猪精液常温保存技术的研究

猪精液常温保存技术的研究 猪精液常温保存技术的研究 HeilongjiangAnimalScience andVeterinaryMedicineNo42007 猪精漉常保存攘赤研究 徐振军'.,任康,王彦平,赵冰,路永强.,朱士恩 (1.中国农业大学动物科技学院,北京100094;2.赤峰学院生命 科学系,内蒙古赤峰024000;3.北京市畜牧兽医站,北京100107) 中图分类号:$828.89文献标识码:B文章编号:1004—7034(2007)04—0040—02 由于猪精子对低温耐受能力较差,容易发生冷休 克,使得猪精液低温保存技术的研究进展缓慢.我国 的许多科研工作者从20世纪70年代开始就进行猪 精液常温保存,授精效果和稀释液配方研制等方面的 研究,取得了一定的进展.但由于所研制的稀释液配 方大多成分复杂,成本较高,且操作程序复杂,限制了 该项技术的推广和应用.为解决生产中的实际问, 试验对猪精液的常温保存稀释液配方及保存技术进 行了深入研究. 1与 1.1稀释液的配制 1.1.1主要试剂D一(+)葡萄糖,蔗糖(sigma进 口分装),一乳糖(分析纯,军事医学科学院药材供 应站),柠檬酸钠(化学纯,北京化工厂). 1.1.2配制方法按1所示成分和剂量配制基础 液,煮沸消毒后置于4?冰箱贮存备用.稀释前取基 础液86mL,加14mL新鲜卵黄,青霉素,链霉素各10 万Iu配制成保存稀释液.分别用pH计和渗透压测 定仪测定各稀释液的pH值,渗透压. 1.2精液的采集和品质评定 精液分别采自体况良好,性欲旺盛的3头大白种 公猪.以手握法采精,收集较浓的部分,经滤纸过滤 到保温杯中,在1.0,1.5h内运回实验室,自然降至 室温[(23?2)?].室温下进行精液品质评定,包括 精子的活率,密度,pH值,渗透压和顶体完整率.选 收稿日期:2006—06—24 基金项目:北京市农委——种猪选育技术试验示范项目 作者简介:徐振军(1965一),男,副教授,硕士. 通讯作者:朱士恩(1956一),男,教授,博士,博士生导师 择原精活率达0.7以上,密度(2×10)个/mL以上, 色味正常的用于试验. 表l稀释液基础液成分和剂量 1.3精液的稀释和保存 在室温下对精液常规检查完成后,分别将符合要 求的新鲜精液与4种保存稀释液按1:3的比例混 合,直接置于17?生物培养箱中保存.每隔12h轻 轻摇动精液1次,并检测精子活率和顶体完整率,直 至精子死亡. 1.4精子活率评定 将稀释精液摇匀后,取中层精液10L制片,置 于配有37?恒温台的相差显微镜下,放大400倍观 察精子,分别计数呈直线运动的精子数和总精子数, 计算活率. 1.5精子顶体染色 采用姬姆萨(Giemsa)染色法,测定精子顶体完 整率.将精液摇匀后,取中层精液制作精子抹片,福 尔马林磷酸盐固定液固定15,20min,Giemsa染液 染色90min,水洗并自然风干后,置1000倍油镜下 观察精子300个以上.分别对顶体完整精子数和总 精子数计数,计算顶体完整率. 1.6数据处理 关系表现在以下3个方面:(1)不同日龄的仔猪断奶 后1周血清ALP活性均下降,表明仔猪受营养应激 较大,21,28日龄断奶比14,35日龄断奶影响大. (2)仔猪14日龄断奶后1周ALT,AST,LDHL,CK活 性均有不同程度的升高,而21,28,35日龄断奶则下 降.表明仔猪14日龄断奶后1周遭受的非营养性应 激更大,而21,28,35日龄断奶主要为营养性应激. (3)断奶越早,仔猪所受到的应激越大. 根据上述分析,应注意仔猪断奶后的饲养与护 理,尤其在早期断奶期间,更要加强环境卫生等方面 的控制,降低应激反应. (010) 《黑龙江畜牧兽医}2007年第4期41 采用t检验及方差分析进行数据处理,试验重复 5次以上. 2结果_.. 2.1不同稀释液对猪精液保存效果的影响 在常温[(17土0.5)?]条件下,采用I液保存猪 精子的时间和活率(120h,0.60)极显着优于?液 (72h,0.59),n液(60h,0.59)和?液(60h,0.57) (P<0.01),III液显着优于?液和?液(P<0.05). 其中24h内4种稀释液的保存效果无显着差异 (P>0.05),72h内I液和?液的保存效果无显着性 差异(P>0.05).见图1. 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 012243648607284961138120132144156 保存时间m ?I液日IT液口III液?IV液 图1不同稀释液对猪精液保存效果的影响 2.2不同稀释液对猪精子顶体完整率的影响 在4种稀释液中稀释保存猪精液,精子顶体完整 率均呈缓慢下降趋势,并且在72h内无显着性差异 (P>0.05),96h以后I液精子顶体完整率显着高于 其他3组(P<0.01).见图2. 1.I.日.圈.啪.困.髓.髓.10.1..I.1rI..1., 2.3稀释液pH值,渗透压对猪精液保存效果的影 响(见表2) 表2稀释液pH值,渗透压对猪精液保存效果的影响 保存时间龛篱誊 注:O.5级保持时间为精子活率保持0.5以上的时间;总存活 时间为精子活率保持至0.1以下的时间. 表2数据表明,4种稀释液中pH值为6.89,渗 透压为278mOsIn/kg的I液保存效果最好,?液次 之. 3结论与讨论 (1)影响猪精子常温保存时间和活率的因素很 多,主要有温度,稀释液的组分,缓冲能力和渗透压 等,在同一温度下保存精液,稀释液的成分对保存效 果起着决定性作用….试验选用的几种配方基本成 分相同(葡萄糖+卵黄),不同之处在于,分别在I液 和?液中添加了2.7%蔗糖,?液和?液中添加了2. 7%乳糖作为保护剂,以比较蔗糖和乳糖对猪精子的 保护效果;在I液和?液中添加了0.7%的柠檬酸钠 作为缓冲剂,以检测稀释液pH值和渗透压对猪精液 保存效果的影响.从保存效果分析,以蔗糖和柠檬酸 钠配制的I液效果最好,精子的保存时间和活率 (120h,0.60)极显着优于?液(72h,0.59) (P<0.01),n液(60h,0.59)和?液(60h,0.57)(P <0.01),11液显着优于?液和?液(P<0.05).在 4种稀释液中保存猪精液,精子顶体完整率在72h内 无显着性差异(P>0.05),96h以后,I液精子顶体 完整率极显着高于其他3组(P<0.01).上述结果 表明:?蔗糖,乳糖对维持猪精子的活力均具有较好 的作用,但蔗糖的效果优于乳糖,这与Salamon等和 Nauk等的研究结果相似;?蔗糖,乳糖对猪精子的顶 体均具有较好的保护作用. (2)猪新鲜精液的pH值为7.2,7.5,降低pH值可 使精子代谢和运动水平降低,延长精子的存活时间J. 表2显示,试验所用4种稀释液的pH值均在6.11, 6.89之间,I液和?液内添加了0.7%柠檬酸钠后,虽然其 pH值略高于?液和?液,但保存效果显着优于?液和? 液,表明在常温保存稀释液中加入适量的缓冲剂以维持 精液pH值的恒定是必要的. 有研究表明,猪精子可耐受的渗透压为240, 380mOsIn/kg,过高或过低均不利于精子的长期保 存.此次试验?液和?液的渗透压分别为211,221 mOsm/kg,这可能是其保存效果不如I液 (278mOsIn/kg)和?液(269mOsIn/kg)的原因之一. (3)目前,猪精液的常温保存大多要经过离心, 去除或部分去除精浆,程序控制降温等步骤j,操 作繁琐.此次试验采用室温下不去除精浆的一 步法稀释,直接贮藏的方法对猪精液进行常温保存, 操作程序简便,易行.试验所用配方成分简单,成本 低,采用I液和?液对猪精液进行中长期(5d)和短 期(3d)保存,精子活率能分别保持0.60和0.59以 上,更有利于在生产中示范和推广. 参考文献: [1]JOHNSONLA,WEITZEKF,FISERP,eta1.Storageofboar semen[J].AnimReprodSci,2000,62(123):143—172. [2]KUSTERCE,ALTHOUSEGCThefecundityofPorcinesemen storedfor2to6daysinAndrohepandXCELLTMextenders[J]. Theriogenology,1999,52:365—376. [3]SI~MATSUYoshiki,UCHIDAMasaki,NIKIRikio,eta1.LiqLIidstorage ofminiatureboarsefn?[J].ExpAnim,2002,51(2):143—147.(olo) 蜒婆