玉米赤酶烯酮引起HEK293细胞DNA链断裂的溶酶体途径（可编辑）

玉米赤酶烯酮引起HEK293细胞DNA链断裂的溶酶体途径（可编辑） 玉米赤酶烯酮引起HEK293细胞DNA链断裂的溶酶体途 径 玉米赤酶烯酮引起.细胞链断裂 的溶酶体途径 高风 计:学位论文: 页 表 格: 个 插 图: 幅 指导教师:刘晓芳 副教授 申请学位级别:硕士学位 专业名称:劳动卫掣?障耻学 论文提交日期: 年月 论文答辩日期: 年月 学位授予单位:大连医科大学 学位授予日期:年月 评阅人: 答辩委员会主席:? 为获得大连医科大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的。 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名: ;邑氢 签字期: 丝 年』月且日,】目 录 一、摘要 一中文摘要? 二英文摘要? 二、正文 一前言一刖吾””””””?”?一””一”””””一””一””一”””“””一“’ 二材料与方法? 三结果? 四讨论五结论六参考文献 三、文献综述一综述二参考文献 四、致谢一?玉米赤酶烯酮引起.细胞链断裂 的溶酶体途径 硕士生姓名:高凤 指导教师:刘晓芳副教授 专业名称:劳动卫生与环境卫生学 摘 要 前言:玉米赤酶烯酮,是一种非类固醇类但具有雌激素样 活性的真菌毒素,主要由镰刀菌属真菌产生。广泛的存在于发霉的玉米、小 麦、 大麦等粮谷类农作物及其食品中,污染率较高,是世界范围内粮食饲料的污 染物 之一,对人畜构成很大的危害。 国际癌症研究机构 ,将 对人类的致癌性归为第三类,即现有证据尚不能就其对人类致癌性进行分 类。研 究表明,具有致癌性、生殖毒性、遗传毒性、免疫毒性和致突变性。此外, 有研究显示的遗传毒性与细胞中活性氧类的生成增多有关。最近的 一些研究发现,溶酶体膜稳定性改变和线粒体膜电位的改变与的损伤有关。 因此,我们研究了引起的损伤与细胞内水平以及溶酶体和线粒体 的关系,旨在探讨遗传毒性的机制。 本研究选用人肝肾.细胞,探讨玉米赤酶烯酮的损害作用及可 能的机制,为进一步评估对人类的健康危害提供实验资料。 方法:以细胞作为试验系统。通过单细胞凝胶电泳试验 检测细胞的损伤情况,评价的遗传毒性。为探讨其可能的遗传毒性机 制,以’,’?二氢二氯荧光素法测定细胞内的水平,用吖啶橙 和罗丹明 分别测定细胞内溶酶体膜稳定性 和线粒体膜电位的改变水平;分别采用羟基酪醇,氯化铵,抑胃肽 ,地昔帕明干预所致的损伤。实验结果用 .统计软件包进行统计。 后,引起细胞内溶酶体膜 结果:.的作用于细胞 稳定性发生改变;作用 后,可引起细胞内线粒体膜电位下降、水平增加、 链断裂,细胞形成彗星样拖尾,其尾长明显增长,且呈剂量依赖关系。分别 用 的、 肛的 和的预处理 细胞 后,引起的链断裂几乎完全被阻止。但用. 的预处理后,所引起的细胞 溶酶体膜稳定性和链断裂没有得到 明显的改善。溶酶体在酸性环境下容易发生破裂,用的预处理提高 它的值后,细胞内溶酶体膜的稳定性及线粒体膜电位都得到了很好的保护。 结论:玉米赤酶烯酮可致.细胞链断裂,其作用机制可能与溶 酶体途径有关,通过溶酶体膜稳定性的破坏,释放一些溶酶体水解酶,从而导 致 链断裂。作为一种有效的抗氧化剂,未能降低对细胞所致 的链断裂,说明所引起的损伤可能不是氧化性的损伤,而是通过 溶酶体途径引起的。溶酶体可能是细胞毒性的生物靶点之一,是遗传毒性的 早期事件。 关键词:玉米赤酶烯酮链断裂溶酶体膜稳定性线粒体膜电位 ? 习 . : : ? : :叼 . ,, ,. . , ‘ ”. ,, , , .., ? ., . . . :一.. ,? ; .饵,,, .. .. : .,, , 岣 ; 廿 . . 嘶 , . .,..岣.. 谢,. : , . ., ? . . ,. :.玉米赤酶烯酮引起.细胞链断裂 的溶酶体途径 硕士生姓名:高凤 指导教师:刘晓芳副教授 专业名称:劳动卫生与环境卫生学 ?上一 刖 舌 玉米赤酶烯酮,,又名.毒素,主要由禾谷镰刀菌、黄 色镰刀菌、木贼镰刀菌等镰刀菌属真菌产生【,是一类结构相似的二羟基苯酸内酯 化合物。广泛存在于霉变的玉米、高粱、小麦等谷类作物中,在奶类、肉类 和蛋类也被检出,污染率较高。研究表明,它具有很强的致畸作用和生殖毒性, 导致生长下降,繁殖障碍,免疫抑制,给畜牧业带来巨大的经济损失。进 入人体,还能诱发肿瘤等毒害现象,给人类健康也造成极大的害。 年,国际癌症研究机构 触屺将对人类的致癌性归为第三类,即现有证据尚不能就其对人类致癌性 进行分类】。国内外大量文献证明,玉米赤霉烯酮除了对繁殖机能造成影响外,还 具有肝毒性、肾毒性、免疫毒性、细胞毒性和遗传毒性,且对肿瘤的发生也有一 定的影响。 玉米赤霉烯酮中毒症状分为急性中毒和慢性中毒。在急性中毒的条件下,对 神经系统、心脏、肾脏、肝和肺都会有一定的毒害作用。而在慢性中毒时,主要对 母畜的毒害较大。因玉米赤酶烯酮具有类雌激素样作用,可表现出生殖系统毒性 作用。可对雌性动物的生殖系统造成毒害,导致动物的生产性能下降,并通 过胎盘的吸收从母体传给胎儿,损害幼体的健康甚至造成流产。’等人研究 发现,在动物怀孕期间,给予大量的能降低胚胎的存活率及新生胎儿的出生 体重【刁。在小鼠、大鼠、猪和家兔中,喂养后它们的肾上腺、甲状腺和垂体腺 的重量发生了改变,且血清中孕酮和雌二醇的水平也发生了变化。近来许多研 究表明,与内源性雌激素在结构上相似,和它的一些代谢产物能与体内或 和 者体外系统的一些雌二醇受体 竞争性地结合【。在垂体细胞系中, 通过.的亲和力与雌二醇受体 .雌二醇结合,并诱导泌乳素的分泌【。 还具有免疫毒性,等研究发现将老鼠按/体重的剂量喂食 ,结果显示老鼠的胆固醇、总蛋白、白蛋白、甘油三酯、白细胞数量、免疫 。 球蛋白与和淋巴细胞的数量明显降低了已被报道具有遗传毒性,体外研究结果表明,可致细胞链 断裂【瑚,微核率增加并引起染色体畸变,且有明显的剂量依赖关系【。另外, 的作用于细胞,引起了脂质过氧化产物丙二醛的 产生,且呈剂量依赖关系。可能是细胞膜上的多聚不饱和脂肪酸通过自由基 和 的攻击发生脂质过氧化,导致细胞内以为代表的脂质过氧化物的增多,损 伤了八从而可能诱发癌症的发生。等研究发现,使细胞内活性氧类 生成增多,细胞内抗氧化物质减少,氧化性代谢产物增加,细胞处 于氧化应激状态,造成细胞氧化性损伤,产生遗传毒性【】。还能 够抑制蛋白质、和的合成,改变细胞膜结构,诱导细胞程序性死亡。 还能够损害细菌的修复、诱导细胞核病变和基因改变,引起仓鼠卵巢的染色 体 畸变和增加人外周淋巴细胞姐妹染色单体交换率,在小鼠肾、肝中形成加合 物【。 有研究发现,溶酶体膜稳定性和线粒体膜电位的改变与损伤有关【】。 因此,在本研究中,我们使用人豚肾细胞研究所引起的链断 裂与溶酶体膜稳定性和线粒体膜电位之间的关系,探讨的遗传毒性及其可能 的机制,旨在为评价对人类健康的潜在危害提供实验依据。 材料和方法 .主要药品与试剂 购自德国公司,纯度/%。以溶解,贮存 液浓度为 ,.保存。’,’?二氢二氯荧光素、、溴化 乙啶、吖啶橙、罗丹明 、抑胃肽 和地昔帕明均购自美国公司;正常熔点琼脂糖、 低熔点琼脂糖购自英国 公司;羟基酪醇, 购自日本试剂公司;培养基,胎牛血清为美国产品;其 他试剂均为分析纯。 .主要仪器 培养箱美国公司;型酶标仪美国.公司; .型冷冻高速离心机日本公司;型超速离心机美国 公司;.型荧光分光光度计日本公司;型倒 置显微镜和型荧光显微镜日本公司;型电子天平、 型电子分析天平上海精密科学仪器有限公司;型水平式电泳仪大连捷 迈公司。 取对数生长期细胞用于试验。 .单细胞凝胶电泳试验 ..细胞处理 、、 对数期生长的.细胞用胰酶消化收获,加入浓度分别为.、 和 ,用台盼蓝染色检测 的,同时设空白对照组,?悬浮分别培养 细胞存活率为%以上, 检测细胞无凋亡现象发生。离心去上清,用 磷酸盐缓冲液洗涤细胞两次,重悬于,最后将细胞调至/。 ..电泳 试验参照方法【,稍加改动。所有的载玻片,磨玻璃片,盖玻 片均事先在%的酒精中浸泡 ,使用前擦干备用。第一层凝胶制备:在预热 。 的磨砂载玻片上铺熔融的.% ,盖上盖玻片,?冰箱放置 第二层凝胶制备:按:的比例取细胞悬液与%在?下混匀,取出第一 层凝胶片,轻轻揭去盖玻片,迅速将上述混合液“滴加在第一层凝胶上,盖上 盖玻片, ?冰箱放置 。裂解:移去胶片上的盖玻片,将载玻片水平浸入 / / , / , 新鲜配制的细胞裂解液含. , 。解旋:裂解后 %.和%,中,?冰箱放置 用少量碱性电泳液洗去玻片表面残留的裂解液,置于水平电泳槽阳极端,电 泳槽 /, 中加入新鲜配制的碱性电泳缓冲液 /,肛, 液面高度位于载玻片上方约.,放置 解螺旋。电泳:在电压,电 / 流强度下,电泳 。电泳后小心地将玻片转移至中性缓冲液. . .缓冲液浸洗次,每次,略干后滴加 ,/溴化乙啶 后观察结果。 染液?,盖上盖玻片, 在干预试验中,用浓度为.、的羟基酪醇、的抑胃肽、 的地昔帕明和的对预处理组细胞?孵育 ,然后将细胞暴露于 。按试验方法检测链断裂。 的,?作用 ..结果观察及评价 在激发波长 发射波长的荧光显微镜下阅片。每个样本随机选 择个细胞进行分析。图象直接输入计算机,保存为谢文件。利用 ..版 ,软件测定彗星样细 % 胞尾部的% %、尾长 、尾距 × 。 .细胞内活性氧类测定 参考文献方法,采用荧光探针测定作用于细胞 后产生的细胞内水平。实验原理是根据是非极性化合物,能迅速 扩散到细胞内,随后细胞内的酯酶将其水解为非荧光的二氯荧光素,在 存在的情况下,被氧化生成有荧光的,发出绿色荧光,其强度与 细胞内活性氧水平成七。实验步骤:取对数期生长的细胞,用胰酶消化收获, 向恤的细胞悬浮液中加入.、、、的,同时设空白对照 组,?下作用 和。用漂洗三次,离心收集细胞,加“., ?避光作用 后,将细胞和上清液一起用荧光比色计测定荧光强度,激发 波长,发射波长衄,狭缝。 .细胞内溶酶体膜稳定性的测定 参考文献方法略加改进。是一种趋溶酶体碱性及异染性荧光染料。根 据荧光染料重分布来检测.细胞溶酶体膜稳定性。取对数期生长的细 胞,用胰酶消化收获,离心、收集细胞,将细胞数调整至 /,再次离心后 。 分别加入浓度为.、、、的,同时设空白对照组,?作用 离心去上清,用洗涤细胞两次,然后将细胞悬浮液转移到一次性管里, 再次离心去上清后,向各管里加入终浓度为./的并混匀,避 光作用 。用洗涤细胞两次,以去除温育液中荧光染料,最后用叫的 混匀,用荧光比色计测定细胞悬液中重分布,激发波长 ,发射波 长 ,狭缝。 在干预试验中,用浓度为.的羟基酪醇和的分别对 预处理组细胞?孵育 。按 ,然后将细胞暴露于上的,?作用 上述试验方法检测溶酶体膜的稳定性。 .细胞内线粒体膜电位的测定 参考文献.,线粒体膜电位的测定是通过对照组与处理组细胞的线粒体摄 取罗丹明的差别来确定,表达为荧光强度单位。取对数期生长的细 胞,用胰酶消化收获,离心、收集细胞,将细胞数调整至/,再次离心后 分别加入浓度为.、、、的,同时设空白对照组,?作用 和 。离心去上清,用洗涤细胞两次,然后向各试管里加入终浓度为. / 罗丹明并混匀,?水浴振摇温育。离心去掉细胞,取上清用荧光比色 计测定培养液中罗丹明浓度,激发波长 ,发射波长 ,狭缝。 结果以细胞吸收的罗丹明的荧光浓度表示。 ,然后将细 在干预试验中,用的对预处理组细胞孵育 。按上述试验方法检测细胞内线粒体膜电位。 胞暴露于的,作用 .统计方法 统计分析用 .版本完成,数据以均值士标准差表示,各组间均数比较 采用单因素方差分析,两组均数比较采用检验,显著性水准为.和.。 结 果 .诱发细胞链断裂 采用试验检测细胞为链断裂。为了避免试验中细胞凋亡或坏死所造 成的假阳性,我们采用 染色法观察细胞的凋亡;台盼蓝染色法观察 细胞的坏死。所有处理组及对照组都未见凋亡细胞,细胞存活率为%以上, 可以排除试验中观察到的彗星样细胞是凋亡或坏死细胞的可能数据未列出。 在试验中,.的与细胞接触后,在荧光显微镜下, 经染色的细胞,呈橘红色,未断裂的只有一个完整的头部,断裂的 所示, 形成拖尾.。与接触,细胞呈现彗星样细胞,如 随着染毒剂量的增大,拖尾现象逐渐增加,细胞彗星样尾长,尾 %,尾距均明显大于空白对照组尸.或尸.。结果表明能诱 导细胞发生链断裂,导致损伤。 后,随着染毒剂量的 但是,当以.的与.细胞接触 增加,细胞尾长、尾%、尾距与对照组比较,未见显著性差异尸., 表明细胞未发生链断裂数据未列出。%. 雒 . :.. . .;‘.尸. .尸. ... ..,.灿,,? “, . .对细胞内溶酶体膜稳定性的影响 溶酶体的外被是一层单位膜,内部没有任何特殊的结构。因为溶酶体中含有 各种不同的水解酶类,所以溶酶体在细胞中必须是高度稳定的。溶酶体的稳 定性 与其膜的结构组成有关。是一种趋溶酶体碱性及异染性荧光染料,根据荧光 染 料重分布来检测一细胞溶酶体膜稳定性。经染色后,对 细胞内溶酶体膜稳定性的影响见.。.~“的作用于 细胞 后,细胞内的荧光强度明显增高,与对照组比较有显著性差 异.,结果表明可引起溶酶体膜损伤。 》?口一?.;口《 .. .. .士.. ,.. ’?. .对细胞内线粒体膜电位的影响 为了研究细胞内线粒体膜电位改变与溶酶体膜稳定性发生改变的时间关系, 和 我们测定了染毒 的线粒体膜电位。线粒体膜电位通过对照组与处理组 细胞的线粒体摄取罗丹明的差别来确定。经罗丹明染色可见“的作 用于.细胞后,引起细胞内线粒体膜电位水平明显降低,与对照组比较有 显著性差异尸.。但是,细胞经过染毒 后与对照组比较细胞内线粒 体膜电位水平无显著性差异.。 ? 筋 二 加 口?一 ? : 专? 口 薹薹 岛 .州 .. , . :.. .. ’. . .溶酶体的酸性结构对细胞内溶酶体膜稳定性、线粒体膜电位和 链断裂的影响 溶酶体内含有大约多种酸性水解酶,它们在酸性环境下具有比较高的活 性,可以攻击溶酶体膜。为了研究溶酶体酸性结构的作用,将细胞用 和 预处理 以提高它的值,然后紧接着将“的作用于.细胞 的时候观察细胞内 ,同时设立空白对照组和“的单独染毒组,在染毒 溶酶体膜稳定性的改变,染毒 后观察细胞内线粒体膜电位和链断裂的变化 情况。.显示,经预处理后的细胞的荧光强度明显降低了,与单 独染毒组比较有显著性差异.;罗丹明的荧光强度与单独染毒组比 较明显增加,有显著性差异.。从.可见,在预处理组, 细胞彗星样尾长,尾?妊%,尾距均明显小于单独染毒组尸.。这说明 提高溶酶体的值,可以减轻对腿细胞的溶酶体、线粒体和的损伤。壹一协口。 甚一?乏 啪 .. ., .士.. ’.. .;龋. .;. .., , 髓. ? , 掣沏血. ,士.. .;峰. ./. 。.尸. .溶酶体组织蛋白酶和酸性鞘磷脂酶对细胞链断 裂的影响 采用试验观察溶酶体组织蛋白酶和酸性鞘磷脂酶对细胞链断裂 的影响。分别用溶酶体组织蛋白酶的抑制剂抑胃肽和酸性鞘磷脂酶的抑 ,观察 制剂地昔帕预处理细胞 ,随后将细胞暴露于.的 .细胞损伤情况。 显示,该试验的两个预处理组细胞的彗星样 尾长,尾%,尾距均明显小于单独染毒组.。 .氧化损伤在引起细胞链断裂中的作用 为了探讨引起细胞链断裂的另外一种途径,我们研究了氧 化性损伤的作用。通过对细胞内水平的测定来检测对细胞的氧化性损伤作 后,细胞内水平明显增加,与对 用。~的作用于.细胞 照组比较有显著性差异.或 后,未发现细胞内的水平发 .。当、一的作用于细胞 生明显改变.。然而有效的抗氧化剂羟基酪醇未能阻止对细 胞溶酶体.和.的损伤。 州?? ? 团 ???.‰臣 . ?? ...一 托 . .. .尸. .;‘’. ..?论 讨 是世界范围内常见的粮谷污染物,污染率可高达%【,可以在哺乳 动物中产生多种毒性效应。它可以抑制、和蛋白质的合成,还可以引起 类雌激素样作用及免疫等多种毒性效应。本研究以.细胞为试验系统,应用 试验,通过体外实验观察了对一细胞的损伤并对损伤中 可能引起的途径进行了初步的探讨。 .对细胞的损伤 单细胞凝胶电泳试验是最近几年发展起来的一种检测链断裂、 碱性不稳定点、.蛋白质交联等多种损伤的灵敏且可靠的技术。断裂的 碎片在碱性条件下,从的超螺旋结构中释放出来,电泳时向阳极移动, 经荧光染色后在显微镜下观察受试细胞会产生彗星样拖尾。根据彗星样细胞 的尾 长、尾%、尾距等指标,来分析评价细胞的损伤程度。通过试验, 后,可引起细胞链断裂, 我们观察到的作用于.细胞 且呈剂量依赖关系。表明可引起.细胞的损伤。 .对细胞损伤的途径 为了探讨损伤的可能途径,我们分别对溶酶体和线粒体进行了初步的研 究。溶酶体的外被是一层单位膜,内部含有各种不同的酸性水解酶类,溶酶体 的稳定 性与其膜的结构组成有关。溶酶体膜含有各种不同酸性、高度糖基化的膜整合蛋 白,这些膜整合蛋白的功能可能是保护溶酶体膜免遭溶酶体内酸性水解酶的攻击, 有利于防止自身膜蛋白的降解。线粒体是细胞内产生能量的重要细胞器,许多因 素包括生长因子抑制剂、死亡受体介导的信号、抗癌药物等,可以使线粒体功能 受损,诱导细胞凋亡【】。研究资料表明线粒体功能受损是细胞凋亡的一种内在途 径,在凋亡的过程中起关键的作用【刀。也有研究发现溶酶体和线粒体功能失调与 的损伤有关【】。本实验通过对溶酶体膜稳定性和线粒体膜电位的测定证明了 溶酶体和线粒体是引起脏细胞损伤的生物靶点,通过不同时间 点的测定证明了溶酶体膜的损伤是一个更早期发生的事件。等发现溶酶体失 稳定性是一个早期事件,当溶酶体受到刺激后,从其体腔释放出来的溶酶体酶类 进入细胞质中,然后作用于线粒体,使线粒体膜的通透性增加可引起线粒体的氧 化物产生【】。也有研究表明自由脂肪酸能引起溶酶体损伤,然后释放溶酶体组织 蛋白酶,导致线粒体损伤和生成增多【。在本研究中,我们为溶酶体的损 伤是引起细胞链断裂的一个早期事件提供了实验室依据。 在实验结果中可以观察到,引起的溶酶体膜破坏依赖于溶酶体的酸性环 境,而链断裂除了依赖于溶酶体的酸性环境还与溶酶体组织蛋白酶和酸性鞘 磷脂酶的激活有关。尽管溶酶体通透性的改变可以诱导细胞凋亡已被证实, 但是 我们的研究数据显示溶酶体膜失稳定也可以诱发细胞链断裂。在染毒 时候,通过荧光染色法可以检测到溶酶体膜发生破裂,而线粒体膜电位的下 降 和链断裂是发生在染毒 时。通过作用的时间先后顺序说明了作用于细 胞后首先引起溶酶体膜破裂,然后释放溶酶体酶类到细胞质中,作用于线粒 体诱 发细胞链断裂。 为了研究溶酶体的酸性环境和酶类对细胞的影响,.细胞分别用弱碱 和酸性鞘磷脂酶 剂、溶酶体组织蛋白酶的抑制剂抑胃肽 的抑制剂地昔帕明对细胞进行预处理、染毒,观察损伤情况。 可以被分解成扩散至溶酶体酸性结构变成质子,使调至中性。 用 的预处理后可使溶酶体的值从.升高到以上?。通过 碱化溶酶体,溶酶体膜的损伤,线粒体膜电位的下降和的损伤都减轻了。 年发现,是一种天门 组织蛋白酶首先由和等于 冬氨酸肽链内切酶,储存于溶酶体内,是通过细胞内的路径到达溶酶体内【。它 能够在溶酶体内呈酸性的环境下分解蛋白质,当组织蛋白酶基因过度表达 时可造成溶酶体靶通道的过度负荷,导致其它溶酶体酶的释放阳。抑胃肽是一 产生的,能抑制胃蛋白酶、 种酸性蛋白酶抑制剂,由链霉菌 胃亚蛋白酶、组织蛋白酶、各种天门冬氨酸蛋白酶。在本实验中用抑胃 肽预处理细胞 ,结果显示预处理细胞 ,随后将“的作用于细胞 的链断裂明显减轻。 酸性鞘磷脂酶在小于的环境中生物活性最高,因此它主要分布在溶酶体 内,并参与细胞膜的翻转过程【】,在一定的外源刺激下能快速活化,释放到细胞表 面。氯喹和丙咪嗪是公认的酸性鞘磷脂酶活性抑制剂,它们抑制酸性鞘磷脂酶在 细胞表面形成功能簇,从而抑制其产成神经酰胺.阻止进一步发挥功邑。地昔 帕明是一种三环类的抗抑郁药,也是丙咪嗪的活性代谢物,它可以选择性的减少 酸性鞘磷脂酶的活性,从而抑制细胞链断裂】。在本实验中以地昔帕 明对细胞进行预处理,随后将的作用于细胞,结果显示预处理细胞 的链断裂明显减轻。 .氧化性损伤在诱导细胞链断裂中的作用 为了探讨诱导细胞链断裂的另外一条途径,我们研究了氧 化性损伤的作用。通过测定细胞内水平来评价对.细胞的氧化损伤 作用。是指化学性质活跃的含氧原子或原子团,包括过氧化氢、羟自由 基一、超氧化物阴离子等。当机体在受到各种有害刺激时,体内 高活性的自由基产生过多,其氧化程度超出氧化物的清除,导致水平升高, 抗氧化防御能力下降,进而攻击机体引起氧化性损伤】。本试验中当, ,细胞内的水平明显升高;暴露于 细胞暴露于.的 水平无明显变化。线粒体是产生的主要来源,有报道说,线粒体损伤可以 促进的产生。本试验中的产生可能是由于破坏了溶酶体,释放出 来的组织蛋白酶作用于线粒体,使线粒体机能异常产生,而不是作用于细 胞直接产生的。 羟基酪醇是从橄榄油中提取的一种天然的多酚类化合物,具有多种生物和药 理活性。羟基酪醇的抗氧化性和对自由基的清除能力比其它一些合成的或天 然的 化合物都要高,能够有效清除内源性和外源性自由基和氧化物】,是一种有效 的 抗氧化剂。以往的研究已证实羟基酪醇对丙烯酰胺和苏丹引起的细胞 氧化性损伤具有很强的保护作用,并呈剂量依赖关系。在本研究中,为了探 随 究致损伤的机制,我们用.~“羟基酪醇对细胞进行预处理 ,观察.细胞溶酶体膜稳定性和链断裂 后将细胞暴露于”的 情况。然而,抗氧化剂羟基酪醇并未对细胞的溶酶体膜和起到保护作用。这 一结果显示所导致的细胞链断裂不是由氧化性损伤引起,更大 的可能是通过溶酶体途径产生的损伤。 综上所述, 产生细胞毒性的最早靶器官是溶酶体,其所致的.细 胞链断裂依赖于溶酶体膜的破裂,通过溶酶体.线粒体途径对造成损害。 结 论 .试验显示,可以引起.细胞链断裂,表明对 细胞具有遗传毒性。 .使细胞内溶酶体膜破裂,细胞内线粒体膜电位下降。 .可引起细胞内生成增加,可能是由线粒体损伤而产生的。 .碱化溶酶体和应用溶酶体酶抑制剂可以预防诱发的链断裂。抗氧 化剂羟基酪醇寸诱发的损伤无保护作用。 .细胞内溶酶体膜稳定性改变是细胞毒的早期事件与遗传毒性的发生机 制有关,溶酶体可能是毒性的主要生物学靶点。 ,. .., , .;:. . , , , , . , , . ;:. .. , , : ,,,聆 . .. . ., . ,... ..’,...,..,,..., :, .. .., ?. . .,.,..,,., ....,. ..,.,.,,.,,..,. .:,...,,,,.. /.,..: ., ./ .??.,......,,..,.,,..,,.., ,..,,, .. , ,. .,.,,..,,.., . 舔 ....,. . . ., , 舡 /. ,:?. . , , , . . , .,: . . . . ,。 : , ,. ’ ., . , . , . . ....,.,., ., : , ,.. , ...,...... , , / ,?. ...,.. : ... .......,.. ,.... . ..,.,.. , ?..,...., .. 臼.,一.....,.., .... ,. : ..,,.’. ,. . ., 皿, . / :.,:. . . , , .. .,.,,.,,.,,.,,.,。. .. ,. ..,.,..,..,.. ., ..,.,.... .... . ,., .,,.,.,., . . ... ,,孓. .., ,.. ..... , %. .. , .叨 ,:. . , , , . 廿 :锄 ,,,. 【】. . . ,. ,;. . , , .? , 【】.,,:. .侯丽莉,陈肖华.酸性神经鞘磷脂酶的生物学特性及其功能.国外医学.放射 医学核医学分册. ,:. ..,..,.,,..,&, ,.. . . , ..,., . ... ,,刖. .... .,:. . .景亚武,易静,高飞.活性氧:从毒性分子到信号分子一活性氧与细胞的增 殖、分化和凋亡及 其信号转导途径.细胞生物学杂志.,:. . , .笛 . :., : . .. ...。.。... . ..,.??... . . ’ ,.. ,:斟. . . , ,【】... ,:... . , , , , , . :. .., ,. , :卅. 玉米赤酶烯酮,,又名.毒素,是一类结构相似的二羟基 苯酸内酯化合物,主要由禾谷镰刀菌、黄色镰刀菌、木贼镰刀菌等镰刀菌属真菌 产生【】。广泛存在于霉变的玉米、高粱、小麦等谷类作物中,是世界范围内粮 食饲料的污染物之一,在奶类、肉类和蛋类也被检出,污染率较高。研究表明, 它具有很强的生殖毒性和致畸作用,导致生长下降,免疫抑制,繁殖障碍,给畜 牧业带来巨大的经济损失。进入人体,能诱发肿瘤等毒害现象,给人类健康 造成极大的危害。由于受到不同因素的影响,所以在不同的国家不同的食品中有 不同的标准。目前我国尚未制定食品中的限量标准。本文就的理化性质、体 内代谢及毒理学研究资料进行综述。 .的命名及理化性质 玉米赤酶烯酮的纯品最早由等于年从污染了禾谷镰刀菌的发 霉玉米中分离得到的【。是,.二羟基苯甲酸内酯类化合物,具有雌激素活性。 化学名称为..羟基..氧基碳烯基..雷锁酸..内酯,分子式为, 分子量为.,号.。它是一种白色晶体,熔点为?,不 溶于水、四氯化碳和二硫化碳,溶于碱性水溶液、苯、乙醚、二氯甲烷、氯 仿、 乙酸乙酯、甲醇以及乙醇等,微溶于石油醚。其甲醇溶液在紫外光下呈明亮 的绿~ 蓝色荧光】。 .在体内的代谢 经口服可被快速吸收,主要分布在雌激素靶组织,例如子宫、睾丸间质 细胞和卵泡。及其代谢产物主要随胆汁进入肠道,经粪便排出体外,少量 可由尿液排泄。在不同生物种属体内的代谢、吸收、分布和排泄都是有所不 同的,主要是因为不同种属动物对的敏感程度不同,以猪最敏感。玉米赤霉 烯酮在动物体内主要有两条代谢途径:、被还原成玉米赤霉烯醇,有 和两大类,这两种还原形式都具有两个非对应立体异构体,. 、.乙让、、.。其中.和.具有与类似的理化 性质,但两种的结构不同导致了其性质的差异。体外研究表明,及其代谢 产物和.的雌激素活性顺序为:..。、是在血浆 中与葡萄糖醛酸结合。.的毒性 .一般毒性 国内外大量资料证明,玉米赤霉烯酮具有类雌激素样作用,它除了对繁殖机 能造成影响外,还具有肝毒性、肾毒性、免疫毒性、细胞毒性和遗传毒性, 且对 肿瘤的发生也具有一定的影响。玉米赤霉烯酮中毒症状分为急性中毒和慢性 中毒。 在急性中毒的条件下,对神经系统、心脏、肾脏、肝和肺都会有一定的毒害作用。 动物表现为走路蹒跚,兴奋不安,全身肌肉震颤,突然倒地死亡;还表现为外生 殖器肿胀,精神萎顿食欲减退,腹痛腹泻的特征。动物呆立,频频排尿,呈淡黄 色,粪便稀如水样,呈灰褐色,恶臭,并混有肠粘液。同时还可发现黏膜发绀,体 温无明显变化。在剖检时还能发现胃肠黏膜充血、水肿,淋巴结水肿,肝脏轻度 肿胀,色淡黄,质地较硬。而在慢性中毒时,主要对母畜的毒害较大。玉米赤酶烯 酮会导致母畜乳房肿大,外生殖器肿大。还可以增加胎盘的吸收,损害胎儿的健 康甚至造成流产、死胎、产仔畸形和延期流产的现象大面积产生,并且伴有木乃 伊胎现象【。同时对公畜也会造成一定的影响,出现“雌性化”的症状、包皮积液、 食欲不振、掉膘和生长不良的情况。 .细胞毒性 具有很强的细胞毒性,在细胞水平有明显的细胞毒作用,引起细胞损伤。 作用于、、.这三个细胞系后的分别为、和。 随着浓度的增加细胞凋亡率增加,呈剂量依赖关系。另外,通过检测表 明可以影响细胞周期的分布,使细胞停滞在/期。作用于细 胞系后,能够促进和的表达,但却抑和的表达。和是 家族关于细胞凋亡的两个主要成员,通过研究发现,可提高的表达, 但是对的表达却没有反应。由于/的比率增加,所以促进细胞凋亡【。 .免疫毒性 等研究发现将老鼠按/蚝体重的剂量喂食,结果显示老鼠的胆 固醇、总蛋白、白蛋白、甘油三酯、白细胞数量、免疫球蛋刍与和淋巴细 胞的数量明显降低了【。已知细胞依赖性巨噬细胞对李斯特氏菌的早期防御具有 重要作用,而后由细胞介导宿主随后的抵抗力,并伴有特定致敏细胞和活化的 巨噬细胞的产生。以拌饲方式给予小鼠 /玉米赤霉烯酮,可显著降低小鼠 对单核细胞增生李斯特氏杆菌的抵抗力,但未引起组织病理学改变。和 棚究发现高浓度的玉米赤酶烯酮能够显著升高白细胞介素.和白细 胞介素.的水平并且抑制植物血凝素刺激的人外周血淋巴细胞增殖,还能抑 制刀豆素和美洲商陆有丝分裂原刺激的细胞和细胞形成【。已被报道具有遗传毒性,本文仅从染色体和方面对它的遗传毒性进 行评价。微核与染色体损伤有关,是染色体或染色单体的无着丝点断片或纺锤丝 受损伤而丢失的整个染色体,在细胞分裂后期遗留在胞质中单独形成一个或 几个 次核,比主核小,因而称之为微核。微核试验是检测断裂剂和非整倍体诱变 剂的常用方法之一,是目前学术界公认的反映细胞染色体受损的经典指标【。 体 外试验表明,能够使细胞微核率增加并引起染色体畸变,且有明显的剂 量反应关系【地】。试验结果表明,玉米赤酶烯酮对细胞染色体具有损伤作用。 单细胞凝胶电泳试验,又名彗星试验,是近年来发展起来的用于检测单个细 胞损伤的方法,应用十分广泛,具有灵敏、简便、快速等优点,是检测化学 物所致损伤的常用指标之一。体外研究结果表明,.~.的玉米赤酶烯 酮可致和.这两个细胞系的发生链裂,且呈剂量依赖关系。 有研究发现的作用于.细胞引起了脂质过氧化产物丙二 醛的产生,且呈剂量依赖关系【。可能是细胞膜上的多聚不饱和脂肪酸 通过自由基和的攻击发生脂质过氧化,导致细胞内以为代表的脂质过氧 化物的增多,损伤了,从而可能诱发癌症的发生。 还能够抑制蛋白质、和的合成,改变细胞膜结构,诱导细胞程 序性死亡。还能够损害细菌的修复、诱导细胞核病变和基因改变,引起仓 鼠卵巢的染色体畸变和增加入外周淋巴细胞姐妹染色单体交换率,在小鼠 肾、肝 中形成力合物。 .生殖毒性 因玉米赤酶烯酮具有类雌激素样作用,可表现出生殖系统毒性作用。大多数 动物对都比较敏感,如:猪、绵羊、奶牛、家兔等。可对雌性动物的生殖 系统造成毒害,导致动物的生产性能下降,并通过胎盘的吸收从母体传给胎儿, 损害幼体的健康甚至造成流产。’等人研究发现,在动物怀孕期间,给予大 量的能降低胚胎的存活率及新生胎儿的出生体重【。还可以通过抑制 和孕酮的分泌,改变子宫组织形态从而影响子宫的发割”。在小鼠、大鼠、猪和 家兔中,喂养后它们的肾上腺、甲状腺和垂体腺的重量发生了改变,且血清 中孕酮和雌二醇的水平也发生了变化【?引。另外,还对雄性动物的生殖系统 造成破坏,导致睾丸癌,隐睾病,尿道下裂和减少精液质量。等从日 龄开始对公仔猪饲喂/日粮的,在其岁时,发现公猪雌性化,精液浓度 显著降低,而且睾丸发生萎缩,性欲降低【。 . 对内分泌系统的影响 近来许多研究表明,与内源性雌激素在结构上相似,和它的一些代谢产物能与体内或者体外系统的一些雌二醇受体 和 竞争性地结合【】。 在垂体细胞系中,通过.的亲和力与雌二醇受体 .雌二醇结合,并诱导 泌乳素的分泌。 ..的,周后血清泌乳素的水平明显 日龄的雄鼠每天经口服/ 升高,但是其他一些参数像体重、睾丸重量、血清促黄体生成激素、促卵泡生成 激素的水平和睾丸间质细胞、精原细胞、早期和晚期的初级精母细胞的体积 分数 没有发生明显改变【。将新生的 鼠分两组,在到天第一组小 鼠每天皮下注射的而第二组每天皮下注射的,两组小鼠在第 天的时候切除睾丸,第天注射促性腺激素释放激素。这两组中的雄鼠和雌鼠 的脑垂体对促性腺激素释放激素的反应都明显降低。在高剂量组中,雌鼠的 视前 区神经核的体积形态发生改变,而在雄鼠中没有明显变化幽】。 和他的同事对斟的代谢产物无激素作用水平的研 究为基础建立了风险评估【】。他们将切除卵巢猴子的阴道角质化作为评估 终点。 猕猴经口服天的,无激素作用水平的剂量是每天“鲈喑..,而在短 ..。 尾猴中,经口服天的,无激素作用水平的剂量是每天小于/ 研究发现的雌激素样作用比的低,它的无激素作用水平 的剂量要比高。根据及其代谢产物对老鼠子宫胞质受体亲和力的不同排 序为:..,。最近,等报道 和它的代谢产物具有相似的雌激素样作用,但除外,它可以诱导更强的雌 激素样作用【】。 .致癌性 之前的研究发现具有致癌性。由于主要是在肝脏中进行代谢,因此 肝脏也是主要的靶器官。可引起肝脏的损害,继之可发展成为肝癌【。 用不同浓度的喂养/老鼠周,之后观察发现喂养老鼠的体重明显 减轻了,并且在雄鼠中前列腺炎,乳腺炎和肝细胞空泡化的发病率增高。在雌鼠 和雄鼠中,又诱发了慢性肾病,视网膜病和白内障的发生。根据等研 ? 究表明还具有血液毒性【】。喂养后的老鼠,它们体内的凝血功能出现异 常,而且一些血液学指标像红细胞压积、、血小板和白细胞计数都发生了明 显的改变。一些生化标志、削旧、、肌酸酐和胆红素也被检测出来异常。 最近的研究还发现,会结合到人的雌激素受体并通过刺激雌激素依赖性乳腺癌 细胞增殖,促进乳腺癌的发生【】。 .的脱毒处理 会带来巨大的危害,加强对的防范是非常重要的。对产生的防范 措施主要是从控制的生长环境方面着手,防范措施包括控制温度、控制水分、控制氧气、添加防霉剂、控制污染源等。对污染的食品和饲料的脱毒处理主要是 通过物理、化学和生物学方法来实现的。物理吸附法是利用各种吸附剂吸附玉米 赤霉烯酮,从而达到脱毒的目的。等研究发现老鼠按/体重的剂量 喂食页硅酸盐粘土,能明显提高老鼠的免疫学、生物化学和组织学参数,表明页 硅酸盐粘土能紧密结合和固定,因而有效减少对老鼠的危害【】。 等研究了活性炭和消胆胺吸附的效果,它们可以作为饲料添加剂 去干预的类雌激素样作用【川。生物转化脱毒法是进行生物转化,将变成 无毒的产物,是一种全新的脱毒技术。研究表明,通过酶解法,某些酶利用其降 解作用,可以使霉菌毒素破坏或降低其毒性。利用微生物如乳酸菌等可以在肠道 减轻肠道对的吸收。和砧研究发现,高浓度的和可以 显著降低被污染谷物中的毒性,并随着处理时间的延长和温度的上升, 的毒性逐渐降低。 .小结 是一种非固醇类具有雌激素样作用的真菌毒素,由镰刀菌产生,主要存 在于玉米、小麦、大麦、大米等粮食作物中,污染率较高。根据人群资料与动物 实验资料,年将对人类的致癌性划归为第三类,即现有证据尚不能 就其对人类致癌性进行分类。具有生殖发育毒性、免疫毒性、细胞毒性、 肝毒性,对肿瘤产生也有一定影响,不仅会给养殖业带来巨大的经济损失,更重 要的是可能对人类和动物的健康造成严重的危害。 虽然目前对的毒性及其作用机制已做了大量的研究,但由于在体内的 吸收、转化和代谢过程比较复杂,而且还会与体内的某些物质产生交互作用后 再发挥作用,致使现在对其毒作用机制还未完全阐明。因此有必要对进行进 一步的研究,以便建立一种快速、灵敏、易行的检测方法和生物标志体系来 制定 标准以及确保食品和饲料的安全,减轻甚至是消除对人类及动物健康可能产 . 生的危害。参考文献 .刑, : . .【】. ,, . , , .伽 ,:. 【., , .郑鹏然.食品卫生工作手册【】.北京:人民卫生出版社, . ., ,.. ...?『 . ,瞄 . ., : . ,,:. .涂华荣,齐德生,玉米赤霉烯酮的危害及其防治【】.饲料广角,,:. . , , . ., ., .:. . , , , , , .. 『. 一 . . . . ., , / . ,,:. .,..,.: ., 硒 ,.. .. .蒋东方.微核试验在职业人群接触危害评价应用中的研究.中国职业学.,;? . .. ,:, ,. ., , ., ., ., . . .’,...,..,,...,. : .... ?. .,.,... : .... . . ..,..,,., ....,...,.,.,,.,,..,. .:,..’ , , , ,.. 惘哪 .,..: . ./ .? ., . , :. 】. .,:. .....,..,.,..,,.., .., .,..,. ,.. .,.,..,.. 笛 ....,,?..,..,,., .,. , , .....,. .. , , ...,,..,.,.,,.,,... ., ,.., / . .. . ,. .,.,,.,,..,.,.,.. ,..余增丽,张立实,吴德生.玉米赤霉烯酮对一细胞肿瘤相关基因表达的影 响【】.毒 理学杂志,,:.. 碱 .,.,,,.,. ...,. .,..,..,.,.,.,,..,..,,..,..,..,,.. . ..,,...., .: 鲫 ,.. . . .., . ,.,.. ? 致 谢 首先衷心感谢我的导师刘晓芳副教授,感谢三年来刘老师在我生活和学习中 给予的指导、帮助与鼓励,刘老师认真的工作态度,诚信宽厚的为人处世态度, 都给我留下了难以磨灭的印象,也为我今后的工作树立了优秀的榜样。近三年的 学习和科研工作,不仅使我的知识结构和科研能力上了一个新台阶,更重要的是, 各方面的素质得到了提高。在此向刘老师致以崇高的谢意。 同时衷心感谢仲来福教授,感谢三年来仲老师在我学习和思想上给予的指导、 帮助与鼓励,仲老师严谨的治学态度,渊博的知识,精益求精的工作作风,诲人 不倦的高尚师德,都深深感染着我,使我受益终身。在此向仲老师致以崇高的敬 意。 感谢营养与食品安全专业的陈敏、杨光等各位老师在科研、教学过程中给予 的指导、支持与帮助。 感谢姜丽萍、耿成燕等各位老师对我实验上的帮助与支持。 感谢中心实验室的陈海波、魏晓晴老师的支持与帮助。 非常怀念与同窗李建庆共同学习的岁月,感谢你们在实验中给予我的支持与 帮助。感谢在实验过程中帮助过我的师姐施琳琳、张丹、李龙婕,师兄张毅、 张 旭和师妹高伟、徐嫒、孟昱、潘晓,师弟王东、自云涛、高春鹏。 最后,感谢我的家人及朋友多年来的关爱、理解和支持 ?关于学位论文使用授权的说明 《玉米赤酶烯酮引起细胞链断裂的溶酶体途径》系 本人在大连医科大学攻读硕士学位期间在导师指导下完成的学位 论文。本人及指导教师完全了解大连医科大学关于保存、使用学位论 文的规定,同意学校保留并向有关部门或机构送交学位论文的复印件 和电子版本,允许论文被查阅和借阅,同意学校将本论文加入: .中国学术期刊光盘版电子杂志社??《中国博士学位论文 全文数据库》、《中国优秀硕士学位论文全文数据库》及 相关数据库。 .中国科学技术信息研究所??《中国学位论文全文数据库》 .国家图书馆 本人授权大连医科大学,可以采用影印、缩印或其他复制手段 保存、汇编学位论文,可以公布论文的全部或部分内容。 论文作者签名: 歪盈 指导教师签名:审蝴 签字日期:鲨上年上月卫日