柴胡疏肝散抗肝纤维化

柴胡疏肝散抗肝纤维化 【摘要】目的探讨柴胡疏肝散对肝纤维化大鼠模型α SMA、TGF β1的影响及其抗纤维化的机制。方法采用40%CCl4皮下注射，制备肝纤维化模型并以柴胡疏肝散干预，测定肝功能、血清透明质酸(HA)、层黏连蛋白(LN)及肝组织羟脯氨酸(HYP)，光镜观察肝组织病理变化，免疫组织化学法检测肝组织α SMA、TGF β1表达，RT PCR检测TGF β1mRNA的表达。结果柴胡疏肝散组较模型组:肝功能明显改善，血清HA及LN显著降低，肝组织HYP含量明显少，肝组织纤维化程度明显改善，肝组织α SMA及TGF β1表达减少。结论柴胡疏肝散对CCl4诱导的大鼠肝纤维化有良好的防治作用。 【关键词】柴胡疏肝散;肝纤维化;α SMA;TGFβ1 近年来柴胡疏肝散抗肝纤维化的临床研究取得了较好的临床效果〔1〕，但目前国内外尚无柴胡疏肝散抗肝纤维化的基础研究。本实验采用四氯化碳(CCl4)大鼠肝纤维化模型,观察柴胡疏肝散的抗肝纤维化作用,并探讨其对α 平滑肌肌动蛋白(α SMA)、转化生长因子(TGF β1)影响及柴胡疏肝散抗肝纤维化的理论机制。 1材料与方法 1 1材料 1 1 1动物及药物雄性22月龄Wistar大鼠60只,体重300,350g，由吉林大学实验动物中心提供。柴胡疏肝散(柴胡6g，陈皮6g，川芎5g，香附5g，枳壳5g，赤芍5g，甘草3g，由长春中医药大学附属医院提供)经冷水浸泡药材2h，常规两煎,头煎1 5h，二煎1h，两次水煎液混合并过滤,经水浴蒸发浓缩成含生药1 12g/ml的浓缩药液冷藏备用。按体表面积折算,大鼠每天的柴胡疏肝散等效剂量为2 8g/kg(体重)。 1 1 2药品及试剂CCl4购自北京北化精细化学品有限责任公司);秋水仙碱(colchicine)购自昆明股份制药有限公司;谷丙转氨酶、谷草转氨酶试剂盒购自上海科欣生物技术研究所;血清总胆红素(TBIL)试剂盒购自上海科华东菱诊断用品有限公司;透明质酸(HA)、层黏连蛋白(LN)放射免疫分析测定盒购自上海海军医学研究所生物技术中心;单克隆急用型鼠抗人生α SMA试剂盒购自北京中杉生物公司，兔抗大鼠TGF β1多克隆抗体购自武汉博士德生物工程有限公司，即用型SP免疫组化试剂盒购自福州迈新试剂公司，DAB购自北京中山生物公司，RT PCR两步法试剂盒购自TAKARA公司，Trizol购自Sangon公司。 1 2方法 1 2 1模型制作参照文献〔2〕方法:实验第1天除正常空白对照组(对照组)外,其余动物皮下注射CCl4分析纯0 5ml/100g(体重),以后每隔3d注射40%CCl4橄榄油剂0 3ml/100g(体重),连续8w。实验前2w饲喂高脂玉米粉饲料(79 5%玉米粉+20%猪油+0 5%胆固醇)，第3,6周饲喂100%玉米粉和30%乙醇饮料。 1 2 2分组及给药方法将60只大鼠随机分为4组,每组15只，第1组对照组,饲喂正常饮食;第2组模型组,按上述造模方法给予饮食;第3组柴胡疏肝散治疗组,于造模3w开始,给予柴胡疏肝散煎剂灌胃,每日2 8g/kg;第4组秋水仙碱组，于造模3w开始给予秋水仙碱0 1mg/(kg?d)-1，共8w。 1 2 3标本制作上述造模及处理过程结束日，禁食12h后称质量，股静脉取血，分离血清置-20?保存;并立刻完整摘取肝脏及脾脏，称质量后用生理盐水漂洗肝左叶数次，滤纸拭干后，切取0 2g置于冰浴中的组织匀浆器内，加入冰生理盐水2ml，制备成100g/L肝组织匀浆，4000r/min4?离心，取上清液保存于-20?。肝右叶置于40g/L中性甲醛液中常规固定后，石蜡包埋，用于制作组织芯片。 1 3检测指标 1 3 1血清及组织纤维化指标检测测定血清肝功能包括总胆红素(TBIL)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、白蛋白(ALB)、A/G，检测透明质酸(HA)，?型前胶原(PC?)，N型胶原(CN)，层黏蛋白(LN)含量(放射免疫分析法):肝匀浆检测羟脯氨酸(HYP)含量(二甲氨基苯甲醛法)，检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所，均按试剂盒说明书操作。 1 3 2病理检测组织芯片分别行常规HE染色，Masson三色染色(染胶原纤维)及网织纤维染色，光镜下观察，并根据王泰龄等改进的肝纤维化半定量评分系统(SSS)〔3〕进行炎症活动度及肝纤维化程度计分。 1 3 3免疫组织化学检查α SMA、TGF β1采用石蜡包埋常规切片,SP法,兔抗鼠TGF β1,多克隆抗体及鼠抗鼠α SMA单克隆抗体均以1?100稀释,DAB显色,苏木素复染。PBS代替一抗作为阴性对照。阳性组织呈棕色，阴性组织呈蓝色 在全自动图像分析系统上，采用HPIAS 2000型图像分析软件进行定量分析，随机选取每张切片10个视野(×400)倍测定阳性细胞的A值与所占视野面积，取其乘积平均值为该组织切片所得值，两项乘积越大表明组织中该抗原含量越高。 1 3 4RT PCR检测大鼠GAPDH上游引 物:5′ CATGACCACAGTCCATGCCATC 3′,下游引物:5′ CACCCTGTTGCTGTAGCCATATTC 3′全长450bp;TGFβ1上游引物:5′ TGAGTGGCTGTCTTTTGACG 3′，下游引物:5′ ACTTCCAACCCAGGTCCTTC 3′全长350bp。α SMA上游引物:5′ AAGAGGAAGACAGCACAGCTC 3′,下游引物:5′ GATGGATGGGAAAACAGCC 3′称取50,100mg肝组织用Trizol提取总RNA，采用分光光度法测定其含量及纯度，测定A260/A280值。取2μg总RNA，42?逆转录90min。参数设置94?变性,3min×1循环。94?变性30s，53?退火30s，72?延伸45s，共35个循环。最后72?彻底延伸7min×1循环。同法扩增GAPDH作为内参照。取5μlPCR产物1 5%琼脂糖凝胶电泳。凝胶图像分析系统检测灰度,TGF β1/GAPDH比值表示TGF β1mRNA相对水平。α SMA/GAPDH比值表示α SMAmR2NA相对水平。 1 4统计学分析实验结果计量数据以x?s表示，经SPSS11 10软件包进行方差分析，组间比较采用t检验。 2结果 2 1各组大鼠肝功能改变模型组ALT、AST显著升高,ALB显著降低;干预组ALT、AST较模型组明显降低,ALB则显著升高。见表1。 表1大鼠血清肝功能的变化(略) 与模型组比较:1)P,0 05，与正常组比较:2)P,0 01 2 2各组大鼠血清纤维化检查结果与正常组相比,模型组大鼠肝纤维化各项指标明显升高(P,0 01)，柴胡疏肝散干预组与模型组比较，HA、LN及PC?明显降低(P,0 01)，但未达到正常对照组的水平。肝组织HYP含量模型组与正常组相比明显升高(P,0 01)，柴胡疏肝散干预组与模型组比较，明显降低(P,0 01)。见表2。 表2各组大鼠血清HA、LN、PC?含量变化(略) 与模型组比较:1)P,0 01，与正常组比较:2)P,0 01 2 3组织形态学改变肝脏HE染色显示,正常大鼠可见少量胶原着色,病理模型组肝小叶结构破坏,纤维组织增生明显,将肝小叶分隔成大小不等的肝细胞团,肝细胞广泛变性坏死,汇管区扩大、胶原沉积。柴胡疏肝散干预组肝细胞有不同程度的变性坏死,汇管区及小叶间有少量纤维组织增生,纤维间隔细小,与模型组比较差异显著。秋水仙碱干预组肝细胞有不同程度的变性坏死,汇管区及小叶间有少量纤维组织增生，肝细胞内可见脂肪沉积。统计分析，柴胡疏肝散干预组及秋水仙碱干预组较模型组纤维化程度较轻(P,0 05)，Masson染色胶原 面积:模型组与柴胡疏肝散干预组相比分别为与(12 9?0 6)%和(6 2?0 4)%，柴胡疏肝散干预组较模型组为低(P,0 01)。见表3。新晨范文网 表3大鼠肝纤维化的分级(略) 与模型组比较:1)P,0 05,与正常组比较:2)P,0 01 2 4免疫组化结果正常组肝组织中几乎不表达TGF β1，模型组TGF β1阳性细胞主要位于中央小叶和门静脉周围纤维带及肝纤维间隔中,主要见于Kuffer细胞、类间质细胞质及其周围，柴胡疏肝散干预组阳性染色程度均较模型组明显减轻(P,0 01)。α SMA在胞浆表达，正常对照组只表达于小动脉及小静脉，在胆管无表达。模型组α SMA主要表达于汇管区及纤维间隔，且呈长椭圆形或梭形。实验表明模型组α SMA免疫组织化学染色面积明显升高，显著高于正常组(P,0 01)。柴胡疏肝散治疗组及秋水仙碱干预组明显低于模型组(P,0 05)。见表4。 表4各组大鼠肝组织TGF β1及α SMA表达的变化(略) 与模型组比较:1)P,0 05,与正常组比较:2)P,0 01 2 5RT PCR检测正常肝组织几乎不表达TGF β1mRNA，而模型组为强表达，TGF β1/GAPDH比值为0 84?0 17，远高于正常组(P,0 01);柴胡疏肝散干预组TGF β1/GAPDH比值为0 57?0 14，TGF β1mRNA表达低于模型组(P,0 05)。α SMAmRNA模型组表达较正常组明显增强，比值为0 97?0 15(P,0 01);柴胡疏肝散干预组比值为0 62?0 23，与模型组比较(P,0 01)。 3讨论 目前的研究认为，肝纤维化的病理改变是细胞外基质(ECM)的增生和降解失衡所致，而病理情况下细胞外基质的主要细胞来源是肝星状细胞(HSC)，他的激活和增生在肝纤维化过程中起主要作用〔4，5〕。TGF β1是HSC活化的强有力刺激因子和肝纤维化形成的始动细胞因子〔6，7〕，α SMA是HSC活化的标志〔8〕。从祖国医学辨证认为，肝纤维化是由于气滞、血瘀、络阻所致，肝纤维化初期主要为气滞，进而血瘀，最后络阻，气机不畅，肝纤维化、肝硬化形成。因而，在肝纤维化早期给予理气治疗，间以活血可有效地阻止肝纤维化的形成，柴胡疏肝散(源自《景岳全书》)主入肝经，方用陈皮、柴胡、川芎、香附、枳壳疏肝理气，川芎、赤药活血化淤，共奏理气活血之功效，是防治肝气淤滞的有效验方。本实验证实了柴胡疏肝散具有保护鼠肝功能的作用，ALT、AST较模型组明显降低，ALB较模型组明显升高，两者比较差别显著;血清中各纤维化指标及肝组织羟脯氨酸含量 柴胡疏肝散组较模型组明显降低;柴胡疏肝散从组织学上具有减少试验鼠肝纤维化形成的作用，病理HE染色，Masson三色染色胶原含量较模型组明显降低，病理分级明显改善，两者比较差别显著;柴胡疏肝散能够减少或阻抑试验鼠TGF β1及α SMA的表达，免疫组化及RT PCR证实TGF β1及α SMA的表达量较模型组明显降低，两者比较差别显著，柴胡疏肝散具有防治实验鼠肝纤维化的作用。 【参考文献】 1朱肖鸿，付淑艳，叶蕾 柴胡疏肝散抗肝纤维化治疗的疗效观察〔J〕 中医药学报，2003;31(2):38 2于世瀛,贲长恩,杨美娟,等 免疫性和化学性损伤肝纤维化动物模型的比较〔J〕 实验动物科学与管理，1995;12(4):5 6 柴胡疏肝散抗肝纤维化责任编辑:李老师