一种罕见的人类白细胞抗原HLA—B／Cw座位间的基因重组

一种罕见的人类白细胞抗原HLA—B／Cw座位间的基因重组 一种罕见的人类白细胞抗原HLA—B,Cw 座位间的基因重组 ?628?2006年3月7日第86卷第9期NailMedJChina,March7,2006,Vol86,No~9 一 种罕见的人类白细胞抗原HLA—B/Cw 座位间的基因重组 骆媛孙玉英金荔梁飞刘楠宋新强袁方刘曙光刘金锋奚永志 【摘要】目的探讨人类白细胞抗原复合体HLA—B/C座位间的基因重组.方法采集拟进行 造血干细胞移植的一例患者(男,39岁)及其妻女的外周血标本,首先对其HLA—I,?类区域的5个 经典基因位点进行顺序特异引物PCR(PCR—SSP)低,高分辨基因分型及SBT分析,然后再进行遗传家 系分析研究,确定HLA基因重组相关位点.结果HLA高分辨基因分型的结果证实患者(AML—M5 患者)的2条单倍型分别为A}2402101一Cw}030401/0402一B}1301一DRB1}O4O6一DQB1}030302/ O303与A}02011一Cw}150201/0202一B}4002一DRB1}1405一DQBI}05031;其女儿的2条单倍型分别 为A}02011一Cw}150201/0202一B}1301一DRB1}0406一DQB1}030302/0303与A}24O6一Cw}06O2一B} 1302一DRB1}070101/0102一DQB1}0202;患者配偶的2条单倍型则分别为A}330301/0302一Cw} 030201/0202一B}5801一DRB1}17一DQB1}0202与A}2406一Cw}0602一B}1302一DRill}070101/0102一 DQB1}0202.从遗传家系分析显示,患者的女儿所携有的父源A}02011一Cw}150201/0202是源自 父亲的一条染色单体,而B}1301一DRB1}O4O6.DQB1}030302/0303则源自父亲 的另一条染色单体, 这表明父亲的2条染色单体在减数分裂时HLA—B和一Cw基因座位间发生了 重组,即2条染色体间发 生了交换,重组后的单倍型又完整地遗传给了女儿.结论首次在国际上发现并证明 了一例罕见的 中国汉族人群HLA—B/C基因座位间的基因重组家系,这为更深入的研究HLA重 组机制奠定了坚实 基础. 【关键词】人白细胞抗原;重组,遗传 AnunusualrecombinationeventoccurringbetweenHLA-Band-CwlociwithinaChineseHall familyLUOYtmn.SUNYur.JlNLi.LIANGFei.uUNan,SONGX一 qiang,YUANFn_ng,uU Shu-guang,UUJinn{蜃,xIYong-zhi.DepartmentofImmunology.HospitalAffiliatedtotheAcademyof I~litaryMedicalSciences,LaboratoryofImmunoa~say,NationalCenterofBiomedicalAnalysis,Beifing JD口ID71.China Correspondingauthor:XIYong-zhi.Email:撕@yahoo.eom 【Abstract】ObjectiveToinvestigatetherecombinationeventoccurringbetweenHLA— Band.Cw locidiscoveredinafamilyofChineseHannationalitywithanacutemyeloidleukemia(AML)patient. MethodsPeripheralbloodsampleswerecoHectedfromaChinesemanwitllM5typeAML.aged39.and hishealthywifeanddaughter,allofHannafionMity.HLAclassI(一A,一B,and— Cw)andI1(一DRB1 and— DQB1)allelesweretypedbybothlowandhighresolutionPCRwithsequencespecificprimer s(PCR. SSP)andsequence— basedtyping(SBT).Thentllerecombinationsiteswereanalyzedbyfamilystudy. ResultsThe2haplotypesofthepatient,hisdaughter.andhiswifewereA}24O2101一 Cw}030401/0402. B}1301一DRB1}O4O6一DQR1}030302/0303andA}020l1.Cw}150201/0202一 B}4002一DRBl}1405. DQB1}05031.A}0201l—Cw}150201/0202.B}1301一 DRB1}O4O6.DQB1}030302/0303andA} 24O6一Cw0602一B1302一 DRB1070101/0102.DQB10202.andA330301/0302一Cw}030201/0202. B}58-1一DRB1}17一DQB1}0202andA}24O6.Cw}0602一 B}1302.DRB1}070101/0102.B5801一 DRB1}0202respectively.FamilystudydemonstratedthatA}020l1一 Cw}150201/0202recombinationand B}1301一 DRB1{030302/0303recombinationcarriedbvthedaughtercsffflefromthe2isolatedchrom osomes ofherfather,indicatingthattherecombinationeventoccurredbetweenHLA—Band— Cwlociduringmeiosis 0fthefatherandresultedinanewHLAhaplotypethatwasinhefitedbytlledaughter.Condusio nAn unusualHLA— B/CwrecombinationeventoccurringbetweenHLA.Band.CwlocihasbeenfoundinaHan family,whichhelpsfurtherstudytllemechanismsofHLArecombination. 【Keywords】HLAantigens;Recombination.genetic 基金项目:国家"973"重大基础研究基金资助项目(2003CB515509);国家自然科学 基金资助项目(30470751) 作者单位:100071北京,军事医学科学院附属医院免疫学研究室及国家生物医学 分析中心免疫学研究室 通讯作者;奚永志,Email:xiyz@yahoo.corn . 论着 2006年3月7日第86卷第9期NadMedJChina,March7,2006~Vol86,No.9 人类主要组织相容性复合体(MHC)又称人类 白细胞抗原(HLA),是调控人体特异性免疫应答和 决定疾病易感性个体差异的主要遗传系统,具有高 度多态性].基因重组是HLA多态性产生的重 要机制之一[2.3],因此,近20年来对HLA重组的相 关研究已成为免疫遗传学与人类后基因组学等研究 领域的热点].已有的研究表明,HLA的重组 具有种族特异性以及非随机分布等特点,国际上 已发现的HLA位点间的重组主要发生在A—Cw及 B.DR位点间.而有关中国汉族人群HLA重组的相 关研究迄今为止尚未见报道.由于HLA?I类分子 上的.B和-Cw两个座位间距离较近,约85kb,呈高 度连锁不平衡,因此在这两位点间发生重组的几率 极低,迄今国际上仅有一例报道.本研究首次报 道在中国汉族人群中发现一种罕见的HLA—B/.Cw 座位间的重组家系. 对象与方法 一 ,对象 中国北方汉族北京地区的两代人家庭:父亲,母 亲和女儿.父亲39岁,患有M5型急性髓性白血 病,其妻女均健康. 二,方法 1.DNA的提取:采用德国Qianen公司提供的 QIAampDNABloodMiniKit提取.取0.5%乙二胺 四乙酸(EDTA)抗凝全血200至1.5ml离心管, 加入200l缓冲液AL和20蛋白酶K混匀, 56cI=孵育10min,加入200无水乙醇混匀,转移 至树脂柱,8000r/min离心1min,加入500lAWl, 8000r/min离心1min,加入500AW2,13000r/ min离心3min.将树脂柱转移至1.5ml离心管中, 加入200无菌水,室温孵育1min,8000r/min离 心1min.紫外分光光度仪(美国BECKMAN公司)测 A260/A28o为1.7—1.9,DNA定量为50—100ns/. 2.HLA?I,?类PCR?SSP高,低辨分型:重组 家系的3个个体的HLA.A,B,C,DRB1及DQB15 个位点的低分辨分型分别采用美国戴诺公司提供的 PEL-FREEZABCSSP(t#026)及DRDQ3T SSPTM(I~t#O02)分型试剂盒;高分辨分型采用该公 司提供的A24(I~t#002),A02(I~t#010),A 19(I~t#003),BwHR(I~t#O03),B13(I~t#O02), B40(Lot#006),CwHR(Lot#O10),DRB103(Lot# 003),DRB104(I~t#O07),DRB114(I~t#001), DRB107(Lot#004),DQB1(Lot#004)分型试剂盒. 按照试剂盒说明将适量DNA,蒸馏水,Taq酶与PCR 缓冲液混合均匀后,取8混合液加入分型板的反 应孔中,阴性对照孑L不加,用密封条封闭试剂板,并 标记样品号.将试剂板放在PE-9700PCR仪上进行 PCR反应,反应参数为96cI=608,1个循环—+96cI= 258,70cI=508,72cI=458,5个循环—6cI=258, 65cI=508,72cI=458,21个循环—6cI=258,55cI= 608,72cI=1208,4个循环.取PCR反应产物8l 上样到2%的琼脂糖凝胶,150V电压下电泳4min. 在紫外凝胶成像仪下观察结果,分析电泳带的格局, 确定等位基因. 3.序列特异性分型(SBTtyping):鉴于重组家 系成员的HLA.B位点高分辨PCR.SSP结果B 1301和B1302难以分开,故用SBT法对B位点全 长基因组进行测序分型,并比较父,女B位点基因 组差异,以判断重组是否发生在B基因座位上.选 用美国Promega公司生产的微量DNA提取试剂盒 提取外周血基因组DNA.用HLA.B位点通用引 物5'GGACTCAGAGTCTCCTCAGACGCCGAG3 和5CTGGGGAGGAAACACAGCTCAGCATGGGAAC3 扩增B位点全长基因组.PCR扩增体系:10×缓冲 液5l,dNTP(2.5mmol/L)4p,1,gDNA3l,引物 各1,Pyrobest日本TaKaRa公司高保真酶 (5U/~I)0.25,无菌水35.75,总体积50. 循环参数为:94?30s,66?30s,72?3min, 10个循环一94cI=308,64cI=308,72cI=3min. 20个循环—?72?10min.用DNA回收纯化试剂盒 美国Marligen公司回收纯化PCR产物后,插入 PGEM?Teasy美国Promega公司载体,转化DH5a大 肠埃希菌,挑阳性克隆送上海博亚公司进行测序. 结果 1.患者及其家庭成员的HLA分型结果:首先 进行的HLA低分辨率基因分型的结果分别为,患者 A24?Cw03?B13?DRB104?DQB1033与A 02一Cw15?B40?DRB1,Ic14?DQB105;女儿的为 A02一Cw15一B13?DRB104?DQB103与A 24?Cw06?B13?DRB107?DQB102;妻子的则为 A33?Cw03?B,Ic58?DRB117?DQB102与A 24?Cw06一B13?DRB107?DQB102.为进一步 确定该家系的HLA等位基因,我们又进行了HLA 高分辨率基因分型实验,结果详见图1.由此可以 初步推测该家系为HLA重组家系. 2.HLA?B位点全长基因组测序结果:由于在对 HLA—B位点进行高分辨分型时, 不能将B1301及B1302有效 分离,故对该家系3个成员的 HLA—B基因座位进行全基因组克 隆测序,由此能够将PCR—SSP高 分辨方法难以分辨的B1301和 B1302清楚地区分开来,保证了 分型结果的准确性.同时将父, 女的测序结果进行对比,发现两 人的B1301座位基因组序列并 无差异,提示重组不是发生在B 位点上. 医学杂志2006年3月7日第鲞筮翅丛坚坚!: Iz4O2?.?I-!Cw.03040?/o402H跏?,o?HDRB???HDQB??030302/0303 × ozo?? Hc"?sO2O?10202HB??魄I-tDRB????sHDQB?.o姗? A啦.?? Hc"?5020?/0202t-t?,o?I-tDRB??oI-tDQB?*030302/03., 图2父亲的两条染色单体重组发生在HLA复合体中的位置(等位基因的排列按照 从端 粒到着丝粒的线性排列顺序.父亲的一条单倍型为a,另一条单倍型为b,可见父亲 在其 同源染色体间发生了B—c位点交换,重组后产生了新的单倍型a/b) 3.重组家系的遗传家系分析 研究:为进一步确证该家系重组的发生,我们先进行 HLA单倍型定型,然后再采用遗传家系分析进行研 究.图1所示该重组家庭的遗传图谱,3个成员的 HLA—I(A,B,C),?(DRB1,DQB1)类PCR—SSP高分 辨基因分型结果以及所确定的单倍型.父亲的2条 单倍体设为a和b,母亲的设为C和d,重组后的单 倍体为a/b. 减数分裂的过程中,母亲的单倍体C保持HLA 连锁遗传的特性遗传给了女儿,因此,女儿一条 HLA单倍型型别与母亲完全一致.但是,父亲的染 色单体在遗传给女儿时,等位基因的线性排列组合 方式却发生了变化,在女儿的染色单体中均找不到 与父亲一致的单倍型,分析是由于重组而造成.如 图2所示,女儿父源染色单体上的A02011,C 150201/0202来自父亲的一条染色单体,而B 1301,DRB10406,DQB1030302/0303来自父亲 的另一条染色单体,因此推测父亲的两条染色单体 在减数分裂时HLA—B和一Cw基因座位间发生了重 组,即2条染色体间发生了交换,重组后产生了新的 8^?2402l0l b^?020? c^?2406 dA.33030l/0302 a/bA*0201l CA.2406 单倍型a/b. 讨论 HLA是人类基因组中最具多态性的基因系统, HLA重组是产生其遗传多样性的最主要分子基础, 也是人类不同种族与不同疾病易感性关联的生物学 基础.深入研究HLA重组的分子生物学特性,对于 揭示其等位基因多样性形成的机制以及人体所具有 的抵抗各种致病微生物的防御能力有着极其重要的 意义. 1989年Thomsen等的研究显示:HLA—DR/ GLO的重组率是8.7%,DR/DP的重组率低于1%; 1994年又通过血清学方法对1332个法国家庭的 HLA—A,HLA—B和DR区进行分型发现,HLA—A和 DRB1之间的重组率在2.5%左右,DRB1和GLO之 间的重组率在6%,11%'mJ.1995年Carrington 等HI,对59个人类多态性研究中心(CEPH)家庭 的重组研究中发现,DPB1和HLA—A之间的重组 率<2%,而整个HLA分子的重组率期望值<5%, 这说明HLA重组不是随机发生的.随着分子生物 C~"03040l/0402 Cw*150201/0202 Cw*0602 0o~030201/0202 Cw*l50201/0202 Cw40602 B*I30l B|【4002 B车l302 B|【580l B车l301 B*I302 DRBl?叮4O6 DRBI*I405 DRBI*07010l/ol02 DRBI*I7 DRBl制D4O6 DRBI*070101/o102 DOBI*030302/0303 DQBl*05031 DQBl?O202 DQBl蝴202 DOBI*030302/0303 DQB1.0202 JI|男性患者已死亡;o正常女性;l'b:患者的2条单倩体;c,d:患者配偶的2条单倩 体,^/b:重组后的单倩体 豳1重组家系两代人的遗传图谱及每条单倍体的HLA等位基因型别(女儿父源染 色单体上的A?0201l,C?150201/0202来自父 亲的一条染色单体,而B?1301,DRBI?O4O6,DQBI?030302/0303来自父亲的另一条 染色单体.因此推测父亲的两条染色单体在 减数分裂时HLA-B和-Cw基因座位间发生了重组,即两条染色体间发生了交换) 生旦!旦笠堑鲞筮塑丛婴!t— 学技术的迅速发展,微卫星标记技术的逐渐成熟,很 多HL重组的热点被发现,如HL一?类分子中 的HLA.DNA/RlNG3,DQB3/DQB1,TAP中8.8kb 长度的片段;HLA—I类中的HLA—E/P5,HLA— Cw/OTF3E63,标记D6S105/HLA—A,标记D6S265/ HLA—CwE. 迄今为止,有关HLA—B/Cw位点间的重组国际 上仅有一例报道[6],这可能与两位点之间的物理图 距短(约85kb),两位点高度连锁不平衡有着密切 的关系.而本研究在中国汉族人群中首次发现了这 种罕见的HLA—B和一Cw之间的重组,HLA高分辨及 基因组测序结果均表明重组不是发生在HLA—B位 点上,而是位于HLA—B和一Cw座位之间.HLA—B位 点是HLA复合体中多态性最丰富的基因座位,文献 报道部分主要是由于重组而造成的.由于HLA— I类分子上HLA—B和一Cw之间的距离较短,仅85 kb,因此可以采用单核苷酸多态性(SNP)标记的方 法对HLA—B和一Cw之间进行更精确的分型.目前 已发现存在于HLA—B和一Cw之间的SNP标记有 ~2526227rs2854008,w,2853996,rs2596438, rs2596438这5个特异性标记.本研究的后续工 作将准备选用这5个SNP标记对HLA—B和一Cw基 因座位间的片段进行小规模SNP分型,寻找这例重 组家系更加精确的重组位点. 本研究发现的中国北方汉族家庭HLA—B和一Cw 座位间的基因重组产生了新的单倍型,这对于物种 进化,免疫调节及最佳移植供体的选择都可能产生 一 定影响.鉴于HLA重组的种族特异性,收集更多 的中国汉族人群HLA重组家系,建立遗传图谱,估 算重组频率,探索HLA基因重组的发生机制,为研 究中华民族的变迁以及HLA与疾病的关联提供科 学依据和技术平台就显得尤为迫切. 参考文献 ? 63l? lMungallAJ,PalmerSA,SimsSK,eta1.11IeDNAsequenceand analysisofhumanChl"omosome6.Nature.2003,425:805-8l1. 2奚永志.MHc结构与功能.见:李幼平,吴孟超,郑树森,主编.移 植免疫.北京:中国科技出版社,20o5.8-89. 3CrawfordDC,BhangaleT,LiN,eta1.Evidenceforsubstantialfine— scalevariationinrecombinationratesacro~kqthehumangenome.Nat Genet.2Oo4.36:70o-706. 4MungauAJ,PalmerSA,SimsSK,eta1.11IeDNAsequenceand analysisofhumanChl'omosome6.Nature.2003,425:805-8l1. 5BeckS,GeraghtyD,InokoH,eta1.Completesequenceandgene mapofahumanmajorhistecompatibilitycemplex.Nature,1999, 401:921-923. 6BouissouC,PontarottiP,Crouau—RoyB.Aprecisemeioticmapin theclasslregionofthehumanmajorhistecompatibilitycemplex. Genomics.l995.3O:486492. 7孙玉英,孔繁华,奚永志,等.I?—l类PcR_SsP基因分型在异基因 造血干细胞移植中的应用.中华器官移植杂志,2001,22:326-328. 8LeeJ.Pi11aiS.Completenudeotidesequence0fMHCclassIallelesin theHT29coloncanc口cellline.Ti8lmeAntigens.1993.42:530-532. 9ThonlsenM.AmaudNJ,BorotN,eta1.Recombinationfractionsin theHLAsystembasedonthedataset'ProvincesFrancaises': indicationsofhaplotype—specificrecombinationrate.EurJInmaunol, 1994.21:3343. 1O11IolnsenM,AbbalM,NeugebauexM.eta1.Recombinamininthe HLAsystem.TissueAntis~ns,1989,33:38_40. 1lCarringtonM.Recombinatoinwithintheb.manMHC.Inmaunol Bey.1999,167:245-256. 12CullenM,PerfettoSP,KlitzW,eta1.HigII—resolutionp~ernsof meioticrecombinationacrotstheb.manmajorhistecompatibility complex.AmJHumGenet,2002.7l:759-776. 13CullenM.NobleJ,EriichH.eta1.Characterizationof recombinationintheHLAclas8?region.AmJHulnGenet.1997. 6O:397-4O7. 14MichaelBM,BiasWB,1)elaneyNL,eta1.Recombinationhotspots intheHLAreoilofch_roInoflome6.HumIlnlnunol,l99I6,47:5. 15McAdamSN,BoysonJE,XM.eta1.Auniquelyhi#levelof recombinationattheHLA.Blocus.PrecNatlAcadSciUsA.199I4. 91:5893-5897. 16Wal!EC,Math~KA,Schat~erSF,eta1.Anintegratedhaplotype mapofthehumanmajorhistocom~ibilitycomplex.AmJHum Genet.20o3.73:580-590. (收稿日期:2005-10—14) (本文编辑:朱瑶) 本刊有关文稿中法定计量单位的书写要求 本刊法定计量单位实行国务院1984年2月颁布的《中 华人民共和国法定计量单位》,并以单位符号表示,具体使用 参照1991年中华医学会编辑出版部编辑的《法定计量单位 在医学上的应用》一书.注意单位名称与单位符号不可混合 使用,如ng?kg,?天应改为ng?kg,?d,;组合单位符 号中表示相除的斜线多于1条时,应采用负数幂的形式表 示,如ng/kg/min应采用ng?kg,?rain的形式;组合单位 中斜线和负数幂亦不可混用,如前例不宜采用ng/kg?min . 读者.作者.编者 的形式.在首次出现不常用的法定计量单位处用括号加注 与旧制单位的换算系数,下文再出现时只列法定计量单位. 人体及动物体内的压力单位使用innlHg或clnH:0,但文中 首次出现时用括号加注(1millHg=0.133kPa).正文中时 间的表达,凡前面带有具体数据者应采用d.h,min,s,而不用 天,小时,分钟,秒.量的符号一律用斜体字母,如吸光度(旧 称光密度)的符号为A,"A"为f14*字.