【doc】胆固醇结石、胆囊黏膜和胆汁细菌DNA的检测

【doc】胆固醇结石、胆囊黏膜和胆汁细菌DNA的检测 胆固醇结石、胆囊黏膜和胆汁细菌DNA的 检测 2004年11月第24卷第11规ci』ig.Q:! 胆固醇结石,胆囊黏膜和胆汁细菌DNA的 检测 蔡端朱雷明吕元刘维薇张延龄 【摘要】目的探讨胆固醇结石中细菌DNA的意义.方法用半定量PCR和16SrRNA序列分 析法检测胆囊黏膜,胆汁和胆石的细菌DNA,观察围手术期抗生素的使用对检测结果的影响.结果 (1)结石核心,外周,胆汁和胆囊黏膜细菌DNA阳性率分别为79%,82%,77%和64%.胆石,胆汁和胆 囊黏膜间细菌DNA阳性率无相关性.(2)结石核心,外周,胆汁和胆囊黏膜细菌菌落数对数值(cfu)分 别为3.19?2.09,3.26?2.05,3.23?2.14和3.28?2.70.结石内外菌落数相关系数为0.822(P< 0.05).胆汁和胆囊黏膜菌落数不相关.胆石核心及外周与胆汁和胆囊黏膜菌落数均不相关.(3)术 前用与不用抗生素者胆汁,胆囊黏膜,胆石核心和外周的细菌DNA阳性率均差异无显着性.但用抗生 素者胆汁菌落数下降,与未用抗生素组比较差异有显着性(P<0.0I), 而胆囊黏膜,胆石核心和外周的 菌落数则差异无显着性.(4)胆石,胆汁,胆囊黏膜的细菌DNA序列并 不完全相同,胆石核心与外周部 位的DNA序列也不相同.结论胆固醇结石中细菌DNA可能并非胆 道环境细菌污染的结果.较之胆 汁和胆囊黏膜的细菌DNA,胆固醇结石中的细菌DNA与结石形成 的关系更密切. 【关键词】胆固醇结石;细菌 DeterminationofbacteriaDNAincholesterolgallstones, Lei—ming,LUYuan,ela1.DepartmentoJ?Surgery, FudanUniversity,Shanghai200040,China gallbladderi~lucosaandbileCAIDuan,ZHU HuashanHospital,ShahghaiMedicalCollegeof 【Abstract1ObjectiveToclarifythesignificanceofbacteriaDNAincholestero lgallstone.Methods Semi—quantitativePCRandcomparative16SrRNAanalysiswereusedtodetectbacteriaDNAingallbladder mucosa,bileandcholesterolgallstones.Theinfluenceofperi—operativeuse ofantibioticsolltheresultsofde— tectionwasalsoobserved.Results(1)ThepositiverateofbacteriaDNAincore andperipherypartofgall— stones,bileandgallbladdermueosawas79%.82%,77%and64%respectively,withnopositivecorrelation existedamongthem.(2)Thebacteriaconcentrationsincoreandperipherypartofgallstones,bileandgall— bladdermuco~were3.19?2.09,3.26?2.05,3.23?2.14and3.28?2.70cfu(1ogvalue)respectively. Thebacteriaconcentrationincorepartofgallstonecorrelatedwiththoseofperipheryones(r=0.822,P< 0.05).Nocorrelationexistedbetweenbileandmucosabacteriaconcentrations.Thebacteriaconcentrationsin coreorperipherypartofgallstonedidnotcorrelatewiththoseofbileandmucosea.(3)Whetherornotusing antibiotics,nodifferencesofbacteriaDNApositiveratewereobservedoncoreorperipherypartofgallstones, bileandmuco~x3.Thebilebacteriaconcentrationsfellsignificantlyafterreceivingantibioticsinperi—operation period,whilenochangesoncoreorperipherypartofgallstonesandmucosawereobserved.(4)Thebacteria DNAsequencesingallstones,bileormucosawereoftendifferent.eventhesequencesbetweencoreandpe— ripheryofgallstonewereheterogeneous.ConclusionsThebacteriaincholest erolgallstonemaynotbethe outcomeofcontaminationfrombiliarytract.Comparedwiththebacteriapres entedinbileormucosa,thebac— teriaincholesterolgallstonemayplayamoreimportantroleintheformationof cholesterolgallstones. 【Keywords】Cholesterolgallstone:Bacterium 用PCR和16SrRNA序列分析法在胆固醇结 研室 基金项目:国家自然科学基金资助项目(30070737) 作者单位:200040上海,复旦大学医学院附属华山医院外科教 —— 647—— 论着? 石中发现有丰富的细菌DNA,但这些细菌与胆固醇 结石形成的确切关系尚不明确一.本实验拟对胆 固醇结石患者的胆囊黏膜,胆汁和胆石的细菌DNA 检出率和细菌种类进行比较,并观察围手术期抗生 648华消化杂志2004年L县箜鲞筮塑』g:!:Q!!:,. 素使用对检测结果的影响,以探讨细菌在胆固醇结 石形成中的地位. 材料和方法 一 ,病例及取材 2001年8月,2002年4月在复旦大学附属华 山医院接受择期胆囊切除术的胆固醇结石患者38 例,年龄21,82岁,平均50岁.诊断经病理证实. 患者术前3个月内无急性胆道感染症状.其中l6 例患者围手术期预防性应用抗生素.于术中切除胆 囊后抽取胆囊胆汁5ml,剪取胆囊组织1块.同时 收集胆囊结石,记录其大小,数目,用生理盐水冲洗 干净.标本放在无菌容器内一20?保存. 二,DNA提取 1.胆石:干燥至恒重后取150mg结石粉末用 1%SDS700l在5ml聚丙烯试管内室温培养过 夜.加氯化锂(7mol/L),最终浓度为1.5mol/L. 静置15min.震荡1min,12000g离心15min,取 上清液至Eppendorf(EP)管,用等体积饱和苯酚抽 提2次后,取上清液,加入等体积氯仿一异戊醇抽提1 次,12000g离心10min,取上清液,加1/10体积的 3mol/L醋酸钠.再加无水乙醇(终体积比80%), 一 70?静置2h,全部倒入收集管内的吸附柱中,离 心,将柱放入干净EP管中,加20ulTE洗脱液洗 脱,静置1min,12000g离心10min,洗脱液为提取 到的DNA,一20?保存. 2.胆汁:取500”l胆汁,DNA提取方法同上. 3.胆囊黏膜:15mg胆囊黏膜剪成碎块,DNA 提取方法同上,但省去氯化锂处理步骤. 三,PCR扩增 根据细菌16SrRNA序列设计引物并由中国科 学院上海生化细菌所合成.pl:5一AGAGTTTGAT一 (c/t)(c/a)TGGCTCAG一3;p2:5一ACCGC(g/t)一(a/ g)CTGCTGGCAC一3.PCR反应体系50l包括 Taq酶(5U1)0.5ul,10×PCR缓冲液5t*l,MgC12 (25mmol/L)4ul,dNTP(2.5mmol/L)4ul,25 pmol/L引物pl,p2各1l,ll,灭菌蒸馏水 33.5I.各周期的变性,退火和延伸温度和时间分 别为起始循环95?3min,55lmin,74?l min,然后95?3min,55?1min,74?1rain,进 行35个循环,完成循环后72?保温5min,4?冷 却后终止反应.每次PCR反应时设立一个不含 DNA模板的体系作为空白对照. 四,PCR产物的检测分析 PCR产物经溴化乙锭染色的1.5%琼脂糖凝胶 电泳,紫外灯下观察500bp的特异性扩增条带,回 收纯化样品克隆至T载体,每个样品挑5个克隆测 序(联合基因公司).测序结果与细菌基因库数据进 行对比鉴定菌种. 五,菌落计数曲线的建立 参照Swidsinski等l4j的方法,取E.coli质控菌 (ATCC25922)分别稀释至10,10cfu/ml,各浓度 菌液各取1ml,按照上述方法提取DNA并行PCR 扩增30个循环(此时反应曲线斜率最高).PCR产 物电泳照片用Tanon图像处理系统进行灰度扫描 并绘制菌落计数曲线.PCR35个循环结果为阳性 的样品,模板DNA均与不同浓度的E.coli质控菌 同时行30个循环PCR,通过灰度扫描比较进行菌 落计数. 六,结石胆固醇含量测定 参照Swidsinski等…1的方法,结石磨粉并取50 mg于105?干燥,用1ml甲基叔丁醚在震荡器上 提取5min,12000g离心5min,取50l上清液,用 乙腈(67%体积)和甲基叔丁醚的混合液稀释40倍 (1.95m1).用50mg纯胆固醇同法制备标准品,用 酶法测定.胆固醇含量大于70%者为胆固醇结石. 七,统计学检验 由复旦大学医学院卫生统计与社会医学教研室 协助完成.采用SPSS统计软件.计量指标若为正 态分布且方差齐性,用t检验,否则用非参数检验; 计数指标用Pearson卡方检验;计量指标与计数指 标关联性用非参数检验.P<0.05为差异有显 着性 结果 一 ,细菌DNA检出率 细菌DNA阳性率在结石核心为79%(22/28), 结石外周为82%(23/28).结石内外细菌DNA阳 性率有显着关联性(P<0.01).胆汁细菌DNA阳 性率为77%(23/30),胆囊黏膜细菌DNA阳性率为 64%(23/36).胆石,胆汁和胆囊黏膜问细菌DNA 检出情况并不平行.胆石细菌I)NA阳性者中,胆 汁细菌DNA为阴性者占18.2%,黏膜细菌DNA为 阴性者占45.5%.胆石核心细菌DNA阴性者中, 胆汁细菌DNA为阳性者占50.0%,黏膜细菌DNA 为阳性者占83.3%.胆石外周细菌DNA阴性者 中,黏膜细菌DNA为阳性者占40%.统计学检验 显示,胆石,胆汁和胆囊黏膜间细菌DNA阳性率无 譬缝盘查【望I『望鲞望ll_J_L!J4V?24. 荚联性(胴汁口H囊黏膜比较.fl(II】.UU恢t 与胆汁和胆鬟黏膜比较,P值分别为[15981 0.673:胆石外周与汁和帆嵌i膜比较.P分别为 【I544干u1[1【1) 细茼菌落教(取刊数值? I质控茼浓度梯度的建立:1屁示.对数稀 释的”“质控茼1)NA的Pt,R产物绦电泳l具 有怠好的线性关系1(JrfLR产物儿乎阴性 反应.10cfuI(„R产物旱弱阳肚,10,Ii)f?f?K 产物呈强阳性 托记物,III-lllI{Il_ 手l=JIIl.cfu 图1f,目稀释侣城J 2标术的闰落计数:J)结干恢IL,简落数由 (319?209)c[u.结百外周f326士2(15,『ll, 两者差异无显着性ctLt3758)f2)ml汁细菌菌 落数为【323?2l4)cfu,胆囊黏膜蔺落敞为c328 ?270)c3)内外曲落数中H关系数为 0822ft<I=J05)l汁和月日囊黏膜莳落数锕关 【fJ_,fl755).胆石核心_j月H汁和归踅稚膜茼蒲数 均不相关(P值分由l】_6I4晕?n166).外用 与胆汁和胆鞋黏噗菌落数亦均相关fJ值分别为 01【J和0.221)) ,1术前使用抗牛素与细菌DNAm性 较差舁有显蓍cP<0叭).囊 稚心落数l1不百 核心和外周的卣落数也莘异无显着(P值分别2,J 03680600和(I477, 旧,P(„】产物测序结粜 标木细葡DNAm性者椰为泄合感,缚标 本f{t细茼1)NA序列2,5种不等.菌种主要包括 大肠杆菌,铜绿假单胞苗,金黄邑葡萄球茼,链球菌, 鞘氮醇胞菌,瞻弱类杆茼和癣疮阿仵茼.其一{I摊 幢丙酸杆菌的1)A在胆亓和肌汁IfI均有榆….另 有不动杆曲黄杆菌等临床少岫条件致病随,”段 柱院环境中榆驯到的细茼如 w?j川ki等川十H隔6I卜.r】后重新检测了原 魁细茼1)NA为性的结石.结果发现阳件率{Ill着 下降,细菌DNA序列的种类和数量发生变化:并 志2004年11月第24卷第11期ChinjDig,Nov.!.. 认为这是因结石中的细菌DNA发生降解以及不同 细菌降解速度不同所致.揭示结石中检测出的细菌 DNA是细菌不断沉积的结果,而且较结石形成初期 的细菌谱发生巨大变化.然而Swidsinski等未研究 细菌在胆石中的分布情况.本实验将胆石剖为核心 和外周部分,分别检测细菌DNA和菌落数,发现两 者差异无显着性.提示细菌在结石中的沉积是均匀 的,胆石核心所代表的早期细菌DNA并不降解,也 不影响检测.另外,体外的降解实验可能不能代表 体内的情况.本研究中术前使用抗生素可使胆汁中 菌落数明显减少,但是对胆囊黏膜,胆石的核心部分 及外周的菌落数不产生影响.这可能与胆道中的细 菌具有一定的自我保护机制有关.目前已发现胆石 中的沙门菌能产生生物膜覆盖在结石表面抵御胆汁 和抗生素的破坏,而且能粘附在膜上并借此与其他 细菌连接』.另有报道,在慢性胆囊炎合并胆囊结 石患者的胆囊中,L型细菌的比例为64%,高于常 规细菌培养的阳性率.L型细菌是变异的细菌壁缺 陷型细菌,致病力不强,抗原性较弱,在机体中可逃 避免疫系统的攻击,又因其对抗生素不敏感,可在胆 汁中长期生存,在某些情况下又可以转变为细菌型 而致病j.细菌的自我保护功能与胆道感染以及 结石的关系值得关注. 三,细菌DNA序列分析 通过细菌DNA的序列测定,发现DNA阳性标 本均为混合感染,但是尚不能从细菌的种类比较上 发现与结石关系最密切的细菌.本组发现的大肠杆 菌,铜绿假单胞菌,芽胞杆菌,金黄色葡萄球菌,痤疮 丙酸杆菌等与文献报道结果一致_】.j.本组发现痤 疮丙酸杆菌不仅在胆固醇结石中检出,而且在胆汁 中亦存在,其在胆固醇结石形成中的地位值得关注. 肺炎克雷伯菌是胆汁细菌培养最多见的菌种之 一 ,但是本实验和文献中用PCR方法在非急性 胆囊炎患者的标本中均未测出其DNA序列,提示 该菌在胆道中主要与急性炎症相关,符合”致石菌种 与引起感染的菌种不完全相同”的观点l1.幽门螺 杆菌是近年来受到瞩目的另一种细菌,通常不能在 胆汁环境中生长.有人认为在胆汁pH环境改变情 况下或细菌为耐胆汁酸盐菌株时,细菌可能在胆道 寄居.然而其与结石的关系文献中存在不同观 点[11.本组用细菌16SrRNA通用引物,未测出 耐胆汁酸盐菌株序列,与Swidsinski等l1j和Lee 等的结果一致,可能与该菌在胆囊中数量过低或 未用特异性引物有关.本实验发现有较多临床少见 的条件致病菌或医院环境的污染菌,如不动杆菌,鞘 氨醇单胞菌,阿菲波菌,其在胆固醇结石形成中的作 用值得关注. 胆固醇结石中细菌DNA的发现更新了我们对 细菌与胆固醇结石关系的认识,但是尚不足以肯定 细菌参与胆固醇结石的形成.本研究证实胆固醇结 石中的细菌与胆汁和胆石中细菌意义不同,因此有 必要进一步比较胆固醇结石患者与非胆石症患者胆 道细菌感染的差异,并对细菌与胆汁热力学,动力学 的关系进行探讨. 参考文献 1SwidsinskiA,LudwingW,PahligH,eta1.Moleculargeneticevi— denceofbacterialcolonizationofcholesterolgallstones.Gastroen. terology,1995,108:860—864. 2LeeDK,TarrPI.HaighWG.etalBacterialDNAinmixed cholesterolgallstonesAmjGastroentero1.1999,94:35023506. 3伍晓汀,肖路加,黎介寿,等.由胆固醇结石提取DNA进行套式 聚合酶链反应的研究.中华外科杂志,1997,35:663—666 4SwidsinskiA,KhilkinM,PahligH,eta1.Timedependent changesintheconcentrationandtypeofbacterialsequencesfound incholesterolgallstones,Hepatology,1998,27:662—665 5KawaiM,1wahashiM,UchiyamaK,etalGram—positivecocci areassociatedwiththeformationofcompletelypurecholesterol stones.AmJOastroenterol,2002,97:83—88. 6ProutyAM.SchwesingerWH.GunnjsBiofilmformationand interactionwiththesurfacesofgallstonesbySalmonellasppInfect Immun,2002,70:2640.2649, 7韩文胜,石景森,卓健生,等.检测胆囊结石胆汁中L型细菌的 研究及其意义.中华实验外科杂志,2001,18:207208 8黄美雄,朱明炜,宋京海,等.胆道感染细菌的变迁及细菌对抗 生素敏感性分析.中华肝胆外科杂志,2001.7:272.274 9朱雷明,陈为欢,蔡端,等T管胆汁细菌培养及抗生素敏感性 分析.外科理论与实践,2003,8:124.126,132 l0WetterLA,HamadehRM.GriffissJM.eta1.Differencesinouter membranecharacteristicsbetweengallstoneassociatedbacteriaand normalbacterialflora.Lancet,1994.343:444.448 11MonsteinI-tl,JonssonY,ZdolsekJ,etalIdentificationofHeli. cobaeterpyloriDNAinhumancholesterolgallstones.ScandJGas— troentero1.2002.37:ll2一ll9 12MyungSJ,KimMH.ShimKN.eta1.DetectionofHelicobacter pyloriDNAinhumanbiliarytreeanditsassociationwithhepa— tolithiasisDigDisSci,2000,45:14051412 (收稿日期:2003—0611) (本文编辑:杨学文)