氨基甲酸酯类农药的快速检测

氨基甲酸酯类农药的快速检测 《现代食品科技》ModernFoodScienceandTechnologyVo1.22No.2(总88) 文章篇号:1007—2764(2006)02—0229—081 氨基甲酸酯类农药的快速检测 张淑平,经媛元,单联刚 (上海水产大学食品学院,上海200090) 摘要:综述了氨基甲酸酯类农药快速分析方法的研究进展,并对其种 类原理进行了比较. 关键词:氨基甲酸酯类;农药残留;快速分析方法 TheRapidAnalysisofCarbamateResidual ZhangShu?ping,JinYuan-yan,ShanLian-gang rCollegeofFoodScienceandTechnology,SFU,Shanghai200090,China) Abstract:Inthispaper,therapidanalyticalmethodsforcarbamatepestcideresidualaresummarizedandcompared,involving spectrophotometry,biosensor,immunoassayandsomeothermethods. Keywords:Carbamate;Pesticideresidues;Rapidanalyticalmethods 自20世纪70年代以来,由于有机氯农药受到禁用 或限制使用,以及抗有机磷杀虫剂的昆虫品种日益增 多,因而氨基甲酸酯类农药的用量逐年增加,这就使 得氨基甲酸酯类农药的分析检测倍受关注.对于不同 介质(如水,土壤,水果,蔬菜等)中氨甲酸酯类农药 及其代谢产物的测定已经发展了很多的分析方法.如 液相色谱法,柱后水解电化学库仑法等,由于其前处 理烦琐或设备昂贵不太适用于目前国内的现状;从而 也发展了很多快速检测的方法.本文主要介绍氨基甲 酸酯类农药快速检测方法的研究进展. 1比色分析法 利用氨基甲酸酯类农药对乙酰胆碱酯酶和羧酸酯 酶的特异性抑制作用发展的酶化学比色分析法已广泛 应用于痕量和微量农药残留的检测.其原理是氨基甲 酸酯类农药对乙酰胆碱酯酶和羧酸酯酶都有强抑制作 用,所以用比色法测定反应产物和显色剂反应后的颜 色,即可检测氨基甲酸酯类农残.该方法的检出限大 多在meJkg水平,有的可达ug/kg水平. 黄文风等”以碘化硫代乙酰胆碱为底物,在乙酰 胆碱酯酶(AchE)催化下,分解生成碘化硫代胆碱, 能与DTNB作用生成5一巯基一2一硝基苯甲酸(黄色)再于 特征波长处测定溶液的吸光度,根据其变化显示酶抑 制程度,从而知道样品受农药的污染程度.此方法对 十六种农药进行了检测,效果较好.杨东鹏等为了 缩短检测时间对抑制时间为lOmin时的最适条件进行 收稿日期:2005-09-29 了研究.提出了新的最适条件确定,从而确定了 新的检测结果判断标准.但由于乙酰胆碱酯酶来源于 动物体,材料昂贵,且保存困难,近年来发展了用植 物酯酶代替乙酰胆碱酯酶的分析方法,该法利用植物 酯酶水解2,6一二氯乙酰靛酚,根据反应溶液在水解前 后颜色的变化,辨别农药对酶的抑制程度.钟树明 等应用植物酶抑制技术检测蔬菜中的氨基甲酸酯类农 药,取得了一定的成果,并根据有关标准提出了抑制 率阈值.比色分析法为定性分析提供了一种快捷简便 的方法,但对氨基甲酸酯类农药的精确定量分析有一 定的局限. 2酶片法 酶片即为浸渍有胆碱酯酶或其它敏感酶类的滤纸 片或类似载体物质,根据纸片的颜色变化来反映酶活 性受氨基甲酸酯类农药抑制的程度.这种简单的载体 作用,可以达到便于携带和现场操作的目的.王林等 人用固化有胆碱酯酶和靛酚乙酸酯试剂的试纸片建 立了适合我国蔬菜中部分农药残留限量的现场监督检 测的速测卡法,检出限一般在0.3—3.5mg/kg,检出时 间为15min,操作简单,速度快,测试成本低廉.宋 茹等人以酶抑制法为依据,研究了一种成本低廉, 适用范围广,灵敏度高,可以作定性及半定量分析的 酶片快速检测法.以马血清中的乙酰胆碱酯酶与底物 氯化乙酰胆碱作用生成醋酸,根据反应前后的pH值变 化及根据指示剂的颜色变化情况判断氨基甲酸酯类农 药的抑制程度及残留量.应用于实际情况检测中黄瓜 229 《现代食品科技》ModernFoodScienceandTechnologyVo1.22No.2(总SS) 的效果较好.与气相色谱法比较也足以用于实际检测. 但酶片法会常遇到酶活性和灵敏度降低,测不出超标 农药的现象,有时甚至还会产生假阳性. 3生物传感器 生物活性单元的固定化技术是生物传感器制作的 核心部分,它既要保持生物活性单元的固有特性,又 要避免自由活性单元应用上的缺陷.生物活性单元的 固定化技术决定着生物传感器的稳定性,灵敏度和选 择性等主要性能,也决定着生物传感器是否有研究和 应用价值.早期的生物活性物质测量法,如酶分析法, 是在水溶液状态下进行的,由于酶在水溶液中一般不 太稳定,且酶只能和底物作用一次,因此使用起来很 不方便.要使酶作为生物敏感膜使用,必须研究如何 将酶固定在各种载体上,这称为酶的固定化技术. 固定化酶是指通过化学或物理学手段将酶束缚在 一 定区间内,限制酶分子在此区间内进行活跃的催化 作用.固定化酶技术是酶学研究中的新领域.通过酶 的固定化技术,可以极大改善酶对热,强酸,强碱, 有机溶剂等不够稳定的性质,并且在反应结束后,很 容易将酶与反应液分开,同时酶也可以多次使用,极 大地提高了酶的使用效率.酶的固定化技术在60年代 以后得到广泛重视和积极研究,部分固定化酶已获大 规模工业化应用.目前固定化酶技术的应用多局限于 单级酶反应方面,而对一些复合酶,多级酶反应的固 定化研究将更有意义.因为酶在细胞中的定位通常是 一 个多酶体系,酶与酶之间往往是前一个酶的反应产 物就是下一个酶的反应底物,酶在此细胞环境中才能 发挥最大催化效率. 常用的固定化技术有四种:吸附法,共价法,交 联法,包埋法. 吸附法:吸附法是最简单,最具经济吸引力的方 法,操作简单,可供选择的载体类型多,吸附过程可 以同时达到纯化和固定化的目的,且酶失活后可重新 活化再生.分为物理吸附法和离子交换吸附法.常用 载体有无机载体,有机载体,有机大分子物质等. 包埋法:包埋法是将酶物理包埋在多聚物内的一 种方法,反应条件温和,便宜,简便.分为凝胶包埋 法和微囊化法(界面聚合法,分相法,流体干燥法,流 膜法).常用包埋载体有聚丙酞胺,淀粉,聚乙烯醇, 海藻酸盐,胶原,明胶等. 载体偶联法:将酶分子的必需基团经共价健与载 体结合的方法,又称共价法.载体含功能基团:芳香氨 基,羟基,羧基,羧甲基,氨基等,是研究中最活跃 的一类方法. 交联法:利用双功能或多功能试剂,使酶分子之间 或酶蛋白与其它惰性蛋白之间发生交联,凝聚成网状 结构,对酶进行固定.戊二醛是应用最广泛的双功能 试剂. 没有一种固定化方法能普遍适用于每一种酶.寻 找合适的固定化方法和选择相应的载体是酶固定化研 究的重点.一方面载体和酶要尽可能在温和条件下操 作,另一方面要使操作相对简单,成本相对低廉,还 要保证酶活.酶经过固定后,可用测定以下参数来判 断固定化方法的优劣以及所得固定化酶的实用性:固 定化酶的活力,固定化酶的活力回收,固定化酶的半 衰期.而目前的固定化酶研究中要么酶活不高,操作 半衰期不够长,要么成本过高,不符合大工业生产的 要求. 纵观生物传感器发展的历史可知,生物传感器的 发展史就是固定化技术不断改进和完善的历史,固定 化技术的研究就是对固定化方法和生物活性载体的研 究和开发.目前使用的固定化载体,方法或技术存在 着这样或那样的问题,难于从根本上提高生物传感器 的稳定性,选择性,灵敏度,准确度和响应速度等性 能.因此,使用更简单,更实用的新型固定化技术和 性能更优异的载体材料以促进固定化生物活性单元获 得更多的实际应用仍是该领域今后研究的重要方向之 O 用于氨基甲酸酯类残留分析的生物传感器是基于 乙酰胆碱酯酶被一种或几种分析物的抑制作用的检 测,生物敏感层是利用酶的固定化方法将特异性酶与 载体结合在一起,因此可以反复使用.这种生物传感 器的类型一般包括电位型和安培型两种.乙酰胆碱在 酶的催化作用下可以水解为乙酸和胆碱,乙酸进一步 电离,从而使溶液pH值发生变化,由此可设计成电位 型酶电极;如在上面的反应中以硫代胆碱代替乙酰胆 碱,生成的巯基胆碱则可在Pt,玻碳等电极表面氧化, 据此可设计成安培型酶电极.朱玲,安哲等用尼龙网 共价键合法固定胆碱氧化酶与氧电极偶合制成传感 器.并采用将乙酰胆碱酯酶溶于溶液中的双酶体系测 定氨基甲酸酯类农药,实际测定了水体中农药残留量, 结果较为满意.目前生物传感器技术在农药中的应用 大多还停留在实验阶段,尚未形成产品应用于实际测 定中,因此加强该方面的研究是必不可少的. 4免疫检测 农药及其代谢物的酶免疫分析是9O年代的一项新 《现代食品科技》ModemFood~ienceand1khn0l0gyv0I.22No.2(总懿) 技术,具有快速,灵敏,费用低,特异性强和适于现 场大批量样品筛选等优点.联合国粮农组织(FAO) 已向许多国家推荐此技术,美国化学会将免疫分析和 气相色谱,液相色谱列为农药残留分析的支柱技术. 农药残留酶免疫测定技术(EIA),是生物酶技术, 免疫分析技术应用于农药残留分析领域的一门新技 术,主要是依据抗原和抗体之间的特异性识别和结合 反应来进行的.此方法的关键就是要制备高效价特异 性的抗体,以提高检测的特异性和灵敏度.为揭示微 量抗原与抗体的免疫学反应进行情况,需要引人一种 酶作为示踪物,常用的为辣根过氧化酶等随着EIA的稳 定性和灵敏度不断改善,自1983年以来,农药分析中 几乎都使用此法尤其是酶联免疫吸附剂测定法(ELISA) 使用最广泛,现己成为首选的方法,该技术虽然开发 难度和投资都较大,但具有快速,灵敏,特异性强, 价廉,不需烦琐的预处理,可现场操作,不需专门操 作人员等优点,因此越来越受到重视.近年来,免疫 检测技术已广泛应用于氨基甲酸酯类农药残留的检 测. 一 般而言,具有免疫原性的物质分子量应大于1.0 ×104Da,而一般农药的分子量小于1.0×103Da,不具备 刺激机体产生针对农药抗原决定簇的特异性抗体,因 此必须与大分子载体偶联后才具有免疫原性.要实现 与大分子物质的偶联,半抗原分子上必须具备能共价 结合到载体上的一个活性基团(如氨基,羧基,羟基 和巯基等).然后再进行免疫,抗原与抗体之间的反 应无论在体内,体外均可特异性的进行,这是EIA得以 实现的保证. 由于氨基甲酸酯类农药多为低分子量的小分子, 必须与载体结合(如蛋白质)形成抗原,才能免疫兔, 羊等动物使机体产生抗农药的抗体,并取其免疫动物 血清,然后进行分离,鉴定其特异性抗体.抗体的产 生一般可采用两种途径:多克隆抗体技术和杂交瘤技 术生产单抗,再通过被测定物与特定抗体之间相互作 用,进行定性定量测定. 氨基甲酸酯类农药免疫检测发展也很迅速,且多 采用克隆抗体技术,~IItakfg]等人用抗体磁颗粒ELISA 法检测水中的西维因,此技术可使颗粒均匀地分布在 反应混合物中,检测限为0.22,0.25ugm,且与液相色谱 (LC)检测结果有极好的相关性.应用该技术还可以 检测水,果汁和土壤中的多菌灵(苯菌灵的酸分解物), 涕灭威等.Lehot),等应用利用酶免疫检测技术生产的 一 种商品试剂盒测定了肉和肝样品中的呋喃丹和涕灭 威砜.另外,有报道肉样品中的呋喃丹和其他农药经 过SFE提取后采用磁性颗粒酶免疫检测法检测….我国 的研究者也自行开发了许多免疫检测方法,胡秀卿, 朱国念等纠通过活化酯法与牛血清蛋白联接,制备出 较高活性的人工抗原,以此来免疫兔子制备抗克百威 的多克隆抗体.该方法对克百威标准品的最低标准量 为0.175ng/ml,线性检测范围为0.256—4000.0ng/ml, 在线性检测范围内,添加不同浓度克百威的蔬菜样品 检测的批内,批间变异系数均小于10%,在甘蓝菜样 品中的添加回收率试验回收率为93.096,变异系数为 4.3%.所得克百威抗体特异性强,与丁硫克百威的交 又反应率为9.15,与呋喃酚的交叉反应率为5.29,与 供试的其它3种氨基甲酸酯类的交叉反应率均小于 0.5.然后在获得人工抗原后经免疫兔子获得了高效价 的抗克百威抗体. 刘曙照等人成功地合成了克百威,西维因的 人工抗原,并在免疫兔子体内获得对克百威,西维因 具特异性的高效价抗体,建立并优化了痕量克百威, 西维因的竞争性酶联免疫吸附检测法,该法测定克百 威的线性浓度范围为l0(L_l04ul1L检测限低于 0.01n~mL,测定西维因的线性浓度范围为l0u_lOr4 ug/InL,检测限低于0.01n~mL. 多克隆抗体方法具有生产成本低,方法简便等特 点,但是其抗体的特异性不够强,会随着动物种类及 个体差异而有变化,从而在一定程度上限制了其在免 疫检测中的应用.随着单克隆抗体技术的日渐成熟, 该技术己成为ELISA在农药残留速测技术中应用发展 的新趋势.单克隆抗体是作用于同一抗原决定簇的, 完全均一的单一抗体,不易产生交叉反应,使检测具 有很高的特异性.由于氨基甲酸酯农药是一种小分子, 是一种半抗原,无免疫原性,所以要根据农药的结构 选择合成路线,人工合成抗原,将免疫抗原免疫实验 用鼠,一般为BALB,c小鼠,然后取免疫鼠脾细胞(B淋 巴细胞)与骨髓瘤细胞杂交,并进行克隆化繁殖培养, 最后筛选出能稳定分泌产生特异性抗农药的单克隆抗 体的细胞株,并分离鉴定其产生的特异性抗体,测定 其效价,再进行体外一定环境条件下的繁殖培养,生 产出单克隆抗体.用于农药免疫监测. Abad等用西维因与牛血清蛋白结合免疫小鼠, 制备了单克隆抗体,同时制备多抗血清进行比较,用 竞争和非竞争EUSA法检测西维因,西维因单克隆抗体 与几种N一甲基氨基甲酸酯及西维因主要代谢产物萘酚 无交叉反应,西维因多抗血清与萘酚交叉反应达12%. 随后,Abad等在对西维因结构分析的基础上,用不同 载体蛋白制备单克隆抗体和多克隆抗体,发现其灵敏 《现代食品科技》ModernFoodScienceandTechnologyVo1.22No.2(总88) 性和特异性不受载体蛋白的影响,单克隆抗体技术具 有极好的特异性和灵敏性,用之检测水样,检测限达 0.01ug/L,而西维因的主要代谢物萘酚却没有检出, 再次证明单克隆抗体技术是水中低含量西维因免疫分 析的理想方法.单克隆抗体技术是由单一的B淋巴细胞 克隆,针对单一的抗原决定簇产生的均一的免疫球蛋 白,具有理化性质高度均一,生物活性单一,与抗原 结合的特异性和亲和力高等优点,因此比多克隆抗体 技术更适于各类农药的免疫检测.虽然单克隆抗体在 农药免疫分析中已显示出明显的优越性,但仍存在一 些不足,主要表现为抗体制备过程复杂麻烦,假阴性 和假阳性偏多,有的单克隆抗体在进行检测时存在一 定的交叉反应,只能检测一类结构相似的化合物,样 品的一些成分对检测结果干扰大,一次实验仅能检测 一 种农药残留等”.随着免疫分析技术的快速发展, 免疫分析中存在的问题正在或将会很快得到解决.如 分析农药小分子的结构,深入探讨其抗原决定簇的位 置,通过化学方法封闭或突出某个(某些)特定的抗 原决定簇,就可以制备该决定簇的特异性抗体,以增 加检测的特异性,避免交叉反应;而免疫学技术和 其他技术相互结合,也能发挥各种技术的优势.近年 来,国内外已经开发出杀虫剂,杀菌剂,除草剂等40 余种农药的酶免疫分析方法.其中用于田问快速筛选 的酶免疫分析试剂盒已商品化,在现场1h可完成16个 样品的测试,且具有特异性强,灵敏度高(检测限可 达10’9__一10g),分析容量大,分析成本相对较低等特 点,配备一台便携式分光光度计,可以实现定量的目 标.测试结果与常规方法比较一致,但不需要费时的 样品抽提,净化,使用溶剂量少,方法不需要经过培 训就可以掌握.免疫分析具有上述如许多突出的优点, 因此越来越受到人们的重视,新成果不断推出,从而 测定方法也越来越完善.这种学科交叉技术应用于农 药残留分析将成为世界各国的学术研究和开发研究的 新热点. 5小结 随着有机磷农药的禁用,氨基甲酸酯类农药用量 的不断增加,氨基甲酸酯类农药残留的分析检测方法 也越来越受到大家的关注.氨甲酸酯类农药及其代谢 产物的测定已经发展了很多的分析方法.这类农药的 测定由于热稳定性差多采用液相色谱法,但它的前处 理繁琐,测定周期长,测定成本高限制了它的使用范 围.基于酶抑制技术的快速检测分析方法已发展了多 种检测技术,但灵敏度方面还有待提高.生物传感器法 232 和酶免疫分析法对氨基甲酸酯类农药的检测还有很大 的研究空间.目前各种方法均有各自的优点,但同时 也不同程度地存在不足,在实际应用中应根据实际条 件和研究需要选择相应的检测技术. 参考文献 …1黄文风,蔡琪等.酶催化动力学光度法快速测定蔬菜中农 药残留毒性[J]..现代科学仪器,2000,(2):29.32. 【212杨东鹏,等,酶抑制分光光度法检测蔬菜上的有机磷和氨 基甲酸酯类农药残留的方法的研究[J】.中国农学通报, 61. 2004,20(4):58— 【3】钟树明,等.植物酶抑制技术用于检测蔬菜中有机磷及氨基 甲酸酯类农药残留fJ】.环境化学,2002,21(2):189.193. 【41王林,等.蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留量的快速 检测方法研究【J】.中国食品卫生杂志,2003,15(1):39-41. 【5】宋茹,等.蔬菜中有机磷及氨基甲酸酯类农药残留酶片快 速检测法的评价.食品研究与开发,2004,25(2):119-121 【6】朱玲,安哲.测定氨基甲酸酯类农药生物传感器的研制.中 国卫生检验杂志,2002,12(2):154-155 【7】ConawahJE.JAssocoffAnalChem,1991,74(5):715 【8】JungFreis.PesticideSci,1959,26(303):317 【9】ItakJA,eta1.Validationofparamagneticparticlebased ELISAforthequantitativedeterminationofcarbarvlin water[J].BullEnvironContamToxicol,1993,51:260-267. 【10】LehotaySJandAgruerRJ.DetectionofAldicarbsulfoneand CarbofuraninFortifiedMeatandLiverwithCommercial ELISAKitsafterRapidEstraction【J】.AgriFoodChem,1993, 41:2006-2010. 【11】NamKSandKingJW.SupercriticalFluidExtractionand EnzymeIntmunoassayforPesticideDetectioninMeat Products[J].JAgricFoodChem,1994.42:1469—1474. 【l2】胡秀卿朱国念等.克百威残留放射免疫分析方法研究【J】_ 核农.2002,16(5):320-324 【l3】刘曙照,冯大和,等.对克百威具高度特异性的免疫分析技 术研究【J】_分析科学,2000,16(5):373—378. 【l4】刘曙照,冯大和,钱传范.甲萘威酶联免疫吸附分析技术研 究fJ】.农药学,1999,1(1):62—68. 【15】王刚垛.单克隆抗体在农药免疫分析中的应用进展[J】.中华 劳动卫生职业病杂志,1998,16(6):368.370. 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