温郁金中新二萜类化合物C诱导人结肠腺癌SW620细胞凋亡的相关通路研究（可编辑）

温郁金中新二萜类化合物C诱导人结肠腺癌SW620细胞凋亡的相关通路研究（可编辑） 温郁金中新二萜类化合物C诱导人结肠腺癌SW620细胞 凋亡的相关通路研究 ?? 396?? 中国药理学通报 ChinesePharmacologicalBulletin 2011Mar;27 3 :396,401 温郁金中新二萜类化合物C诱导人结肠腺癌 SW620 细胞凋亡的相关通路研究 沈 雁 ，吕 宾 ，张 烁 ，马忠俊 1(浙江中医药大学附属第一医院消化内科，浙江杭州 310006;2(浙江大学药学院现代中药研究所，浙江杭州 310058 中国图书分类号:R284(1;R329(25;R735(350(22;R979(1 生长并诱导凋亡，其作用机制可能与抑制MAPK信号转导通 路、活化 caspase一3有关。 文献标识码:A 文章编号:1001―1978 2011 03―0396―06 摘要:目的 探讨温郁金二萜类化合物 C诱导人结肠腺癌 关键词:结肠腺癌;温郁金;二萜类;增殖;凋亡;MAPK; SW620细胞凋亡的作用机制。 以5一氟脲嘧啶 5-Flu― caspase一3 orouracil，5-FU 为阳性对照药物;采用噻唑蓝 methylthia― zolyltetrazolium，Mrrr 还原法检测化合物 C和 5一Fu对 SW620细胞增殖的影响;用流式细胞术 flowcytometry， 结肠癌是消化系统常见的恶性肿瘤，在世界范 FCM 检测两种药物诱导细胞凋亡的情况;用 Westernblot法 围内，其发病率和死亡率呈逐年上升趋势?I2j。鉴 检测化合物C作用后，细胞中ERK、P―ERK、JNK、P―JNK、p38、 于其早期诊断策略尚不成熟，以及放化疗毒副作用 p-p38及caspase一3蛋白水平的变化。结果 化合物 C能抑 所造成的临床应用限制，因此研发传统中药材中潜 制SW620细胞的增殖活性，并明显诱导细胞凋亡，其抑制率 在高效的抗癌活性成分不失为对抗结肠癌的一个新 和凋亡率呈时间 一浓度依赖性，且都明显高于5-FU组;其 选择。 24、48和 72h的 IC 分别为29(75、15(91和6(55mg??L,; 温郁金是姜科姜黄属植物温郁金 Curcumawe( 化合物C能浓度依赖性地下调细胞中ERK、JNK、p38及其相 nyujinY(H(ChenetC(Ling的干燥块根。研究明， caspase一3的蛋白表达。结论 应磷酸化蛋白的水平，并刺激 它具有降脂、护肝、抗肿瘤、抗辐射等广泛的药理活 温郁金二萜类化合物C能抑制人结肠腺癌SW620细胞的 性 J。近年来，温郁金的抗肿瘤效应日益受到关 收稿日期:2010―11―04，修回日期:2010―12―27 注:研究发现其多种提取液在体内外均能抑制胃癌 基金项目:浙江省中医药普通课题研究计划 No2009CB014 的形成和发展;其醇提物中的姜黄素和其醚提物中 作者简介:沈 雁 1985一 ，女，硕士生，研究方向:中西医结合消化 的榄香烯已被证实为显效的抗癌成分。在此基础 系统疾病，E-mail:shendanxi61115@163(tom; 上，笔者进一步从其醚提物中分离得到另一种全新 吕 宾 1963一 ，男，教授，主任医师，博士生导师，研究 的二萜类化合物c。本实验拟观察该化合物C对人 方向:中西医结合消化系统疾病，通讯作者，E-mail:lvbin @ medmai1_com cn 结肠腺癌SW620细胞增殖、凋亡的影响及相关信号 significantlyinhibitedLPS--induced activationofmicro-- neurotoxicitybymeasuringthe[H]DAuptakeand counting ofTH―immunoreactive cells(Microglia were gliaand production ofTNF一仅(NO and superoxide in ratmesencephalic neuron--glia culturesand microglia-?? visualizedbystainingfortheCR3complementreceptor enriched cultures(In addition，the potency order of withmonoclonalantibody0X-42(Theproductionofni― thesefiveisoflavoneswas:pratensein daidzein caly― tricoxide NO wasdeterminedbymeasuringtheaccu― cosin formononetin ifilone(Conclusions A11five mulatedlevelofnitriteintheculturesupernatantwith theGriessreagent，and the releaseoftumornecrosis isoflavonesfromTrifoliumpratensemayprotectdopam― - factor―Ot TNF―Ot wasmeasuredwitharatTNF一 en inergicneuronsfrom LPS―induced injury andtheir effectsin inhibitingmicrogliaactivationmaybeoneof zyme??linked immunosorbentassay kit(The production themechanisms(Moreover，therankorderofprotective ofsuperoxidewasdeterminedbymeasuringthesuper― potencyofthesefiveisoflavonesis:pratensein daid― oxidedismutase SOD -inhibitablereductionofcyto― zein calycosin formononetin ifilone( chromeC(Results Allfiveisoflavonesdose―depend― entlyattenuatedLPS--induceddecreaseindopamineup-- Keywords: Trifoliumpratense;isoflavone;microglia; dopaminergicneuron;tumornecrosisfactor―OL;nitricox― take and the numberofdopaminergic neurons in rat ide;superoxide mesencephalicneuron―gliacultures(Moreover，theyalso 中国药理学通报 ChinesePharmacologicalBulletin 2011Mar;27 3 ??397?? 通路蛋白表达及活性的变化，来阐述其抗癌作用的 阴 性对照组 A一空白对照组 A ×100,。 生物学机制，为寻找有效的结肠癌治疗药物提供理 1(4 FCM检测细胞凋亡情况 细胞培养并接种于 论依据。 中号培养皿中，每个培养皿6×10 ??L,，3ml，培养 1 与方法 24h后换成含化合物C的培养 、 液3ml干预，设40 55、70mg??L 3个终浓度的实验组及阴性对照组， 1(1 药物、试剂和仪器 温郁金二萜类化合物 c 由浙江大学药学院现代中药研究所分离提供 ，其 阳性对照组为相同浓度梯度的5(Fu组，每组重复3 分子量为380，分子式为C::H 0。 次。培养 l2、24、48h和72h后，用不含EDTA的胰 酶消化细胞，PBS漂 洗 2次 2000r??min,，5 min ，并用500 l的Bindingbuffer悬浮细胞，再加 入5 lAnnexinV―FITC混匀，室温、避光、反应 5, 15min后，上机检测。 1(5 Westerblot检测蛋白表达 将对数生长期细 胞 1X10个分别以0、40、55、70mg??L 化合物 C 作用48h后，用0(25,胰酶消化、PBS漂洗，再加入 5-氟脲嘧啶 5-Fluorouracil，5一FU 注射液由天 150Ixl新鲜配置的RIPA裂解液，放冰上裂解 30 津金耀氨基酸有限公司提供 批号:0910221，分子 min，4~C12000r??rain。。离心 10min，收集上清液， 量:130(08 。Leibovitz’SL一15培养基及 0(25,胰 用 Bradford法测定蛋白含量;各浓度组的蛋白均取 酶均为杭州吉诺公司产品;胎牛血清购自北美Gibco 30 g，加等体积上样 Buffer混合，IO0~C变性5min 公司;M1Tr 噻唑蓝 干粉购 自Ameresco公司;An― 后，以每孔20 l的上样体积加入 12,的分离胶和 nexinV,PI凋亡试剂盒购 自Biouniquer公司;兔抗 5,的浓缩胶中进行 SDS―PAGE电泳，之后用半干半 p38、P-p38、JNK、p-JNK、ERK、p-ERK、caspase一3及 湿转膜仪250mA电转2(5h将蛋白转移到PVDF B(actin均为CellSignaling公司产品;抗兔二抗及抗 膜上;用含 5, BSA的 TFBS 0(1, Tween一20，10 Thermo 、 鼠二抗为Jaskson公司产品。CO 培养箱 mmol??L,Tris(HC1，pH7(5，150mmol??L NaC1 生物安全操作柜 Thermo 、流式细胞仪 BD 、离心 4~C封闭过夜;分别用抗 ERK、p-ERK、JNK、p-JNK、 机 Thermo 、电泳仪 BD 、半干半湿转膜仪 BD p38MAPK、p-p38MAPK、caspase一3、B―actin的一抗 等用于本实验。 和相应二抗孵育，TrBS洗膜3次，每次 10min;最后 1(2 实验细胞系和培养条件 人结肠腺癌细胞 用增强化学发光法 ECL 检测阳性信号，显影后根 SW620 株购自中国科学院院上海细胞库，生长于 据彩色标 准电泳指示条带 marker 中的位置来分析 含10,胎牛血清的L-15培养基中，置37,、体积分 各电泳条带的性质。 数为5,的CO 培养箱中常规培养。实验时取对数 1(6 统计学分析 数据用 SPSS17(0统计软件包 生长期细胞。 分析，结果用 ?s表示，两组间均数比较用t检验， 1(3 噻唑蓝还原法 MTT法 检测细胞增殖抑制 多组间均数比较采用单因素方差分析，组间两两比 情况 细胞传代并接种于 96孔培养板中，每孔 较采用 Least―SignificantDifference LSD 法。 结果 10000个细胞，200 l，孵育24h后吸弃上清液，每 2 孔加入含化合物c的L一15培养液200 l，使终浓度 2(1 MTT测定结果 二萜类化合物 C及 5一Fu在 分别为1O、20、40和70mg??L,;设阴性对照组 仅 10、20、40和70mg??L 的终浓度时对SW620细胞 培养液干预 和空白对照组 不含细胞的血清培养 的增殖均呈时间一浓度依赖性的抑制作用 Fig1 ; 基 ，阳性对照组每:fUJI入含5(Fu的培养液200 l， 化合物c作用24、48和72h后的半数有效抑制浓 使其终浓度同化合物 C 每个剂量设 3个重复孔 。 度 Ic5o 分别为29(75、15(91和6(55mg??L,;各 、48和72h，实验终止前4h添加5g?? 时间段、各浓度的化合继续孵育24 物C对SW620的抑制率均较 L 的 MTY液20 l后再培养4h，弃上清并加入 同时间、同浓度的5一氟脲嘧啶为高 P 0(01 。 DMSO150Ixl，上微量振荡器振荡 10min，立刻用酶 2(2 FCM测定结果 两种药物均能不同程度地诱 标仪测定吸光度值 A ，检测波长为570nm。计算 导SW620细胞发生凋亡，其中化合物C的促凋亡效 细胞生长抑制率。抑制率,, [ 阴性对照组A一 应呈明显的时间 一浓度依赖性 Fig2 ;作用 12h， 空白对照组 A 一 实验组 A一空白对照组 A ], 40和55mg??L 化合物C组与同浓度5(Fu组的凋 ?? 398?? 中国药理学通报 ChinesePharmacologicalBulletin 2011Mar;27 3 O 5 9 勰 吣 加 ? ? 土 ? O O O ? Control 3(17?0(285 4(01?0(721 9(04?0(842 8(63士O(551?? 911?O(565?? 4472?1(461?? 40 ( ( ?m? ? ? ? ? 17(94?1(010A? 4430?1(855?? 5653?1(881?? 55 ( ( 35(89?1(235?? 6338?0(245?? 8276?1(981?? 70 ( ( 0 " ? ? ? ? ? ? 0 0 0 O 5嚣 9 0 1粥 ? ? ? ? ? ? 亡率问比较，差异无统计学意义;此外各时间段、各 SW620细胞的增殖，并诱导凋亡，从而逆转癌细胞 十 + c的促凋亡作用均强于5-Fu Tab 本身存在的生长失控、浓度时，化合物 凋亡失能特性，表现出高效的 4 叭 叭 控 盼 ? ? ? 士 ? 1，P 0(01 。 抗癌活性，且其对结肠腺癌细胞的毒性作用明显高 0 1 O 1 2(3 Western1陀bl7ot检测1‘结果 与阴性对照组相比， 于临床上常用的化疗药物5(Fu。 ? ? ? ? ? ? 十 化合物c干预组的ERK、JNK及p38MAPK的表达 丝裂原活化的蛋白激酶 mitogen(activatedpro― 十 水平均受到抑制;而三者相应的磷酸化水平，即P― teinkinase，MAPK 通路是细胞信号转导网络中的重 ? 踞 加 ? ? + 一 ? ERK、p-JNK和 p-p38的表达则受到更为明显的抑 要成员之一，它能通过高度保守的“瀑布样”磷酸化 0 1 2 O 制;相反，caspase3的蛋白量则呈上调趋势 Fig3，P 级联反应将细胞外刺激与细胞内基因表达和胞质功 粥 ? ? ? ? ? ? $ 能活动连接起来，参与细胞的增殖、分化、运动、凋亡 0(01 。上述蛋白的抑制,活化效应均表现出剂 十 O 4 1 8 量依赖性的特点。 等多种生命活动。目前在哺乳动物细胞中鉴定出了 ? ? 土 ? 士 ? 3 讨论 O O O O 3条主要的亚通路，即细胞外信号调节蛋白激酶 0 5 8 ，O ? 结肠癌的发生发展是一个多基因参与、涉及多 extracellular―signalregulatedkinase，ERK 通路、C- ? ? ? ? ? ? 阶段演变的复杂过程。在外界致癌信号的过度刺激 Jun氨基末端激酶 c―JunN―terminalkinase，JNK ,应 下，相关转导通路中关键效应子发生异常的激活,失 激活化蛋 白激酶 stressactivatedproteinkinase， 活，引起下游原癌基因和抑癌基因的表达失衡，进而 SAPK 通路和p38丝裂原活化蛋白激酶 p38mito― 导致肠上皮细胞表型的转变。癌转的细胞能逃避生 gen-activatedproteinkinase，p38MAPK 通路，已被证 理性凋亡点的监控而达到永生化，同时还获得对周 实在包括结肠癌在内的多种消化系肿瘤中存在异常 围组织、器官的高侵袭力。因此，诱导肿瘤细胞凋亡 表达或活化，提示其与肿瘤的发生发展问存在密切 将是治疗结肠癌的一条积极有效的途径 J。 联系 HJ。其中ERK通路主要接受有丝分裂原的 温郁金是临床常用的传统中药材，目前国内外 刺激，活化后能促进细胞增殖、分化、骨架重构等，与 肿瘤细胞的恶性生物学行为问关系密切 15];JNK和 对其有效成分的研究主要集中于姜黄素和榄香烯， 并已证实这两种成分具有良好的抗癌活性 J。我 p38通路则主要接受各种应激和病理性损伤信号， 们的前期研究结果显示，_9一 温郁金的水提物、醚 有时也可被有丝分裂原所活化，产生的效应在很大 提物和醇提物在体内外均能抑制人胃癌 SGC一7901 程度上取决于信号 类型和 或 自身亚型的不同，可 细胞增殖，且后两者尚具有良好的凋亡诱导效应，其 以表现为促进凋亡或抵抗、修复损伤这两种截然相 反的结果 16]。Caspase(3是凋亡经典通路的下游蛋 作用机制可能与下调血管内皮生长因子 vascular endothelialgrowthfactor，VEGF 、环氧合酶一2 cyclox― 白元件，被 活化后则成为最关键的凋亡执行者，能促 ygenase(2，COX一2 的水平以减少瘤灶内微血管密度 进绝大多数凋亡事件的开启 。我们的实验结果 microvesseldensity，MVD 、提高血浆和组织中生长 显示，化合物C能浓度依赖性地抑制 ERK、JNK和 抑素 somatostatin，SS 的表达、抑制胰岛素样生长因 p38的水平，而对三者磷酸化的抑制程度更为显著; 子 insulin―likegrowthfactor，IGF I和?的分泌等 相反，它能明显诱导活性caspase一3的蛋白表达。推 有关。为深入了解并开发温郁金中潜在的其他抗癌 测化合物C可通过下调ERK通路介导的分裂生存 活性成分，我们成功地从其醚提物中提取出一种新 效应、抑制 JNK,p38通路介导的细胞保护效应，同 型二萜类化合物 c，其化学结构和性质都有别于姜 时传递活化信号至凋亡效应子caspase一3，进而诱导 黄素和榄香烯。通过本次实验发现，该化合物 c能 人结肠腺癌 SW620细胞发生凋亡。 以时间 一浓度依赖性的方式抑制人结肠腺癌 综上所述，温郁金醚提物中的二萜类化合物C 中国药理学通报 ChinesePharmacologicalBulletin 2011Mar;27 3 ??401?? liferation and apoptosis of human colon adenocarcinoma cells ofinsulin-likegrowthfactor I，insulin-likegrowthfactorlIand SW620 [J](ChinPharmacolBull，2008，24 6 :782― 7( vascularendothelialgrowthfactor[J](WorldCh inJDigestol， [6] LiX，WangG，ZhaoJ，eta1(Antiproliferativeeffectofbeta―elemene 12 11 :2761―3( 2004， inchemoresistantovarian carcinomacellsismediated throughat- [12]WangW，WangX，PengL，eta1(CD24-dependentMAPKpathway restofthecellcycleattheG2-Mphase[J](CellMolLifeSci， activationisrequiredforcolorectalcancercellproliferation[J]( 2005，62:894―904( CancerSci，2010，101 1 :112―9( [7] XieCY，rangW，LiM，eta1(Cellapoptosisinducedbydeltael- [13]GuoK，HuY，ZhouH，eta1(InvolvementofproteinkinaseCbeta( emeneincolorectaladenocacinomacellsviaamitochondria1(medi(( extracellularsignal-regulating kinase 1,2,p38 mitogen-activated proteinkinase―heatshock protein27 activation in hepatocellular atedpathway[J](YakugakuZasshi，2009，129 11 :1403―13( [8] 刘晓真，张宏颖(姜黄素与肿瘤细胞作用的分子机制[J](大连 carcinomacellmotilityandinvasion[J](CancerSci，2008，99 3 : 486―96( 医科大学学报，2008，30 5 :465―8( [8] LiuXZ，ZhangHY(Molecularmechanismofeffectofcurcuminon 【14]MishraP，SenthivinayagamS，RangasamyV，eta1(Mixedlineage kinase-3,JNK1axispromotesmigrationofhumangastriccancer tumor[J](JDalianMedUniv，2008，30 5 :465―8( [9] 俞林峰，吕 宾，徐 磊，等(温郁金对饮用 MNNG大鼠胃黏膜 cellsfollowinggastrinstimulation[J](MolEndocrinol，2010，24 血管内皮生长因子和环氧合酶_2表达的影响[J](胃肠病 学， 3 :598―607( 2007，12 3 :140―3( [15]周四桂，袁 茜，潘雪刁，等(ERK1,2和p38MAPK介导 BAP― [9] YuLF，LnB，xuL，eta1(Effectsofcurcumaeonexpressionsof TA-AM抑制 RANKL诱导小鼠骨髓巨噬细胞分化的机制研究 vascularendothelialgrowthfactorandcyclooxygenase-2ingastric [J](中国药理学通报，2010，26 9 :1146―50( mucosaofratsfedwithMNNG[J](ChinJGastroenterol，2007，12 [15]ZhouSG，YuanX，PanXD，eta1(ERK1,2andp38MAPKmedi― atetheeffectofBAPTA―-AM inhibitingRANKL--inducedbonemar-- 3 :140―3( rowmacrophagesdifferentiation[J](ChinPharmacolBull，2010， [10]徐 毅，吕 宾，项柏康，等(温郁金对鼠血浆和胃组织生长抑 26 9 :1146―50( 素水平的影响[J](中国中西医结合消化杂志，2004，12 4 : 222―4( [16]文 军，徐 明(p38MAPK激酶抑制剂增强二烯丙基二硫化 [10]xuY，? B，XiangBK，eta1(Effectofextractofradixcurcumae 物诱导 CNE2细胞凋亡[J](中国药理学通报，2003，19 4 : 418―23( onsomatostatininplasmandgastrictissue[J](ChinJlntegrTrad WestMedDig，2004，12 4 :222―4， [16]WenJ，XuM(Inhibitionofp38MAPKkinaseenhancesdiallyldi― [11]何必立，吕 宾，徐 毅(温郁金对胃癌细胞 的抑制作用及其 sulfide-inducedapoptosisinhumanCNE2cells[J](ChinPharma― 2003，19 4 :418―23( colBull， 对 IGF―I、1GF-H表达的影响[J](世界华人消化杂志，2004， 12 11 :2761― 3( [17]MouratidisPX， ColstonKW，DalgleishAG(Doxycyclineinduces [11]HeBL，L?B，xuY(Inhibitionofcommonturmericonhumangas― caspase-dependentapoptosisinhumanpancreaticcancercells[J]( tilecaicinomacelllineSGC(7901anditseffectontheexpression ,ntJCancer，2007，120 4 :743―52( ApoptosisofhumancolonadenocarcinomacelllineSW620inducedby ( diterpenoidC from RadixCurcumaeanditsrelatedpathways SHENYan，LCBin，ZHANGShuo， jun MAZhong- 1(DeptofGastroenterology，the sAffiliatedHospitalofZhefiangChineseMedicalUniversity，Hangzhou 310006，China; 2(CollegeofPharmacy，ZhejiangUniversity，Hangzhou 310058，China Abstract:Aim Tostudy the apoptotic effectofthe cil(Themedianinhibitoryconcentration IC5o at24， newdlterpenoidCfrom RadixCurcumaeonhumanCO― 48，and72hwere28(31，15(58，and6(14mg??L, ， Ion adenovarcinama SW620 cells and its underlying respectively(Theexpression levelofERK，JNK，p38 mechanisms(Methods TheeffectofditerpenoidC on and theircorresponding phosphorylation productswas cellproliferationwasassessedbyMTI"assay，thecell reducedbyditerpenoidCinadose??dependentmanner， apoptosisinducedbyditerpenoid C wasdeterminedby whilethelevelofcaspase一3wasincreased(Conclusion flow cytometry，and the expression levelofERK，P- Diterpenoid C inhibitsproliferation andinducesap- ERK，JNK，p-JNK，p38MAPK，p-p38MAPK，caspase一 optosisofSW620 cellsbysuppressingMAPK signaling 3wasdetected by Western blotanalysis(Results 3( pathwayandinducingapoptoticfactorcaspase- Diterpenoid C inhibitedthecellproliferationandin― Key words:colon adenovarcinama;Radix Curcumae; ducedapoptosisindose-andtime-dependentmanners， diterpenoids;proliferation;apoptosis;MAPK;caspase-3 which wassignificantly more potentthan 5-Fluoroura-