.85%.结合生理生化特性和16SrDNA序列 分析,确定菌株TD为脱氮硫杆菌.通过对该菌的生长特性和反硝化特性的研究表明,该菌在初始pH为6.85,32.8?培养条件 下脱氮效果最佳;在初始pH为6.90,29.5oC培养条件下生长最快.该菌生长比较缓慢,没有明显的稳定期,对数生长期阶段的 反硝化能力最强,反硝化速率最快,达到了2.245mg?(L?h),,在培养过程中培养基pH值明显下降.较高盐度对该菌株的反硝 化活性有抑制作用.该菌株的急性毒性实验结果显示,脱氮硫杆菌对 健康鱼体几乎无毒,属于无毒性菌株. 关键词:自养反硝化;脱氮硫杆菌;生理生化特性;16SrDNA;反硝化特 性;硝酸盐氮;盐度;毒性 中图分类号:X172文献标识码:A文章编 号:0250.3301(2008)10.2931.07 Isolation,IdentificationandDenitrificationCharacterizationofThiobacillus denttrff~cans CHEXuan 一,LUOGuo.zhi,TANHong.xin,WUJia.min.,JIANGYan,QIJu.1ong,SUNDa.chuan (1.CollegeofAqua—lifeandTechnology,ShanghaiFisheriesUniversity,Shanghai200090,China;2.FisheryMachineryandInstrument ResearchInstitute,ChineseAcademyofFisherySciences,Shanghai200092,China) Abstract:Aautotrophicdenitrifyingbacterialstrain,TD,wasisolatedfromsoilandthestrainwasidentifiedandcharacterized.Thestrainwas gramnegative,strictlychemolithoautotrophic,andshortrodshapedbacterium.The16SrDNAsequenceanalysisrevealedthatstrainTDhada similarityof99.85%withThiobacillusdenitrificans.Accordingtothemorphologie,physi0bi0chemicalcharacteristicsandtheanalysisofits 16SrDNA,thestrainwasidentifiedasThiobacillusdenitrificans.StudiesshowedthattheoptimalconditionsfordenitrifieationwerepH6.85 and32.8?.whiletheoptimalgrowthconditionswerepH6.90and29.5oC.Thebacteriagrewslowlywithnoapparentstablephase.The maximaldenitrificationratereached2.245mg.(L.h),,whichwasfoundinex ponentialphase.Intheprocessoftheculture,themediumpH decreasedsignificantly.RelativelyhighsalinityrestrainedthedenitrificationactivityofThiobacillusdenitrificans.Theacutetoxicitytestresults toxic. showedthatThiobaciUusdenitriftcanswasnon— Keywords:autotrophicdenitrifieation;Thiobacillusdenitrificans;biochemicalandphysiologicalcharacters;16SrDNA;denitrifieation characteristic;nitrate;salinity;toxicity 在循环水养殖系统(recirculatingaquaculture system,RAS)的水环境控制中,过去主要通过硝化作 用将氨态氮转化为硝酸盐氮,积累的最大硝酸盐氮 浓度可高达400,500mg/L”,而大量积累的硝酸 盐氮主要通过换水等方式排出循环水养殖系统. 近年来,硝酸盐氮对水生动物的毒性及净化工艺成 为研究热点,大量研究表明,高浓度硝酸盐氮易导致 水生动物的生长速度降低,易患病,发育迟缓,繁殖 力降低,成活率降低,并建议将循环水养殖系统中 的硝酸盐氮浓度控制在50mg/L.因此,循环水养 殖系统中硝酸盐氮浓度的控制十分重要. 尽管异养反硝化工艺研究较多,但对于循环养 殖水这种C/N低于1的特殊水体,采用该工艺将导 致运行费用高及运行管理困难等问题.自养反硝化 细菌,特别是脱氮硫杆菌(Thiobacillusdenitrificari,s)的 发现引起了研究者的普遍关注,对自养反硝化的 报道,主要集中在反硝化工艺方面,而对于脱氮硫杆 菌生理生化以及反硝化特性方面的报道较少.脱 氮硫杆菌作为硫自养反硝化菌,其生物特性和硝酸 盐降解特性的研究对于该菌在实际生产中的开发应 用具有重要指导意义.本研究通过定向富集,从土壤 中分离获得1株具有较高反硝化活性的化能自养菌 TD,生理生化和分子生物学鉴定其为脱氮硫杆菌, 并在实验室条件下对该菌的反硝化特性进行了分 析,以期为循环水养殖系统中高浓度硝酸盐氮的控 制提供理论依据. 收稿日期:2007.10.20;修订日期:2007一l2.11 基金项目:国家科技支撑项目(2006BAD03B06);上海市重点学 科 建设项目(Y1101) 作者简介:车轩(1981,),男,硕士研究生,主要研究方向为养殖水污 染控制,E.mml:dandan—zw@tom.com *通讯联系人,E—mail:hxtma@shfu.edu.ca 2932环境科学29卷 1材料与方法 1.1细菌的富集,分离 1.1.1培养基组成 基本培养基:Na2S203?5H205g,KNO32g, KH2P042g,NaHCO31g,MgCl2’6H200.5g, FeSO,?7H00.01g,用蒸馏水定容至1L.121oC灭菌 30rain备用. 富集培养基按照2X基本培养基组成配制. 向基本培养基中加入18g/L琼脂粉,加热溶解 后121oC灭菌20rain,制作分离平板培养基. 1.1.2样品来源与富集及分离 取上海市复兴岛公园内的土壤(约地表下 15om),以1g/L的比例放入富集培养基,静态培养, 培养温度28?.定时转接,富集培养物被系列稀释 后涂布平板,28?培养,根据菌落特征差异挑取单菌 落于液体培养基再次培养.如此重复直至在显微镜 下只能观察到单一的目的菌.将纯化菌种斜面划线 培养并保存,以备后用. 1.2菌种的鉴定 1.2.1分离菌株的透射电镜观察 1.2.2菌种的生理生化鉴定 采用生化反应管测定分离菌株TD的生理生化 指标,并参照文献[7]进行鉴定. 1.2.316SrDNA同源性 (1)总DNA提取 取对数期的菌液50mL,离心收集菌体,抽提基 因组总DNA.加500L裂解缓冲液(50mmol/LTfis pH8.0,20mmol/LEDTA,50mmol/LSucrose)重悬细 胞,再加入溶菌酶至终溶度10mg/mL,37oC水浴10 rain.加入SDS至终溶度为1%(质量分数),蛋白酶 K至终溶度为100~g/mL,37?继续处理30rain.酚: 氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提,2倍体积的无水乙醇沉 淀DNA,最后用不含DNase的RNaseA除去RNA. DNA样品可直接进行PCR扩增. (2)细菌16SrDNA全长序列的扩增 参照Bosshard等的方法进行.细菌通用引物 序列如下:8f:5.AGAGTI’rGATCCTGGCTCAG.3和 1492r:5一GG,IfrACC1TrGrrrACCACTI’-3,产生相应于 大肠杆菌(Esche~chiacoil)16SrDNA序列核苷酸位 置8,1510的PCR产物.25PCR反应体系中,包 括:2.5L10XPCR反应缓冲液,12.5mmol/L dNTP,1UTaq酶,各16.25mmol/L的上下引物, DNA为50ng.PCR反应经95?预变性5rain 后,进行30个循环:95?1min,50cc1min,72oC延 伸2rain.最后72?延伸10rain.PCR产物置于 一 20~C下保存备用,作为扩增分离菌种16SrDNA片 断的模板. (3)16SrDNA序列的鉴定 PCR产物经连接,转化,阳性克隆筛选,将含有 正确转化片断的菌体培养液送至上海生物服务 公司测序.最后将测定的序列提交GenBank数据库, 与数据库中已有的16SrDNA序列进行相似性比较 分析,并构建系统进化树. 1.3温度和pH值对分离菌株生长和反硝化代谢 的影响 1.3.1分离菌株TD的最适生长pH值和最适反硝 化pH值 在250mL三角瓶中装入100mL培养液,硝酸 盐氮浓度设定为35rag/L,初始pH值依次调控至为 1,2,3,4,5,6,7,8,9,在28?下以120drain振荡培 养,通过测定培养液的D(opticaldensi~,=610 am)值和硝酸盐氮降解率的变化来判断菌体的生长 和代谢情况. 1.3.2分离菌株TD的最适生长温度和最适反硝 化温度 试验设计同1.3.1,温度依次设定为l0,l5,20, 25,30,35,40?. 1.4分离菌株的生长特性和反硝化活性检测 以硝酸盐氮为唯一氮源,将菌种按体积分数 1%的量接种到含有35mg/L硝酸盐氮的液体培养 基中,30?振荡培养,100h补加硝酸盐氮至89.44 g/L,继续培养.每隔8h检测其中硝酸盐氮,亚硝酸 盐氮的含量,菌体的浊度以及培养基的pH值. 1.5分离菌株在不同盐度条件下的反硝化活性 用去离子水配制盐度分别为0%,1.0%,1.5%, 2.O%,2.5%,3.O%的人工海水,加入1.1.1所述培养 基成分制作液体培养基,将菌种按体积分数1%的量 接种到含有35mg/L硝酸盐氮液体的培养基中,28~C 振荡培养.每8h检测1次硝酸盐氮,硝酸盐完全 去除所需时间和72h内的硝酸盐氮降解率. 1.6分离菌株的急性毒性实验 1.6.1菌悬液制备 将已纯化的菌株接种在平板上,28?培养72h 后,用无菌生理盐水洗下菌苔,用细菌比浊仪依次调 整菌液浓度至10×lO9,10X10.CFU/mL[l0]. 1.6.2致病性试验 选择无外伤,游动活泼的鲫鱼(平均体长12 10期车轩等:脱氮硫杆菌的分离鉴定和反硝化特性研究 cm,平均体重55g)为供试鱼,饲养5d后,以肌肉 注射和鱼体擦伤浸泡进行攻毒感染.肌肉注射菌株 TD的不同浓度菌液,分为5个试验组和1个对照 组,对照组用无菌生理盐水.浸泡感染试验2个试验 组,用菌液以擦伤鱼体感染,1个对照组同环境养 殖.每组用鱼均为10尾.试验期间不喂饲料,水温控 制在25?.人工感染试验结束后,连续观察2周,记 录死亡情况,如出现供试鱼死亡现象,采用Reed. Muench法计算半致死浓度LC 1.7检测方法 硝酸盐氮:紫外分光光度法;亚硝酸盐氮:N一(1. 萘基)一乙二胺光度法. 2结果与分析 经过定向富集,得到1株在接种后72h即产生 大量气泡,迅速降解硝酸盐氮的菌株,命名为TD.该 菌好气下生长缓慢,菌落仅有针尖大小,透明;厌氧 培养菌落直径约0.5,1mm,圆形,白色或半透明, 扁平且润湿(图1).异养培养不生长. 2.1分离菌株的透射电镜观察 图1菌株TD的菌落和电镜照片(×19000) Fig.1Lawnandelectronmicrographimages(×19000)ofstrainTD 菌株TD的细胞呈短杆状,单个或短链状排列, 以单根极生鞭毛运动,大小约为(0.5,0.8)m× (1.5,2)m. 2.2分离菌株的鉴定结果 2.2.1生理生化鉴定 分离菌株的生理生化鉴定结果见表1,根据形 态,生理生化特征,初步鉴定该菌株属于硫杆菌属 (ThiobaciHus). 表1菌株TD的生理生化特性” Table1PhysiologicalcharacteristicsofstrainTD 项目结果项目结果 革兰氏染色一产生H,S一 运动性+产生N,+ 氧化酶一异养生长(葡萄糖,蔗糖)一 硝酸盐(还原)+赖氨酸一 硝酸盐(产气)+精氨酸一 亚硝酸盐(锄气)+鸟氨酸一 1)”+”表示反应呈阳性,”一”表示反应呈阴性 2.2.216SrDNA序列分析 细菌总DNA与16SrDNA全长PCR扩增结果 如图2,图3所示,其中1,2,3为该菌的3个重复.将 测序结果与GenBank上已登录的基因序列进行比 对,发现与Thiobacillusdenitrific鲫同源性最高,为 99.85%.利用MEGA3.1软件,将分离菌株与部分参 考菌株基于16SrDNA序列构建系统进化树(如图 4).综合生理生化特性和分子生物学特性,确定该菌 株为脱氮硫杆菌Thiobacillusdenitnfwans. 23000bp Ml2 图2细菌总DNA的检测结果 Fig.2ResetofgenomicDNAdetection 2000bp 1500bp 图316SrDNA全长的扩增结果 Fig.3Resultofcompletesequenceof16SrDNAamplification 2934环境科学29卷 图4菌株TD与参考菌株基于16SrDNA序列构建的 系统发育树 Fig.4PhylogenetictreebasedOil165rDNAsequencesofstrainTD andthereferences 2.3温度和pH值对脱氮硫杆菌生长和反硝化代 谢的影响 2.3.1脱氮硫杆菌的最适生长pH值和最适反硝 化pH值 不同起始pH对脱氮硫杆菌生长速率和反硝化 速率的影响实验(图5)发现,pH对其生长和反硝化 活性的影响基本一致,当pH从2升至7时,该菌的 生长速率和反硝化速率逐渐提高;但当pH继续升 至9时,其生长速率和反硝化速率都不断下降.对 图5结果进行非线性拟合,可得脱氮硫杆菌的最适 生长pH为6.90,最适反硝化pH为6.82,二者基本 一 致. 2.3.2脱氮硫杆菌的最适生长温度和最适反硝化 温度 从图5可以看出,温度对脱氮硫杆菌的生长和 芝 錾 尝Q 霎 图5pH和温度对菌株TD生长速率和反硝化速率的影响 Fig.5EffectofpHvalueandtemperatureongrowthrateanddenitrifieationrate ofstrainTD 反硝化代谢活性均有明显影响;温度对生长的影响 不同于对反硝化活性的影响.当温度从l0qC升到 30?时,菌体的生长速率逐渐增大;温度继续升高 后,菌体生长速率减慢.菌体的最适反硝化温度高于 最适生长温度.对图5结果进行非线性拟合,可得菌 株的最适生长温度为29.5?,最适反硝化温度为 32.8?. 2.4脱氮硫杆菌的生长特性和反硝化特性 2.4.1脱氮硫杆菌的生长曲线 脱氮硫杆菌生长比较缓慢,没有明显的稳定期, 这与有关报道一致,生长曲线如图6所示,该菌要 经过约100h的延滞期才能进入对数生长期,由反 应式(1)可知,脱氮硫杆菌的反硝化过程会产生 H,该时期细菌的高速增殖产生的大量H导致了 培养基pH迅速由6.37下降到5.1.经过大约38h 的对数生长期之后,由于营养物质.硝酸盐氮的逐渐 碍 裱 锰 普 图6脱氮硫杆菌的生长曲线 Fig.6GrowthCurveofThiobacillusdenitrficans 消耗,加之培养基酸性增加,改变了细菌的最佳生长 环境,细菌的生长进入衰亡期,逐渐死亡. ??如加?O 如柏如加:2m=兮0 0OOOO0OOOO ??加?卯加如加0 1O期车轩等:脱氮硫杆菌的分离鉴定和反硝化特性研究 0.84S2O;一+0.35C02+NO3+0.43H20 +0.09NH4+0.09HCO;一0.09C5H702N +0.5N2+1.7S04~一+0. 069H(1) 2.4.2脱氮硫杆菌的反硝化特性 (1)反硝化过程中硝酸盐氮的变化特性 菌株在以硝酸盐氮为唯一氮源的培养基中生长 时,溶液中硝酸盐氮浓度的变化曲线如图7所示, 可以看出,在菌体的整个生长过程中,脱氮硫杆菌均 具有降解硝酸盐氮的能力,但在菌体生长的不同阶 段所表现出的硝酸盐氮降解速率却明显不同(如图 8),该菌在对数生长期阶段的反硝化能力最强,硝酸 盐氮的降解速率最快,达到了2.245mg?(L?h),,大 约是其在延滞期的硝酸盐氮降解速率的5倍,到了 衰亡期,随着底物浓度的减少,同时也由于酶的耐受 时间过长,硝酸盐氮降解速率最慢,只有其在对数生 长期的1/10. 曩 鬃 蜇 翟 曲 褂 煳 嬖 进 城 钲 普 图7硝酸盐氨的变化 Fig.7Variedcurveofnitrate Q 图8生长各个阶段的硝酸盐氮降解速率 Fig.8Degradationefficieneiesofnitrateindifferentgrowthperiod (2)反硝化过程中亚硝态氮的变化特性 菌株在以硝酸盐氮为唯一氮源的培养基中生长 时,溶液中亚硝酸盐氮浓度的变化曲线如图9所示, 可以看出,在脱氮硫杆菌生长的延滞期,随着硝酸盐 氮浓度的下降,亚硝酸盐氮的含量迅速上升,于40h 达到峰值后逐渐下降,但下降速度比较慢,直到72h 硝酸盐氮降为0mg/L后,亚硝氮的降解速度才明显 加快,并于96h时降为0mg/L,该现象说明菌株先 利用硝酸盐氮作为反硝化电子的供体,即硝酸盐的 还原先于亚硝酸盐的还原.这一现象在Blaszczyk…J 将1个从活性污泥中分离的ParacoccusdenitrificaD,s 菌株培养于无机盐培养基时也被观察到.他发现只 有当培养基中的硝酸盐完全耗尽时,亚硝酸盐才开 始被还原.目前,对于这种现象的解释主要有2种, 一 种与生物的优先利用原则有关:和亚硝酸盐相比, 以硝酸盐作为电子受体时,基质释放的能量较高,故 菌株优先利用硝酸盐;另一种解释与反硝化酶系的 合成顺序有关:Kucera等在Paracoccus denitrificans中检出的反硝化酶合成顺序为硝酸盐还 原酶,N0还原酶和亚硝酸盐还原酶.在对数生长期 补加硝酸盐氮至89.44mg/L后,溶液中的亚硝酸盐 浓度在4h内即达到峰值,并于8h内迅速降为0 mg/L,之后溶液中的亚硝酸盐含量一直保持在很低 的浓度,未出现积累. 图9亚硝酸盐氮的变化 Fig.9VariedctlrYeofnitrite 2.5不同盐度条件下的反硝化活性 不同盐度下脱氮硫杆菌72h内的硝酸盐氮降 解率如图1O所示.由图10可知,在盐度O%1.5% 条件下,盐度的增加对于该菌的硝酸盐氮降解率几 乎没有影响,72h内的硝酸盐氮降解率均达到 2936环境科学29卷 静 鐾 域 盏 舔 IlIlI1 05lOl52O2530 盐度 图l0不同盐度下72h内的硝酸盐氮降解率 Fjg,10NitratedegradationrateunderdifferentsMinitywithin72h \ 垦 鲁 篮 根 戚 锰 翟 图l1不同盐度下硝酸盐氮安全去除时问 Fig.11Completenitrate~movMtimeunderdiffe~ntsalimity 95.51%以上,当盐度继续增加至2.0%以及更高间没有出现供试鱼死亡现象,脱氮硫杆菌对健康鱼 时,细菌的硝酸盐氮降解率出现了逐渐下降的趋势,体几乎无毒性. 当盐度升至3.0%时,硝酸盐氮降解率降到了.…. 35.8%.推测较高盐度对该菌株的反硝化活性有抑.… 制作用.但从图11的不同盐度下硝酸盐氮完全去除生物脱氮以其无污染,脱氮彻底和安全等优点被 时间看,在盐度2.0%,3.0%条件下,硝酸盐氮完全认为是目前最经济,有效,可行性高的水体除氮方 去除时间差异并不明显,估计这是该菌对高盐度适法h”].与异养反硝化相比,自养反硝化不需向水体引 应的结果,说明该菌对于较高盐度具备一定的适应入有机物,可避免对水的再次污染.近几年对于应用脱 性和耐受性.氮硫杆菌的自养反硝化特性进行饮用水,地下水和废 2.6脱氮硫杆菌的急性毒性实验水脱氮的研究活跃,而将其应用于RAS系统的养殖用 由表2和表3结果可知,在为期2周的实验期水国内外尚无报道,这 是一个亟待解决的问题. 表2人工感染实验结果 Table2Res~tsofartificinfectionexperiment 由于硫杆菌属的种类较多,种间的生化特性差 异不大,对于这些生化特性不典型的菌株,往往很难 确定是某一种菌,通过分子生物学的方法对其进行 进一步分类鉴定,成为另一种更具优势的鉴定手段. ?????柏0 l0期车轩等:脱氮硫杆菌的分离鉴定和反硝化特性研究 本研究在常规鉴定的基础上,进一步利用分子生物 学的方法对菌株TD进行了鉴定,得出了一致的鉴 定结果,说明这2种方法在硫杆菌属内种水平的鉴 定中可以相互补充,得出更为可靠的鉴定结果. 较高盐度(>2.0%)对脱氮硫杆菌的反硝化活 性表现出抑制作用.嗜盐反硝化细菌数量较少,主要 包括古细菌中的Haloarcula,Halobacterium,Haloferax 及细菌中的Halomonas和Bacillus等几个属的某些 种n.Yoshie等n指出盐度降低了污水处理系统中 亚硝酸盐还原酶基因的多样性,从而将反硝化过程 阻断在亚硝酸盐向氮气转化的阶段.但脱氮硫杆菌 在盐度0%2.0%之间显示有较高的反硝化活性, 并且对2.0%以上的盐度表现出了一定的逐渐适应 的能力,此特点使得该菌在海水水体的生物脱氮领 域具备了巨大的潜力. 作为自养菌,该菌在生长上受到一些限制,比如 生长较慢,菌浓度较化能异养菌低,对环境的变化 (如温度,pH等)较为敏感等缺点,有待研究者利用 现代各种分子生物学技术手段进一步的深入分析和 改造.本实验分离得到的脱氮硫杆菌具有较高的自 养反硝化活性,并经初步毒理实验表明,无急性毒性 反应,故在污水处理,生态环境治理,以及在RAS系 统的水质控制等应用中具有十分广阔的发展前景. 4结论 (1)从土壤中分离得到的高活性自养反硝化菌 TD,综合其生理生化特性以及16SrDNA同源性分 析,确定该菌株为硫杆菌属的脱氮硫杆菌 (Thiobacillusdenitrificans). (2)脱氮硫杆菌对温度和pH等环境的变化敏 感.最适生长条件为pH6.90,温度29.5?.在初始 pH为6.85,32.8?培养条件下脱氮效果最佳. (3)该菌生长比较缓慢,没有明显的稳定期,对 数生长期的反硝化活性最高,反硝化速率最快,达到 了2.245mg?(L.h),. (4)该菌株属于无毒性菌株. 参考文献: [1]HondaH,WatanabaY,KikuchiK,eta1.Highdensityrearingof JapaneseFlounder,Paralichthysolivaceuswithaclosedseawater recirculationsystemequippedwithadenitrifieationunit[Jj. Suisanzoshoku,1993,41:19.26. OtteG,RosenthalH.Managementofclosedbrackishwatersystem forhighdensityfishculturebybiologicalandchemicMwater treatment[J].Aquaculture,1979,18:169-181. vallRijnJ,TalY,SchreierHJ.Denitrifieationinrecireulating systems:theoryandapplications[J],AquaculturalEngineering, 2006,34:364-376. Gutierrez—WingMT,MaloneRF.Biologicalfiltersinaquaculture: Trendsandresearchdirectionsforfreshwaterandmarineapplications [J].AquaculturalEngineering,2006,34:163-171. 车轩,吴嘉敏,谭洪新,等.自养反硝化研究进展及在循环水养 殖系统中的应用[J].渔业现代化,2007,1:13.16. 刘宏芳,汪梅芳,许立铭.脱氮硫杆菌生长特性及其对SRB生 长的影响[J].微生物学通报,2003,30(3):46.49. 布坎南RE,吉本斯NE.中国科学院微生物研究所《伯杰细 菌鉴定手册》翻译组译.伯杰细菌鉴定手册[M].(第八版). 北京:科学出版社,1984.643.650. BosshardPP,SantiniY,GraterD,eta1.Bacterialdiversityand communitycompositionintheehemoclineofthemeromietiealpine lakeCadagnoarevealedby16SrDNAanalysis[J].FEMSMiembiol Ecol,2000,31:173—182. 石亚素,王建跃,王世意,等.海水网箱养殖大黄鱼烂尾病病 原研究[J].海峡预防医学杂志,2006,12(4):7-9. 胡学峰,石存斌,潘厚军,等.海水养殖斜带石斑鱼溃疡病病 原菌(溶藻弧菌)的初步研究[J].中国海洋大学,2005,32 (2):232.236. BlaszezykM.Effectofmediumcompositiononthedenitrifieationof nitratebyParacoccusdenitrificans[J].ApplEnvironMicrobiol, 1993,59:3951-3953. KuceraI,MatyasekR.AerobicadaptationofParacoccus denitrificans:Sequentialformationofdenitrificationpathwayand changesincontinuouscultureofPseudomo?la$stuter【Jj.Appl EnvironMicrobiol,1989,55:1670.1676. 李军,杨秀山,彭永臻.微生物与水处理[M].北京:化学工 业出版社.2002.378.380. MorenoB,G6mezMA,Gonzdlez—L6pezJ,eta1.Inoculationofa submergedfilterforbiologicaldenitrifieationofnitratepolluted groundwater:acomparativestudy[J].JHazardMater,2005,117 (2.3):141.147. ZumftWG.Cellbiologyandmolecularbasisofdenitfification【J』. MicrobiolMolBiolRev,1997,61(4):533.616. YoshieS,NodaN,TsanedaS,eto1.Salinitydecreasesnitritereductase genediversityindenitrifyiagbacteria0fwastewatertreatmentsystems[J]. ApplEnvironMicrobiol,2OO4,7o(5):3152-3157. ]]];]]]]]]]]] 234567890l23456_n_寸_卜…_n_寸一一一一