变形链球菌耐氟菌株的体外诱导

变形链球菌耐氟菌株的体外诱导 中国实验诊断学2010年7月第l4卷第7期 文章编号:1007—4287(2010)07—1095—02 变形链球菌耐氟菌株的体外诱导 赵洪岩,张志民,朱来宽,李荟 (1.吉林大学第二医院,吉林长春130041;2.吉林大学口腔医院) ---—— 1095?--—— 摘要:目的体外诱导变形链球菌耐氟菌株.在含有不同氟化钠浓度的BHI上逐 步诱导变形链球菌产生 耐氟菌株,并与亲代菌株进行比较.结果变形链球菌耐氟菌株在体外诱导成功.结 论变形链球菌耐氟菌株体外 的成功诱导,为耐氟菌株的后续研究奠定了基础. 关键词:变形链球菌;氟化物;耐氟菌株 中图分类号:R780.2文献标识码:A Inductionoffluoride-resistantstrainofstreptococcusmutansinvitroZHAOHong-yan,ZHANGZhi—min",ZHULai—kuan, eta1.(1.TheSecondHospitalofJilinUniversity,Changchun130041,China;2.SchoolofStonuuology,JilinUniversity,Changchun 130021,China) Abstract:ObjectiveToinducefluoride— resistantstrainofstreptococcusmu"ll1sinvitro.Methodsfluoride—resistants~ainof streptococcusmutanswaso~ainedbysubcuhuringstreptococcusmutanstoB}{IcontainingdifferentconcentrationsofNaF.andthey werecompared.ResultsInductionoffluoride-resistanlstrainofstreptococcusmutansinvitroissuccessfu1.Conclusionfluoride-re— sistantstrainofstreptococcusmutanshasbeeninducedinvitro,whichestablishesthefoundati onforthestudyoffluoride—resistant strainofstreptococcusmutans. - Keywords:streptococcusmutans;proteinexpressionprofile;shotgun (ChinJLab脚,2010,14:1095) 为探讨变形链球菌耐氟菌株突变后其致龋毒力 的变化,我们通过体外诱导产生变形链球菌耐氟突 变株,并观察其生理特征的变化. 1材料和方法 1.1材料 (1)细菌:本实验所用细菌为S.mutansUA159; (2)培养基:用于细菌常规培养增菌的培养基为脑心 浸液培养基(BrianHeartInfusion;BH1);口腔链球菌 选择性培养基为轻唾琼脂培养基(MS). 1.2方法 培养与鉴定将40~C牛奶冻干 1.2.1细菌的复苏, 保存的S.mutansUA159取出,用BHI液体培养基溶 解后,吸取菌液50分别接种于BHI液体培养基 和固体培养基中,37~C厌氧培养(95%N2,5%CO2)24 h,对固体培养基观察菌落形态同时革兰染色镜检及 生化鉴定为变形链球菌后,挑取菌落接种于MS培 养基中纯分,37~C厌氧培养(95%N2,5%CO2)24h, 再次革兰染色镜检及生化鉴定. 1.2.2变形链球菌耐氟菌株的诱导挑取鉴定为 变形链球菌纯培养的单个典型菌落,接种于含有 *通讯作者 50u#mlNaF的BHI固体培养基中37~C厌氧培养 (95%N2,5%co2)24h,观察菌落形态并进行革兰染 色镜检,确定为纯培养后,挑取单个典型菌落接种于 含有100g/rnlNaF的BHI固体培养基中37厌氧 培养(95%N2,5%C02)24h,观察菌落形态并进行革 兰染色镜检,确定为纯培养后,挑取单个典型菌落接 种于含有150ug/n~NaF的BHI固体培养基中37? 厌氧培养(95%N2,5%co2)24h,如此反复,以50ug/ mlNaF递增直至在含有1000ug/n~NaF的BHI固 体培养基中获得耐氟菌落,产生UA159突变株 UA159一FR,在不含NaF的BHI固定培养基中连续传 代培养20次(每次传代前均进行革兰染色以确定为 纯培养),挑取单个典型菌落接种于含有1000n1l NaF的BHI固体培养基中培养依然生长,进行革兰 染色及生化鉴定,UA159.FR在含有1000g/mlNaF 的BHI固体培养基传代培养三次后,对培养至18— 24h的UA159一FR进行菌种保存,即超净台内用无 菌滴管吸取无菌牛奶至培养皿中,反复刮取菌落,移 至无菌EP管中,每管4—5滴,置于一40?冰冻后, 再置于真空抽干机中抽干成粉末状,封口膜封口后, 于一40?保存. 2结果 ---—— 1096.'——— 2.1UA159与UA159.FR在Bill平板上的形态如 图1和图2所示UA159一FR的菌落形态与UAI59 相似,但较亲代株小. 2.2UA159与UA159.FIR显微镜下形态如图3和4 ChinJlabDia,Rrl,July,2010,Voll4,No.7 所示UA159.FR镜下形态体积与UA159相似,但体 积增大.. 2.3UA159与UA159一FIR生化特征比较见表1. 一一一一图1UA159在Bill平图2UA159.FR在Bill 板上的形态平板上的形态 图3UA159镜下形态图4UA159-FR镜下形 (100倍油镜)态(100倍油镜) 表1UA159与UA159.FR生化特征比较 3讨论 氟化物是目前使用最广泛的防龋制剂,其对致 龋菌的作用是氟防龋的重要机制之一.近年来,为 提高并维持菌斑内较高的氟水平,局部应用氟化物 的浓度增加,间隔时间缩短,最可能的后果是耐氟菌 株的产生.对氟离子敏感的变形链球菌在长期接触 氟后可以产生突变或适应性改变,甚至可以导致耐 氟菌株的产生.盛江筠…1发现变链菌耐氟菌株基因 型发生改变,且可能包括多个基因的突变,但对于基 因突变的具体部位还不清楚.国内外研究均显示, 变形链球菌耐氟突变后,其产酸能力和耐酸能力都 增强.目前已分离并克隆了多个与变形链球菌耐酸 性相关的基因,运用分子生物学技术来探索耐氟菌 株相应的耐酸相关基因是否发生突变,并进一步研 究其功能,为龋病预防提供相应的理论依据.我们 对变形链球菌耐氟菌株的耐酸相关基因进行PCR 扩增测序后发现ffh,dgk发生了突变_2.3J,这可能与 耐氟菌株耐酸性增强有关. 耐氟菌株不仅能降低局部用氟产生的抑龋效 果,而且较亲代菌株更不易被氟化物抑制.耐氟菌 株的出现,为氟化物防龋提出了新的问题.研究耐 氟菌株,可以前瞻性地了解变形链球菌耐氟突变后 致龋毒力的变化,为临床上合理应用氟化物及寻找 新的防龋药物提供有力的实验依据.为研究耐氟菌 株的生物学特性,国内外学者多采用体外诱导方法, 获得耐氟菌株.本实验也是在含有不同氟浓度的 BHI培养基上逐步诱导变形链球菌(S.D/.//./~r/$ UA159),经反复传代培养,最终在氟化钠浓度为 1000g/rrd的Bill培养基中获得了耐氟菌株 UA159.FR.所获得的耐氟菌株经反复传代培养20 次,仍可在氟化钠浓度为1000ml的BHI培养基 中生长.所获得的耐氟菌株UA159.FR最后经过观 察平板上的菌落形态,显微镜下菌体形态检测以及 一 系列的生理生化鉴定即同甘露醇,山梨醇,棉子 糖,蜜二糖,七叶苷及精氨酸的反应发现耐氟菌株与 其亲代菌株的这些生理生化特征相似,表明我们成 功地获得了变形链球菌耐氟菌株,从而为以后对其 致龋特性及致龋机制的研究奠定了基础. 作者简介:赵洪岩(1973一),男,讲师,在读博士.研究方向: 龋病微生物学. 参考文献: [1]盛江筠,刘正.变形链球菌和远缘链球菌耐氟菌株DNAG十C 含量测定[J].上海El腔医学,2001,lO(1):49. [2张志民,赵洪岩,张家颖.变形链球菌耐氟菌株中耐酸相关基因 卧突变的检测[J].现代口腔医学杂志,2007,21(6):570. [3]张志民,任宝华,张家颖,等.变形链球菌耐氟菌株中耐酸相关基 因dfk突变的检测及临床意义[J].吉林大学(医学版),2008, 34(5):850. (收稿日期:2O09—01—25)