定量DNA和IgM抗体检测CMV感染

定量DNA和IgM抗体检测CMV感染 定量DNA和IgM抗体检测CMV感染 _ 中国优生与遗传杂志2002第l0卷第6期?41? 定量DNA和IgM抗体检测CMV感染 牛艾茹陈培佳张桦王丹郭力 (天津市儿童医院,300074) 摘要:目的了解不同疾病患儿活动性巨细胞病毒(CMV)感染情况,方法采用荧光定量PcR法和IgM反向捕捉法 分别对994例住院患儿进行检测.结果CMVDNA的阳性检出率2o.1%,IgM阳性检出率8.9%.两项共同检测了45例,共 同阳性检出率55.5%,单做某一项其阳性检出率分别有13.3%和22.5%漏检.结论 分别从病毒病原学和血 应用两种方法, 清学两个不同角度检测CMV活动性感染,不仅在一定程度上提高CMV的诊断率,也有利于I临床病毒在机体内不同时期 的感染情况. 关键词i巨细胞病毒;荧光定量PER;感染 巨细胞病毒(CMV)可引起先天性和后天性感染.在我 国儿童,特别是婴幼儿中多见.其感染情况在临床多样,可 引起溶血性黄疸,肝炎,各种畸形和视听神经的损害,肺炎, 传单,淋巴结炎和包涵体病,免疫低下的甚至可引起多脏器 损害….确切诊断以便早期治疗一直是临床医疗工作的努 力方向. 我们应用荧光定量PER技术和反向捕捉IgM方法对 2OO2年住院患儿进行CMV病原学和血清学双项检测,以便 临床更好地做出活动性CMV感染的诊断,进行积极治疗. 资料与方法 1.资料 荧光定量PER试剂盒(中山大学达安基因公司). EIJSA反向捕捉法I试剂盒(天津赛达生物技术研究所) 2.检测对象 2002年1—9月住院患儿994例,年龄从出生一l2岁. 疾病包括:新生儿黄疸,肺炎,肝炎,淋巴结炎,传单,血尿,发 热待查,肾病及白血病等. 3.方法 IgM抗体:按EIASA法操作(方法略),450rim测0D值? 2.1为阳性.DNA定量:离心尿液制.在PE5700全自动 分析仪内进行,PER条件:93?45s,55%60s,10循环;93? 30s,55~C60s,30循环.设l02,lO3,lO4,lO病毒阳性对照为标 准品.且Ct值<27. 结果 从2OO2年1—9月,分别检测血CMVIgM抗体746例,阳 性66例,定量PER检测尿中CMVDNA248例,阳性50例. 两项检测分别独自完成(临床根据需要和家属承受能力送 检),避免人为分组.从中统计出同时做两种检测的45例. 其结果血+/尿+9例,血+/尿一l0例,血一/尿+6例,血 一 /尿一20例,对l4例的尿(+)的选两例做血清PER检测 结果(一).且多数病例多次做尿检测,其DNA含量随着治 疗的进行逐渐减少,出院后在门诊复查,有的下降为零. IgM抗体的阳性检出率8.9%(66/746),DNA含量阳性 的阳性检出率20.1%(50/2d8). 45例双项检测其阳性检出率55.5%(25/45),其中单独 IgM阳性检出率42.2%(19/45),单独尿DNA阳性检出率 33.3%(15/45),而单独测IgM将有13.3%(6/45)病例被漏 检,单做PER,将有22.2%(10/45)病例未被检测到.(45例 的阳性多,不排除临床高度怀疑因而多方送检的人为因素). 讨论 病毒分离或组织细胞中CMV阳性是最可靠的诊断活动 性CMV感染指标,但临床工作实际做到却很难.我们用荧 光定量PER技术,不仅敏感性较高,因其是在机器内DNA扩 增和检测一次性完成,又可避免污染.定量PER可以从拷 贝数量直观了解CMV感染程度,从分子水平上监测CMV感 染情况及抗病毒治疗的疗效.且病毒的噬上皮细胞特性,使 其易于感染在肾脏细胞内.因此,查尿中CMVDNA,可知其 复制,排毒情况-2.3J.而抗人链反向捕捉法测CMVIgM抗 体,既可以作为活动性感染指标.又可避免类风湿因子干扰 所致的假阳性. 两项检测从不同角度,尽可能多的检测出CMV感染,从 结果看到,两者的联合检测的阳性大于单独做某一项的阳 性,双项检测将避免因实验而致的病例漏诊. 同时从抗原和抗体两方面检测活动性CMV感染,可帮 助分析病毒存在的情况.45例中抗体阳性且DNA含量阳 性,既是发病早期又是活动产毒期.说明大量病毒在体内活 动应积极治疗.抗体阳性,尿中DNA阴性.说明在病毒感 染早期,已有机体发生免疫抗体反应.但病毒未能大量繁殖 或还未侵入肾脏.IgM阴性,尿DNA阳性,考虑急性的早期 感染期已过,抗体在血中的滴度已下降,而病毒却在机体内 不断产毒或是在经历潜伏期后,人体抵抗力低下时,又出现 病毒活动. 因此定量PER检测定量DNA和反向捕捉法测IgM抗体 联合应用,既能减少因检测手段导致的漏检情况,又有助于 了解分析病人病毒感染的发病时期情况,因此这两种方法相 结合是诊断活动性CMV感染的较好的指标.通过病原学和 血清学的双项检测.为临床提供CMV活动性感染的诊断依 据,利于早期及时治疗和了解预后. (下转第40页) l ? 40?中国优生与遗传杂志2002第1O卷第6期 产青霉素酶淋病奈瑟菌的基因检测 王新红曹佩霞黄瑞萍郑亚芬汤韧程晓京(常州市妇幼保健院,213003) 摘要:目的了解常州地区产青霉素酶淋病奈瑟茵(penieillinase—producingNeisseriagonorrhoeae,PPNG)在淋病奈瑟 茵中的构成比.方法用套式聚合酶链反应(ne8tedynrasedrainreaction,nPcR)对分离自常州地区的81株淋病奈瑟茵进 行PPNG特有耐药基因检测.结果81株淋病奈瑟茵中有62株检出耐药基因,即PPNG已占淋病奈瑟茵总数的76.5%.结 论常州不仅存在PPNG,而且已构成流行. 关键词:淋病奈瑟茵;耐药;基因检测 producingNeisse. 产青霉素酶淋病奈瑟菌(penicillinase— riagonorrhoeae,PPNG)即为对青霉素耐药的淋病奈瑟菌,为 获得含TEM一1质粒基因所致.近年来,国内各地均有淋病 奈瑟菌耐青霉素表型的报道.为了解常州地区PPNG在淋 病奈瑟菌中的构成比,我们应用套式聚合酶链反应(nested p0lyITlerasechainreaction,nPCR)对81株淋病奈瑟菌进行了 TEM一1质粒基因检测,现将结果如下. 材料与方法 1.淋病奈瑟菌菌株:81株均为2001年1O月2002年5月 本院检验科分离到的菌株.菌体裂解为蛋白酶K消化法. 2.PPNGTEM一1质粒基因检测:为套式聚合酶链反应 法.外套引物P】为5'一AGTI'ATCTACACGACGG一3',P, 为5'一GGCGTACTATICACTCT一3';内套引物P3同Pl,P4 为5'一TrGAAGAAGTrGCAATrGC从ACGGCCAGT一3'. 试剂盒由无锡市克隆遗传技术研究所提供,完全按说明操 作. 3.PPNGTEM一1基因I1PcR产物测序:为双脱氧末端终 止法.测序引物为P1(P3). 结果 8l株淋病奈瑟菌经PPNGTEM一1质粒基因检测有62 例为阳性,阳性率76.5%.随机抽取1例nPGR产物进行了 DNA序列测定,其序列与已在NCBI登录的3株PPNG质粒 序列高度同源(98.O%一99.5%).该3株菌的基因信息号为 si:150362,si:1777422,si:1777428. 讨论 PPNG自1976年从菲律宾首次发现以来,目前世界各地 均有报道.近年来,国外学者应用PCR直接测序和分析PP. NG的耐药相关基因.2J.但国内仍局限于PPNG的表型和 质粒谱分析-30J.我们应用PPNG特有的TEM一1基因nPCR 阳性率达 检测发现,81株淋病奈瑟菌中62例存在耐药基因,76.5%.该81株菌为2001年1O月2002年5月在常州地区 分离出.在检测过程中并发现阳性率逐渐升高的现象,该 81株的前5O株中有32株阳性(阳性率64%),而后31株中 有30株阳性(阳性率96.8%),二者在统计学上有明显差异( P<0.01).质粒介导的耐药可以由接合和转化的方式进 行传播,蔓延迅速.我们随机抽取1例nPCR产物进行了 DNA序列测定,其结果与已在美国NCBI登录的3株PPNG 之序列高度同源.本研究提示,PPNG已是常州地区的流行 菌株.根据以往的淋病奈瑟菌耐药表型报道,PPNG菌大多 数同时还耐四环素和喹诺酮类抗生素-30J.因而PPNG感染 的治疗应选用青霉素,四环素,喹诺酮以外的敏感抗生素. 参考文献 [1]DillonJR,LiH,YeungKH,eta1.APCRassayfordiscriminating Neisseriagonotrhoeaebeta—laclamase—producingplasmids.MolCell Pr0b?,1999,13(2):89—92 [2]PagottoF,AmanAT,NSIK,eta1.Smuen~analysisofthefamilyof penicillinase—producingplasmidsofNeisseriagonorrhoeae.Plasmid, 2oCO.43(1):13—19 [3]向辉,雍刚,叶梅君,等.产青霉素酶的48株淋病奈瑟菌的耐药 性,质粒特征及酶切分析.中华微生物学和免疫学杂志,1999,19 (6):455—458 [4]邓艳,张宁,陆洪光.等.贵阳市淋球菌耐药质粒及其淋病流行 的关系.中国皮肤性病学杂志,2001,15(6):392—395 收稿日期:2002—06—28 (上接第41页) 参考文献 [1]方峰,等.巨细胞和巨细胞病毒感染的诊断.中华儿科杂志,1999, 37(7):397 [23WeinbengA.et81.ComparisonofPCRantigenemiaassay,andre~d bloodculturefordetectionandpreventionofcytomegalowvirusdlse8seaf. terlungtransplantation.JFAinMiGTO,2000,38:768—772 [3]EckantP,et81.Detectionofhmnancytomegalowvirusinrenalfransplanta- tion:~ionoffourdiagnosticmethods:DNAin嗍abpolymerase chainm8cti?(PcR)DNAinleukocytehyPCR,PP65leukocyticantil~en- aTliaanduim-aia,:TransplantProcl997.29:2387—2389 收稿日期:2002—1O一29