生肌散拆方丹参素对肉芽组织成纤维细胞的生物学作用

生肌散拆方丹参素对肉芽组织成纤维细胞的生物学作用 生肌散拆方丹参素对肉芽组织成纤维细胞 的生物学作用 l4中国美容医学2005年2月第14卷第1期ChineseJournalofAestheticMedicine.Feb.2005.Vo1.14No.1 达也呈现较明显的时间变化特点,但未发现明显的力侧与 张力侧变化的差别,牙齿移动3天后,T1MP—l表达增强,7天 时牙周膜成纤维细胞,成骨细胞呈强阳性表达.表明在机械 力作用下,过多的MMP—l可能激活潜在TIMP—l基因,引起 T1MP—l的表达,从而达到MMP—l与TIMP.1之间的平衡. 7,10天后T1MP开始下降,到l4天仍明显高于对照组.加 力5,7天(增生期)血管增生,成纤维细胞大量增殖,此时 胶原酶的活性达到高峰.l周后,胶原大量合成,MMP—l不仅 继续分解残存的胶原,也分解新合成的胶原,TIMP—l为了维 持MMP/T1MP之间的动态平衡,为保证新生胶原不被过度 降解及牙周组织的正常改建,仍保持在一个较高的水平?『j. 本研究结果显示:MMP—l及TIMP—l在大鼠正畸牙齿移 动过程中参与了I型胶原降解与合成的调节,MMP.1及 TIMP—l在维持牙周组织ECM的改建和代谢,以及牙周组织 健康及修复重建中都起到了重要的作用.进一步研究了 MMP—l及TIMP—l的调节机制,I型胶原的代谢变化与牙周 组织改建的关系,对揭示正畸牙齿移动机理具有特殊意义. [参考文献] 【1]李成章,樊明文,唐志娇.人牙骨质,牙周膜,牙槽骨中I,III,?型 胶原的检测EJ].中华IZl腔医学杂志,1997.3(32):70.72. [2]RedlichM,ReichenbergE,HarariD,eta1.Theeffectofme- chanicalforceonmRNAlevelsofcollagenase,collagentypel, andtissueinhibitorsofmetalloproteinasesingingivaeofdogs EJ].JDentRes.2001.8O(12):2080-2084. 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[摘要]目的:研究生肌散中化瘀药丹参素对肉芽创面成纤维细胞的生物学作用.方 法:体外培养肉芽组织成纤维细胞,分别加 入不同浓度的丹参素,采用CCK一8,台盼蓝计数,流式细胞仪检测丹参素对成纤 维细胞生长增殖的影响.结果:丹参素对肉芽组 织中的成纤维细胞有抑制作用,有统计学意义(P<O.05).结论:生肌散中的单方丹 参素对肉芽组织中的成纤维细胞有抑制作 用,可防止创面的过度愈合. [关键词]丹参素;肉芽组织;成纤维细胞 [中图分类号]Q343.6[文献标识码]A[文章编号]l008—6455(2005)O1—0014-03 /heinfluenceofShengjisanRecipe,SalvianicacidAonthebiologyof fibroblastbyculturethegranulationtissueinwoundinvitro HAOJian',CHENChang-an',ZHANGLin—xi,YICheng—gang,ZHANGXue—dong2 RUZhan-feng',GUOShu—zhong (1.DepartmentofBurn&PlasticSurgery,CenterHospitalofXian,710003.ShaanxiProvince.China 2.DepartmentofPlasticSurgery,XijingHospital,theFourthMilitaryMedicalUniversity) Abstract:ObjectiveTostudytheinfluenceoftheHuayuherb,SalvianicacidAonthebiologyoffibroblastsby 【基金项目]西安市科技社会发展基金资助(GGIN1l6) 中国美容医学2005年2月第14卷第1期 ChineseJournalofAestheticMedicine.Feb.2005.Vo1.14.No115 culturethegranulationtissueinwound.MethodsThefibroblastsharvestedfromgranulationtissueinwound wereculturedinvitro.CCK一 8.trypanbluecellcounting,flowcytometrywereemployedtoobservetheinfluenceof SalvianicacidAonthebiologicalcharacteristicoffibroblasts.ResultsSalvianicacidAhaveainhibitioneffecton theproliferationoffibroblastswithasignificandifferencebetweencontrolgroupandSalvianicacidAgroupfP< O.05).ConculsionSalvianicacidAhaveaninhibitioneffectonthegranulationtissueinwound,andcould preventoverhealing. Keywords:SalvianicacidA:granulationtissue;fibroblasts 在组织修复中,成纤维细胞(fibroblast,FB)是创面修复 愈合过程中的主要修复细胞,其生物学效应在刨面修复中起 着至关重要的作用.Lekic等fl1认为,FB是创伤修复的工程 师,建筑者和管理员.了解与控制FB的生物学行为是促进伤 口愈合,预防瘢痕形成的基础与关键.慢性难愈性创面是目 前临床上比较棘手的问题之一,西医在临床上尚缺乏行之有 效的药物和方法,中医在慢性难愈性创面的治疗方面有丰富 的经验.本研究拟用笔者所在医院自拟生肌散拆方中的化瘀 药丹参素来观察其对成纤维细胞的生物学作用,以探讨丹参 素在慢性伤口愈合中的作用. 1材料和方法 1.1材料:丹参素提取物为笔者所在医院药剂科制备,采用 水煮醇沉提取方法;DMEM,胰蛋白酶:美国Gibco公司;小 牛血清:杭州四季青公司;CCK.8试剂盒:株式会社上海同仁 化学研究所;DG503l酶联免疫仪:南京华东电子集团医 疗装备有限责任公司;Wistar二级清洁大鼠:雄性,体重 (240:t:20)由第四军医大学动物实验室提供. 1.2方法 1.2.1成纤维细胞培养:参照付小兵等改良塑料环肉芽肿定 量法制备创伤模型,5,7天待肉芽组织形成后取材.培养创 面肉芽组织成纤维细胞,实验选用3,8代的细胞tz],丹参素 的最终浓度分别为:0,0.125,0.25,0.5,1.0,2.0mg/ml. 1.2.2细胞形态学观察和增殖试验:将处于对数期的FB接 种于96孔细胞培养板,每孔lOOpl(5×10,)细胞,预先于 37?,5%CO:孵箱中静置培养24h后,待细胞贴壁,伸展后加 入无血清的DMEM继续培养24h,然后弃去培养液换成不 同浓度的丹参素条件培养液(每孔lOOp1),观察细胞形态 学的变化,再继续培养24h后每孔加入lOpl的CCK.8试 剂,接着将培养板放在培养箱培养3h,3h后用酶联免疫分析 仪测定波长450nm处细胞的吸光度OD值. 1.2.3细胞毒性试验:细胞接种方法同前.培养24h后加入 lOpl不同浓度的丹参素,继续培养48h后每-fL;b!q入lOpl 的CCK-8试剂,再培养3h后测量吸光值(方法同前). 1.2.4细胞生长曲线的测定:取对数期的FB,胰酶消化,调 节细胞浓度为6×l0,接种于24孔板中,48h后换为无血清 DMEM液(对照组)和实验组(1mg/ml的丹参素),分别在 作用24,48,72h后台盼蓝染色,光镜F细胞计数,每组3孔, 重复计数3次,然后计算平均值绘制细胞生长曲线. 1.2.5细胞周期的测定:取对数期的FB,胰酶消化,调节细 胞浓度为2×l0s,接种于6个25ml的培养瓶中,培养48h弃 去培养基,对照组(3个培养瓶)加入不含血清的DMEM,试 验组(3个培养瓶)加入终浓度为lmml的丹参素,继续培 养24h后倒掉培养基,用4?PBS淋洗两遍,胰酶消化, 1000r/min离心8rain,70%酒精固定24h,1000r/min离心 5min,弃上清加入lmlPI(碘化丙啶)染液,避光染色静置 20min后上流式细胞分析仪,检测细胞周期的变化. l-3数据的处理:实验数据资料以均数?差s)表示, 用统计软件spss10.0进行单因素变量的方差分析和 Dunnett—t检验. 2结果 2.1丹参素对细胞增殖和形态学的影响:,【斗参素对细胞增殖 的影响见图l.与对照空白组相比,低浓度的丹参素对细胞有 轻度的刺激作用,但无统计学意义(P>O.05);而高浓度的丹 参素(1mg/ml,2mg/m1)对成纤维细胞有的抑制作用,统计学 意义明显(P<0.05).2mg/ml的细胞大多数死亡,所以在测生 长曲线和细胞周期时我们选择最佳浓度1mml.lmml作 用的细胞变细,胞质回缩,或呈球形,图3(见中插1). 一 ! 115 姆 1 l05 菩 001250:50512 图1不同浓度的丹参素对成纤维细胞增殖的影响(mg/mI) 2-2丹参素对成纤维细胞的毒性作用:丹参素对成纤维细胞 的毒性作用见表l,各实验组与对照组相比无明显差别,无统 计学差异(P>O.05). 16中国美容医学2005年2月第14卷第1期 ChineseJournalofAestheticMedicine.Feb.2005.Vo1.14.No.1 注:各实验组与对照组相比,无统计学意义(P>0.05) 2.3丹参素对成纤维细胞生长曲线的影响:丹参素对成纤 维细胞有抑制其增殖的作用,随着作用时间的延长,抑制作 用明显,试验组lmml与对照组相比有显着性差异,有统计 学意义(P<0.05)(见图2). 2.4丹参素对成纤维细胞细胞周期的影响:丹参素对细胞 分布各期的作用见表2,在浓度lmml作用时,G2一M期分 布增多,GO.G1期相对减少,S期分布有轻度增加,但作用 不明显. ^ 20 专l5 = l0 薹s 彝0 图2丹参素对成纤维细胞生长曲线的影响 表2丹参素对成纤维细胞细胞周期的影响(;?s) 注:与对照组相比P<0.05 3讨论 FB是创伤愈合过程中形成肉芽组织,合成胶原等细胞 外基质,进行伤口重塑的主要修复细胞,同时还可自分泌生 长因子调控修复过程,因此FB功能的变化对创伤愈合起着 举足轻重的作用嘲. 本研究所用生肌散拆方中的活血药丹参素(Salvianic acidA),即D.(+)B.(3,4.二羟基苯基乳酸钠),是唇形科 鼠尾草属植物丹参干燥根部的水提取液中分离的一种水溶 性酚酸类有效成分,它具有缩小心肌梗塞范围和减轻病程的 作用,抑制血小板聚集及抗凝作用,降血脂及抗动脉粥样硬 化作用,抗炎及增强机体免疫作用,保肝作用,有明显改善微 循环障碍的作用,降低血浆乳酸含量,能改善细胞缺血缺氧所 致的代谢障碍,抑制瘢痕增生等作用_4l5J.本研究显示丹参素 能显着地抑制成纤维细胞增殖.从增殖试验看,低浓度时 (0.125,0.25mg/m1)细胞的吸光值仍有增加,说明对细胞尚 无直接杀伤作用.但随着药物浓度升高,吸光值进一步下降, 说明高浓度时药物对细胞有杀伤作用,且无毒性作用.结合 药物对细胞生张曲线的作用,说明1.Om~ml丹参素对成纤 维细胞有抑制作用.从细胞周期的分布来看,丹参素在浓度 1.0mg/ml作用时,GO.G1期相对减少,G2.M期分布增多,细 胞周期受阻于G2期,我们推测丹参素的抑制作用很可能是 在细胞周期进行的调节过程中抑制CyclinB(调节亚基周期 素B)在G2期末与催化亚基结合,使p34ede蛋白激酶失活, 能构成M期启动因子,抑制G2一M期的转折,即主要是通 过抑制细胞的有丝分裂来完成的,也有可能是通过抑制 NF—KB活性来调节细胞生长周期l圳. 从上述观测的结果可以看出,丹参素促进伤口愈合并非 直接促进成纤维细胞增殖而发挥作用,很有可能是通过其改 善微循环,改变伤口局部微环境,提供能量代谤十物质,促进代 谢产物的清除而发挥作用.当然,因为具有抑制肉芽组织中 成纤维细胞增殖的功能,故在伤口愈合早期用药量需要控 制,而在伤口愈合后则可加大其剂量以便抑制成纤维细胞的 过度增殖,防止瘢痕形成. 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