人力资源实验一,半定量RT-PCR检测切割穹窿海马伞大鼠海马内

人力资源实验一,半定量RT-PCR检测切割穹窿海马伞大鼠海马内 实验一、 半定量RT-PCR检测切割穹窿海马伞大鼠海马内 Brn-4 mRNA的表达变化 本实验应用立体定位技术切割大鼠穹窿海马伞，取切割后1、3、7、14、21和28d海马组织和正常海马组织，制备提取液，然后应用半定量RT-PCR技术检测Brn-4 mRNA的表达，与正常海马组织比较，观察切割后各时相点海马组织中Brn-4 mRNA的表达变化。 材料和方法 1 实验材料 1.1实验动物: 健康成年SD大鼠，体重220~250g，雌雄不拘，由南通大学实验动物中心提供。 1.2试剂及溶液的配制: (1) Trizol Reagent(BBI公司) (2) DEPC(SIGMA公司) (3) 逆转录试剂盒(MBI公司) (4) Taq DNA polymerase(MBI公司) (5) dNTP mix(MBI公司) (6) DL-2000 DNA Maker(TAKARA公司) (7) 琼脂糖(Pharmacia公司) (8) 溴化乙锭(SIGMA公司) (9) Chlorpent复合麻醉剂:水合氯醛4.25g，MgSO2.12g，戊巴比妥4 钠886mg，无水乙醇14.25ml，丙二醇33.8ml，加ddHO至100ml。2 (10)DEPC水:1000 ml双蒸水中加入DEPC 1ml，充分振荡，37?孵 育过夜，高压灭菌20 min，4?保存备用。 (11) 5×TBE:Tris 54g，硼酸27.5g，EDTA4.65g，加ddHO至1000ml。 2 使用时1:10稀释为0.5×TBE工作液。 (12)6×上样缓冲液:溴酚蓝0.25g溶于30%甘油100ml，分装小管， 4?储存。 (13)琼脂糖凝胶:根据待测DNA分子大小，选择适当浓度的琼脂糖 浓度，用0.5×TBE缓冲液配置。 (14)EB染液(10mg/ml):溴化乙锭1.0g，加ddHO至100ml，4?避光2 保存。 (15)5×甲醛凝胶电泳缓冲液:取20.6g丙磺酸溶于800ml DEPC处理 的50mmol/L的乙酸钠溶液中，用氢氧化钠调pH至7.0，加10ml DEPC处理的0.5mol/L EDTA(pH8.0)，最后加DEPC处理水至 溶液总体积为1L。 (16)甲醛凝胶上样缓冲液:甲酰胺0.75ml，甲醛0.24ml，5×甲醛凝 胶加样缓冲液0.3ml，甘油0.15ml，溴酚蓝0.05ml，置-20?保存。 1.3实验仪器: (1) 恒温水浴锅 (上海华联环境试验设备公司) (2) 低温冷冻离心机 (德国Beckman公司) (3) PCR仪 (MJ Research公司) (4) DYY—10型(ECP3000)三恒电泳仪(北京市六一仪器厂) (5) 捷达801系列形态学系统(江苏省捷达科技发展有限公司) (6) 蛋白核酸测定仪(Eppendorf公司) (7) 立体定位仪(上海江湾?型C) 2 实验方法 2.1实验动物分组 取SD大鼠42只，随机分成7组，设其中1组为正常对照组，其余6组分别为穹窿海马伞切割手术后1、3、7、14、21和28d组，每组6只。 2.2切割双侧穹窿海马伞 取220~250g SD大鼠，腹腔注射复合麻醉剂Chlorpent 0.2ml/100g。动物麻醉后，固定于立体定位仪上，颅顶部剪毛，碘酒和酒精消毒后，无菌条件下切开皮肤，分离颅骨外骨膜，显露前囟，记录前囟A(矢状轴)、L(冠状轴)、V(垂直轴)的坐标，参照Paxinos图谱确定双侧穹窿海马伞的切割范围，先在颅骨上确定右侧两点即?A=A,1.4、L,L11 ,1和?A,A,1.4、L,L,4;左侧两点即?A=A,1.4 、L,L，12233和?A,A,1.4、L,L，4，每点各钻一小孔，用刀片将右侧?和?、44 左侧?和?点间颅骨划开一条骨缝，将针刀插入脑内至切割深度即V,1 ,V+5.4，来回切割3次，退出针刀，待无颅内出血后用骨蜡封闭骨,2,34 缝，缝合皮肤，肌注青霉素，按性别分笼饲养。 2.3海马总RNA的提取 (1) 将正常组及手术后各组大鼠用Chlorpent复合麻醉剂腹腔注射麻 醉，无菌条件下剥去颅骨和硬脑膜，再去除大脑皮质和胼胝体， 暴露两侧海马，证实两侧穹窿海马伞被切断后，取出两侧海马组 织(约50mg/只)。 (2) 将取出的海马置2ml匀浆器中，加入1ml Trizol试剂，置冰上充分匀 浆，室温置5min，转入1.5ml离心管; (3) 加入200μl氯仿，剧烈震荡混匀30sec; (4) 室温12000rpm离心5min; (5) 转移上清到1.5ml离心管中，加入500μl异丙醇，室温放置5min; (6) 室温12000rpm离心5min，小心移去上清; (7) 加700μl 70%乙醇洗涤两次，12000rpm离心2min，弃上清。 (8) 室温干燥使乙醇完全挥发，沉淀用50μl DEPC水溶解(65?促溶 15min)。 2.4总RNA含量分析 取总RNA 1μl加入到99μl DEPC水中稀释，用蛋白核酸测定仪检测浓度及OD/OD值，计算总RNA浓度，并鉴定RNA的纯度。260280 2.5 RNA甲醛变性凝胶电泳 (1) 甲醛变性凝胶的配置:适量琼脂糖溶于1×甲醛电泳缓冲液 (pH6.9~7.0)，至终浓度1,。微波炉溶解琼脂糖，然后冷却至 50~60?。将37,甲醛溶液(12.33mol/L)加入凝胶溶液，至终浓 度0.32mol/L，加2μl EB染液，混匀倒入制胶盘中(制胶盘约30ml)， 插好梳子，待凝胶凝固1h。 (2) 在EP管中，将RNA样品与上样缓冲液混合。70?水浴变性15min， 立即冰浴10min，使RNA变性，1200rpm离心5sec，使液体全部 沉积在EP管底。 (3) 将凝胶浸入1×甲醛凝胶电泳缓冲液中，加样前将凝胶预电泳 5min。 (4) 将样品加至凝胶加样孔，5V/cm电压下进行电泳2h。 (5) 在紫外透射仪中进行检测，将合格的RNA样品挑选出来。 2.6 第一链cDNA的合成 (1) 取0.5ml EP管置于冰上，加入下列反应物: 总RNA 2μl Oligo dT(0.5μg/μl) 1μl DEPC水 加至12μl (2) 轻轻混匀，离心3~5sec。 (3) 70?加热5min立即将EP管插入冰中30sec，短暂离心收集液滴。 (4) 将EP管置于冰上，依次加入: 5×reaction buffer 4μl RNase inhibitor(20U/μl) 1μl dNTP mix(10mmol/L) 2μl (5) 轻轻混匀，稍加离心。 (6) 37?孵育5min，加入M-MLV逆转录酶(200U/μl) 1μl。 (7) 42?水浴，孵育60min。 (8) 70?加热10min以终止反应，分装，,20?保存备用。 2.7引物设计 根据GenBank登录的大鼠Brn-4和GAPDH基因序列，通过Primer5软件分别设计Brn-4和GAPDH的引物，经GenBank BLAST同源性检索后，由上海生工生物技术工程有限公司合成。 Brn-4引物序列如下: LEFT PRIMER: 5’-GGGTGACCAGTCTTAGCGAC-3’ 170,189位点; RIGHT PRIMER:5’ -GCGAGTACACATTGAGGGGT-3’ 406,387位点; 预计扩增片段长度237bp。 GAPDH引物序列如下: LEFT PRIMER: 5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3’ 550,569位点; RIGHT PRIMER:5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’ 1001,982位点; 预计扩增片段长度452bp。 2.8 PCR(50μl体系) (1) 取0.2ml EP管，依次加入: 第一链cDNA模板 2μl 上游引物 2μl 下游引物 2μl 10×buffer 5μl MgCl(25mmol/L) 5μl 2 dNTP mix(2mmol/L) 5μl Taq酶(2U/μl) 1μl ddHO 28μl 2 (2) 将上述混合物轻轻混匀，稍加离心。 (3) 在PCR仪上进行扩增，程序如下: 94? 3min (94? 40s，54? 30s，72? 40s)循环30次 72? 10min (4) 在10个循环结束后加入GAPDH上下游引物各1μl，继续循环。 (5) 电泳检测PCR扩增结果。 2.9 DNA琼脂糖凝胶电泳 (1) 称取适量琼脂糖粉末，放入锥形瓶中，加入适量0.5×TBE电泳缓 冲液。然后置微波炉加热至完全溶化，摇匀。冷却至60?左右， 在胶液内加入适量的溴化乙锭至浓度为0.5μg/ml。 (2) 水平放置胶模，在一端插好梳子，在模内缓慢倒入冷却至60?左 右的胶液，使之形成均匀水平的胶面。待胶凝固，小心拔起梳子。 (3) 将凝胶放入电泳槽，使加样孔端位于阴极端。加入0.5×TBE电泳 缓冲液，使液面高出凝胶表面1~2mm。 (4) 取待检测PCR样品10μl，与2μl 6×上样缓冲液混匀，用移液器加 至凝胶的加样孔中。 (5) 接通电源，调节稳压输出，电压5V/cm，开始电泳。 (6) 电泳完成后切断电源，取出凝胶，置凝胶于紫外灯下观察结果。 (7) 用捷达图像分析系统对凝胶各泳道中的GAPDH和Brn-4条带进行 光密度扫描。 2.10统计学分析: 以各泳道中Brn-4与GAPDH条带的光密度比值表示Brn-4 mRNA的相对表达量，建立相对表达量密度积分柱形图。数据输入Stata7.0统计软件，多个样本均数的比较用单因素方差分析，均数两两比较用q检验(SNK法)。 结 果 1 RNA检测: 经蛋白核酸测定仪检测，所提取的总RNA的OD/OD值在1.8~2.0260280之间，说明RNA纯度较高。 RNA甲醛变性凝胶电泳结果显示28S和18S条带清晰，5S条带呈淡云雾状，28S RNA : 18S RNA约为2 : 1，表明RNA样品无降解。结果见图1。 28S 18S 5S 图 1 RNA甲醛变性琼脂糖凝胶电泳图 Fig.1 Formaldehyde denaturing agarose gel electrophoresis of RNA 2 半定量RT-PCR分析: 2.1 琼脂糖凝胶电泳检测: RT-PCR扩增Brn-4基因(237bp)和内参GAPDH基因(452bp)，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定，以PCR Marker为标准，在237bp和452bp处分别呈现清晰条带。结果如图2所示。 M C 1 2 3 4 5 6 500bp GAPDH 250bp Brn-4 100bp 图 1 各组Brn-4和GAPDH的RT-PCR产物琼脂糖凝胶电泳 Fig.1 Agarose gel electrophoresis analysis showing the RT-PCR products of Brn-4 and GAPDH of different group M:DNA分子量标准品(DL,2000) C:正常对照 1:切割后1d 2:切割后3d 3:切割后7d 4:切割后14d 5:切割后21d 6:切割后28d 2.2 切割穹窿海马伞对Brn-4 mRNA表达的影响: 穹窿海马伞切割后Brn-4 mRNA的相对表达量变化结果详见表1，不同时间点Brn-4 mRNA相对表达量密度积分柱形图如图3所示。方差分析和均数两两比较(表2)表明，切割后1d、28d组与正常对照组相比，Brn-4 mRNA的相对表达量差异无显著性意义(P>0.05)，3d、7d、14d和21d组与正常对照组相比，差异均有显著性意义(P<0.05);比较切割后不同时间组，除1d、3d组与28d组以及7d组与21d组间的差异无显 著性意义外(P>0.05)，其余各组间的表达差异均有显著性意义(P<0.05)。说明Brn-4 mRNA表达量自切割后第3d开始明显升高，14d时达到最高水平，以后开始下降，于28d左右恢复至正常水平。 表1 正常对照组和切割各组Brn-4 mRNA相对表达量 Table.1 The relative level of Brn-4 mRNA expression of normal control and transection groups 组别 Brn-4 mRNA表达量(Brn-4/GAPDH) 正常组 0.138?0.060 1d组 0.143?0.032 3d组 0.256?0.540 7d组 0.540?0.072 14d组 0.719?0.124 21d组 0.507?0.088 28d组 0.189?0.059 表2 正常对照组和切割各组Brn-4 mRNA相对表达量的组间差异 (两均数之差/ P值) Table.2 The multiple comparison of Brn-4 mRNA relative expression level among normal control and transection groups 组别 正常组 1d组 3d组 7d组 14d组 21d组 .0055 1d组 0.987 .1185 .113 3d组 0.011 0.017 .4018 .3963 .2833 7d组 0.000 0.000 0.000 .5816 .5761 .4631 .1798 14d组 0.000 0.000 0.000 0.034 .3695 .3640 .2510 ,.3233 ,.2122 21d组 0.000 0.000 0.001 0.997 0.007 .0508 .0453 ,.6767 ,.3510 ,.5308 ,.3186 28d组 0.972 0.984 0.894 0.000 0.000 0.000 0.900 0.800 0.700 0.600 0.500 0.400 相对表达量0.300(relative level of expression)0.200 0.100 0.000 control1d3d7d14d21d28d 图 3 各组Brn-4 mRNA相对表达量柱形图 Fig.3 The relative level of Brn-4 mRNA expression of different group