高压液相层析法测定血浆同型半胱氨酸及其初步应用

高压液相层析法测定血浆同型半胱氨酸及其初步应用 高压液相层析法测定血浆同型半胱氨酸及 其初步应用 辛f3之凰西辛\詹 床指导垦兰量查!!!:,! 高压液相层析法测定血浆 同型半胱氨酸及其初步应用足< QuantitativeAssayofPlasmaTotalHomocysteine withHPLCandItsApplication toAssessmentofVascularDiseases / 童圭(HuangQiqing)墨查(HuiRumi)张春玲(ZhangChunling) 高润霖(GaoRunlin)刘海波(LiuH~ibo)孙余华(SunYuhua) 叶珏(YeJue)宋莉(SongLi)高岩(GaoY舢) 周宪粱(ZhouXianliang)刘力生(LiuLisheng)张健(ZhangJian) 王兴字(WangXinyu) obi~etive:Toestahlishame~odfordetectionofplasmatotalhomocysteinewi thHPLCanditsapplicationt0 studyoftherelationshipbetweenhomocystei~eandvasculardiseasesMetho ds:AccordingtoDurandetal,we utilizedaHPLCsystemwithfluorescencedetectionofplasmatotalhomocysl einederivatizedfromreaetinnwitham- moninm-7.fluoro-benzo-2.oxa.I.3-diazole-4.sulphonate(sad.F1.Hcyswasmonitoredinpatientswithcoronaryheart diseases(33eases)andstroke(52cases)andin40controls.Results:ThemethodL~/ISUtleSverygoodrecovery(,】O0%), reprodueihilityandp~ecision(withinassay:3.5%:day-to?dayassay:4.2%).Morethan55%patienmwithstrokeand 35%pationtswithcoronaryheartdiseaseshavehighconcentrationofplasmaHcys.ConclusionsThemethodestablished ca/1beappliedtoroutineclinicuse.ThestudyshowsthatplasmaHchasapositiverelationwithvasculardiseases. 目的:建立高压液相层析测定血浆总同型半眈氨酸 momoeystaine,Hcys)的方珐,应甩它初步研究血浆 Hys与一脑血管病的关系. 方法:参照Durand等的方法…,应用与巯基特异结合的荧光物质 SBD-F衍生疏基,用荧光探剥器HPLC测 定Hcys的浓度.对40制正常人.33倒冠一病患者.52例脑卒中病人血 浆Hcys进行了测定. 结果:建立的方法回收率高(,100%),准确性厦重复性好(批内变异为 3.5%;批间变异为4.2%)55%以 上脑卒中患者,35%以上冠心病患者血浆Hcys有明显升高. 结论:所建立的方法可用于临床常规捡测,初步研究结果明血浆 Heys与心脑血管病有明显正相关 f~-.g的心37. 因素因此,寻找新的心瞄血管疾病的 危险因素,可以帮助我们改善对心脑血 管疾病发病机制的认识,制定新的防治 策略,开发新的防治药物 1969年,当时在哈佛大学病理科工 作的McCuUy墩授首先发现隐陛常染 色体遗传病,先天性丙氨酸一丁氨酸 硫醚合成酶缺乏的儿童有高同型半胱氨 酸尿症,伴有血管损害及反复心陆,肾, 肺栓塞,经过近3O年来的大规模动物, 临床研究,国际上对轻度血浆高同型半 胱氨酸是心脑血管疾病的一个独立,重 要的危险因素取得了共识血浆同型半胱氨酸对预测心脑血管病的 重要性, 但是真正国人自己发展起来的测定方法 尚未见报道.我们根据临床工作的需要, 建立了高压液相层析测定血浆同型半胱 氨酸的方法,并对加例正常人,33侧 经冠状动脉造影证实的冠心病人,52例 经CT扫描证实的脑卒中病人进行了血 浆同型半胱氨酸的测定,结果显示,心 脑血管病变者,血浆同型半胱氨酸水平 明显升高. 材料和方法 试剂 sBF购自Flka,乙酰半胱氨酸, 同型半胱氨酸,半胱氨酸,谷胱甘肽, 半胱费喊甘氨酸,3-丁基瞵均购自Sigma 公司.其他试荆为国产纯. }羊晶处理 参照Durand等的方法…,取空腹血 2~3ml(0.1%EDTA抗凝).立B口冰浴冷 却’并于30分钟内离心.收集血浆,一20? 保存.测定样品为240血浆,加入乙 酰半胱氨酸(终浓度0.5mM)作内对照, 用3?丁基膦C终浓度6OmU)4?处理30 分钟,充分还原巯基,0,6M高氯酸变性 蛋白,2oo0g离心10分钟,取上清5I, 加入I.55MNROH10ah硼酸缓冲液 I25’0.125M.pH9.5,含4mMEDTA), 5砷】sBF(IIn咖1),60?水浴60分钟, 冰浴冷却’取l5IIlHJ,Lc分析. 仪器与屠析条件 使用仪器为惠普HPII~型HPLc, IM5荧光探测器,C18反相柱.荧 光检测条件:激发波长390rim,放射波 长470rim;流动相为0.o8M醋酸缓冲液, pH4.0.1%甲醇,流速n8m.m,洗脱时 间15m缸. 应用 了一批 正常人,脑卒中及冠心病患者. 正常组选取体格好并经体检各项 指标均正常者为正常对照.男性及女性 各20倒,其中男性平均年龄41.8~11.2 岁(26~7岁),女性38.8~9.9岁(23~0 ). 冠心病组:经临床及冠状动脉造影 诊断为冠心病患者共33侧,男性28倒, 平均年龄48.9士8.7岁,女性5例,平均 年龄48.4~84岁. 脑卒中组:经临床及cT扫描诊断 为脑卒中患青共52例,其中男性29侧, 平均年龄54.9士】】.1岁,女性5例,平均 年龄5I.8~9.3岁 结果 方法的特异性 利用与琉基特异结合的荧光物质 SBD我们可在血浆中检出五种物质 (图I),用Sigma品作对照,它们按 洗脱顺序依次为半胱氨酸,同型半胱氨 酸,半胱氨酰甘氨酸,谷胱甘肽以及内 对照乙酰半胱氨酸. 枝准与定量 由于荧光物质发光强度具有不稳定 的特性,用常规外标准样品直接定量不 易准确.我们在每个样品中加入定量的 内对照,利用样品峰与对照峰的相对比 值来定量,结果稳定,可靠,获得良好 的线性关系(r=0.9994)(图2).在血浆 样品中加入已知浓度的半胱氨酸标准 品,用此法差减后定量,获得良好的回 收结果(,100%)(表I).批内变异为 3.5%(n=l0),批间变异为4.2%(n=l2). 正常人与病人血裳中总Homo. cys~ine的测定 联 皋 曾 测定及统计结果如表2 讨论 5l 近30年来,很多研究指出,高同型 半胱氨酸血症是周围,脑,冠状血管阻 塞性病变的独立危险因素有2万名美 国医生参加的健康研究证实,男性血 浆同型半胱氨酸>I5.8~oVL(5%病人), 急性心肌梗死的危险性3.4倍于< 14.1.儿的男性.特别是已患冠心 病,但无血脂异常,无高血压,无其它 常规传统危险因素的病人,年龄较大, 停经的妇女,更有必要检查其是否有高 同型半胱氨酸血症.实上,据美国大 系列流行病学研究推算,血浆高同型半 胱氨酸约占总的心血管危险因素的 10%,每年造成约5万人死于冠心病发 作,用叶酸,?tB.等便宜且毒性低的 药物进行干预,可降低血浆同型半胱氨 酸水平,如若有效的话,每年可望挽救 5万人的生命.血浆总Hcys也可用于 预测胎儿有无神经脊柱裂,深静脉血 栓形成,还可作为高同型半胱氨酸尿 症患儿的可常诊断指标.故建立测定 血浆总Hcys的方法有着广泛的临床意 义.但由于方法学与仪器的限制,此项 可以造福于成千上万病人的心脑血管病 预测指标在国内尚不能为临床所用. 我们参照PDura?d等的方法,建 立了简便易行的血浆同型半胱氨酸的测 定方法,方法稳定,可靠,重复性好. 利用此方法初步对经各项检查无心脑血 管病,无代谢性疾病的4o例正常人进 2?5日1O”14m 洗脱时间(分钟I 图1高压液相层析分析凡血浆中SBD-F衍生的.琉基物质 52临床指导世界兰翌童!!,:: 图2同型半胱氨酸(Homocysteine)校准曲线 表1混台血浆中加入已知浓度的Homocysteine(Hcys)后 用本方法测定所得浓度(回收实验) 表2正常人,冠蝴及脑卒中患者血浆总Hornocyst~ine(Hcys)水平分析(x?s) 参考文献 1.Om’~dBFavdmU.Ltumicz-.C,~mS.n.Hypcrbomocysteinemiainduced by白c’刚de丑ci口mcthi(min~]oe.d..applic~fionofamodj耐HPLC TDcaimcaChimicaAcLq.19963-52:B3-93. 2KSv曲p曲oI啊ofhomocys~ncmia:ImpIlm”.nsfl.rthep. hogcn~ism嘴ckmAmJPatholI96956:ll1—128 3.MccnH帅q锄neavtsc盯击睇a衅譬NatureM.d1螂卫:388 4b耐s岫MJ,BJEeI&LH啊口ocy啦me~llsmrisk ofm 报道接”对52例经CT扫描证实的 畸卒中患者进行血浆同型半胱氨酸的测 定,男性患者中58.6%,女性患者中 56.5%明显高于正常值的上限.脑卒中 患者平均血浆同型半胱氨酸水平明显高 于正常组.对33例经冠状动脉造影证 买冠C耥秆了冠状动脉扩张术的患 者的测定结果表明,36,7%的病人血浆 同型半胱氨酸升高.由于患者系在发病 后抽血测定,故血浆同型半胱氨酸水平 是否能预测心脑血管病的发生有待于进 一 步证实. 目前,世界发达国家普遍开展血浆 同型半胱氨driskofyoc删In?0口inusphysiciansJAMA l99L268:877.88l 7Mo~lskyAG}m0qsI口e?h删riolo吕d哪cv=~disezse. n叫nl de~eetssadHceci(i.AmJHumG吐l螂.58l7.20 8Heij~-MD.k蕊1日B10mMJ.HHype~h4maocysteinemia孵ariskfactor 甜dccp-~e/n~0mbosisNE衄IJ恻I996,334:759.763 MuddsH,LevyHL.byD酬啪of协ms铷10n1n:Sctiwc Bc眦d亡tA1.SlywS,llcDTbeMetabolicandMuIarbsofinl~dted diseaseMc~raw-Hill,NcwYorkl27l北7