重金属铅对韭菜种子萌发过程及生理生化的影响

重金属铅对韭菜种子萌发过程及生理生化的影响 玉林师范学院本科生毕业论文(设计) 重金属铅对韭菜种子萌发过程及生理 生化的影响 2+ The Effects of PbSolution on the Growth of Allium tuberosum Rottl,er Spreng Seeds and Physiology and Biochem 院 系 生命科学与技术学院 专 业 生物技术 学 生 班 级 生物技术11班 姓 名 苏青妮 学 号 201110402118 指导教师单位 生命科学与技术学院 指导教师姓名 张慧 指导教师职称 讲师 重金属铅对韭菜种子萌发过程及生理生化的影响 生物技术2011班 苏青妮 指导老师 张慧 摘要 2+ 本实验通过研究Pb胁迫对韭菜种子发芽率、发芽势、幼苗长度及生理生 2+化的影响，从而更好地认识重金属Pb对百合科葱属草本植物生长发育的胁迫作用。用不同浓度(0、300、600、900、1200、1500、1800、2100和2400 mg/L)的铅离子溶液处理韭菜种子，测定萌发过程种子的发芽率、发芽势、幼苗长度、过氧化物酶活性、可溶性蛋白质含量及丙二醛(MDA)含量。结果表明在实验处理的浓度范围内，各浓度铅离子处理下种子发芽率、发芽势先增加后降低，幼苗长度越来越短，对种子过氧化物酶活性、可溶性蛋白质含量及丙二醛(MDA)含量均表现为先增加后降低的现象，并随着处理浓度的增加，韭菜萌发表现为先促进后 2+抑制的现象。不同浓度的Pb溶液影响韭菜种子萌发过程的幼苗长度、发芽势、发芽率、过氧化物酶活性、可溶性蛋白质含量及丙二醛(MDA)的含量。 关键词:韭菜，铅，萌发，生理生化 2+ The Effects of PbSolution on the Growth of Allium tuberosum Rottl,er Spreng Seeds and Physiology and B iochem Biological Science undergraduate class 2011 Su qing ni Supervisor Zhang Hui Abstract 2+ In this experiment,by studying how Pb stresses on Cassia seeds in terms of germination percentage, germination Germination energy,Physiology and 2+Biochem,aiming at a better understanding of the stressing effect of heavy metal Pb 2+on the growth of Allium tuberosum Rottl(er Spreng plant.Through immersion in Pb solution with a range of concentrations: 0, 300, 600, 900,1200,1500 ,1800 ,2100 and 2400 mg/l respectively, the Allium tuberosum Rottl(er Sprengseeds vary in terms of germination percentage,germination Germination energy, ctivity of Peroxidase,the length ofAllium tuberosum seedlings ,soluble protein and Malondialdehyde (MDA) content,to be accurately recorded. Within the range of concentration in this experiment, germination percentage and germination Germination energy activity of Peroxidase,soluble protein and Malondialdehyde (MDA) content increased first and then decreased; With the increase of concentration, facilitate percentage increase and 2+inhibition percentage increases significantly.Pbsolution with different concentrations has an incremental effect on germination percentage,germination Germination energy, ctivity of Peroxidase,soluble protein and Malondialdehyde (MDA) content. Key words: Allium tuberosum , lead , germination, hysiology and Biochem 苏青妮 重金属铅对韭菜种子萌发过程及某些生理生化的影响 目 录 1前言............................................................................................................................. 1 1.1韭菜的概况....................................................................................................... 1 1.1.1韭菜的植物形态特征.................................................................................... 1 1.1.2生长环境的要求............................................................................................ 1 1.2 韭菜的药用价值.............................................................................................. 2 1.2.2具有抑菌的功效..................................................................................... 3 1.2.3具有抗诱变的功效................................................................................. 3 1.2.4 具有抗氧化功效.................................................................................... 3 1.2.5具有护肝降脂功效................................................................................. 3 1.3环境中的重金属污染....................................................................................... 3 1.3.1重金属污染的概况................................................................................. 3 1.3.2重金属的来源......................................................................................... 4 1.3.3重金属元素对植物生长发育的影响..................................................... 4 1.3.4重金属铅的概况..................................................................................... 5 1.4本研究的目的和意义....................................................................................... 5 2 材料与方法................................................................................................................ 7 2.1材料................................................................................................................... 7 2.1.1供试种子................................................................................................. 7 2.1.2仪器与设备............................................................................................. 7 2.1.3金属溶液配制......................................................................................... 7 2.2实验方法........................................................................................................... 7 2.2.1挑选种子................................................................................................. 7 2.2.2种子浸泡处理和消毒处理..................................................................... 7 2.2.3种子萌发试验方法................................................................................. 8 2.3实验过程中所需测量的项目和方法步骤....................................................... 8 2.4 数据处理与方差分析...................................................................................... 9 3 结果与分析.............................................................................................................. 10 3.1 韭菜种子优良度和千粒重............................................................................ 10 3.2 重金属对韭菜种子萌发的影响.................................................................... 10 3.3铅胁迫下韭菜的幼苗长度............................................................................ 13 POD)活性变化 ............................................................ 143. 4 萌发期过氧化物酶( 3.5 萌发期可溶性蛋白质含量变化.................................................................... 16 3.6 萌发期丙二醛(MDA)含量变化.................................................................... 17 4讨论........................................................................................................................... 19 致谢.............................................................................................................................. 21 参考文献...................................................................................................................... 22 玉林师范学院毕业论文(设计) 1前言 1.1韭菜的概况 韭菜Allium tuberosum Rottler Spreng是百合科葱属草本植物韭的叶，为一( 种多年生宿根性辛香类蔬菜，其又名草钟乳、丰本、懒人菜、起阳草、壮阳草、 [1]长生韭、扁菜等，可以炒、拌，做配料、做馅等。其叶、种子及根部都可以入药，具有补肾壮阳，健脾暖胃等功效。在临床应用上，韭菜对新生儿硬肿症、胃肠道异物、 治疗肾脏病合并带状疱疹、治疗脾肾阳虚型重症呃逆等疾病也有很 [2-4]好的治疗效果。韭菜的温室栽培方法在2000年前就已经出现，到了北宋时期韭黄的生产就已形成规模化，300多年以前，中国农民已掌握了利用风障畦进行韭菜覆盖栽培技术。当前韭菜栽培面积占菜田总面积的5 %~6 %，中国成为韭菜地域最广之一。近年来国际交流日越来越频繁，蔬菜出口的发展非常迅速，韭菜也正在走向国际市场。韭菜对人体有很多益处，但是药三分毒，也不是吃得越多对人的身体就越有好处。韭菜性偏温热，体质阴虚内火旺盛、肠胃虚弱或者患溃疡病和眼疾的人应该注意食用。原因是韭菜本身含硝酸盐，大量食用后因肠道功能会容易出现障碍或胃酸会出现过低的情况，包括沙门氏菌和大肠杆菌在内的硝酸盐还原菌就会在肠道内大量生长繁殖，还原菌把硝酸盐还原为亚硝酸盐，而引 [5]起中毒。 1.1.1韭菜的植物形态特征 韭菜生有鳞茎，长有须根和细长的地下走茎。生育期间新老根交替，逐年上移。茎分为营养茎和花茎，其顶端花序呈伞状，成株有叶5-11片，狭长而扁平，种子为黑色半球形，扁平，边缘具有棱。呈三角形或半圆形，质硬，气特异，味 [6]微辛。 1.1.2生长环境的要求 (1)温度:韭菜属耐寒性植物，不耐高温且适应较广范围的温度。2-3 ?为发芽最低温度，15-20 ?为最适温度，18-24 ?为生长适温。在露地的条件下，气温超过了24 ?时生长就会变得缓慢，超过了35 ?时叶片就容易枯萎腐烂，在干旱、高温、强光的情况下，叶片质地粗硬，纤维素增多，品质低劣，甚至不 1 苏青妮 重金属铅对韭菜种子萌发过程及某些生理生化的影响 能食用。 (2)光照:韭菜属于长日照植物。长时间适中的光照强度，能使净光合速率提高，叶色浓绿，长势强，贮存营养丰富，产量增多品质也相对好在完全遮光的条件下，叶片呈黄白色，茎变为白色，而在弱光下叶片呈现美丽的淡黄色，所以生产韭黄时，就要特别注意调节光照强度。 (3)水分:韭菜喜温、怕涝、耐旱，适宜在60-70 %的空气湿度和80-95 %的土壤湿度环境中生长。韭菜的发芽期、出苗期、幼苗期尤其怕干旱，土壤必须保持潮湿，含水量不低80 %，如果缺水，发芽率就会降低，幼苗容易干旱而死。 (4)土壤与肥料:韭菜能适应多种类型的土壤，在土壤肥沃，保水、保肥力强的优质土和偏粘质土中，韭菜生长相对旺盛;在易脱肥、干旱的沙质土中长势较弱;若在粘重、透气性差、易于干裂的土壤中，韭菜就极易烂根。韭菜吸收的肥主要为氮肥，钾、磷、及其他微量元素肥料为辅料。韭菜的成株耐肥力强，耐有机肥的能力尤其强。在移栽时最好重施基肥，否则，移栽之后肥底不充足而难以补充，有机肥和土杂肥为最好的基肥。 1.2 韭菜的药用价值 韭菜在我国已有三千多年的历史，是特有的蔬菜之一，其味道鲜美，营养非常丰富，有“蔬菜之荤”的美称。韭菜种子具有很高的药用价值，韭菜作为药用，最早出现于梁陶弘景《名医别录》中，谓其能“安五脏，除胃中热”。《食疗本草》说它能“利胸膈”。《本早拾遗》说它能“温中、下气、补虚、调和脏腑、益阳、腹冷痛、止泻白脓，并煮食之”。 1.2.1具有改善性功能的功效 [7]韭菜根及韭菜子有滋补肝肾、壮阳固精的作用。何娟等研究结果显示，高剂量组的韭菜子醇提物对幼年雄性小鼠的体重有明显的增加功效，还能增加幼年雄性小鼠精囊、包皮腺、腺睾丸(附睾)的重量，对去势小鼠的性功能也有一定的改善作用。雄性小鼠在服用韭菜粗提液后血清NO和睾酮含量显著提高，同时性器官重量发生显著变化，性功能显著改善，但对小鼠抗疲劳功能提高作用不明[8]显。除此之外，韭菜子提取物能使去势大鼠阴茎对外部刺激的兴奋性提高，模型动物的耐疲劳、耐寒的能力增强的，同时自主活动次数也得到了增加，对温肾 2 玉林师范学院毕业论文(设计) [9]助阳有一定的作用。所以韭菜是肾虚、阳痿患者的食疗佳品，可以用来治疗多尿、遗精、早泄、阳痿、腰膝酸软、冷痛、妇女白带等症。 1.2.2具有抑菌的功效 韭菜还具有抑菌作用，实验研究显示，较强抑菌活性成分在韭菜的原汁中大量存在，体外对常见致人病菌如痢疾杆菌、大肠杆菌、脓杆菌、绿金黄色葡萄球 [10]菌、枯草杆菌、变形杆菌等6种病菌有明显的抑菌作用。但韭菜原汁经过100 ?以上温度作用之后抑菌活性会明显降低，其抑菌活性也将会失去。 1.2.3具有抗诱变的功效 [11] 韭菜还有抗诱变的作用，魏巍以小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验( MNT) 为指标，初筛6种中草药的抗诱变作用，沙苑子、韭菜子、柏子仁为抗诱变效果较好的3种中草药，进一步抗诱变研究之后，3种中草药水煎液剂量的多少对抗诱变作用有很大的影响，在一定范围内，柏子仁和韭菜子水煎液剂量越少，抗诱变效果越强，呈剂量―反应负相关趋势;而沙苑子水煎液随剂量升抗诱变作用逐渐增强，呈剂量―反应正相关趋势。 1.2.4 具有抗氧化功效 [12] Fenton 体系产生的 ? OH自由基对韭菜总黄酮提取液有很好的清除作用。被利血平诱发损伤的大鼠黏膜动物模型通过韭菜根液的作用，有很好恢复现象，实验说明韭菜根液与增强清除氧自由基能力，提高胃黏膜SOD活性和减轻脂质 [13]过氧化反应有关。 1.2.5具有护肝降脂功效 实验表明高血脂症模型大鼠通过韭菜粗提液作用一定时间后，血脂有明显 [14]降低，原因是韭菜中的含硫化合物能扩张血脉和降低血脂，说明韭菜粗提液对肝脏具有一定的保护作用，所以高血脂型和心脑血管疾病的人群可以适当食用韭菜。 1.3环境中的重金属污染 1.3.1重金属污染的概况 重金属是指比重大于5.0 g/cm?的金属元素，包括铁、锰、铜、锌、镉、铅、 3 苏青妮 重金属铅对韭菜种子萌发过程及某些生理生化的影响 [15]汞、铬、镍、钼、钴等。 土壤重金属污染问题已成为全球面临的一个严重的环境污染问题。根据报 [16]道，我国受重金属污染的耕地面积约占耕地总面积的1/5。土壤污染具有不可逆性和蓄积性，土壤和生物体内都能富集，在作物体内富集之后通过食物链被吸 [17]收进入人体，人和其他动物的健康的就会受到严重危害。植物是有机物的生产者，是有机物的制造者。植物的发芽和生长已经被人类活动生产中的各种污染所影响到，其中的重金属污染最为严重。土壤中的某些重金属离子因环境污染而增加，环境会有一定的自净作用，当土壤中重金属子含量超过其对重金属离子的 [18]自净作用时, 就会对植物代谢和生长发育产生影响。重金属在土壤中的积累、迁移不仅危害区域生态安全，影响动物和植物的生长发育，还会通过食物链进入 [19]人体内部。大量的重金属在人体内部会引发癌症,当土壤中重金属污染比较严重时，就会影响到地球上很多生物的生活和健康。所以研究重金属污染植物很有必要。这不但是为了植物的健康成长，也是为了人类的健康。 1.3.2重金属的来源 重金属污染来源主要分为以下几种:第一，工业污染。工业的迅速发展同时工业燃料的所使用也不断增加，煤、石油类成为工业能源的主要来源，也是环境中重金属铅、汞、铬、镉、砷等污染的主要来源。第二，城市污染。污染过程主要包括污水处理中产生污泥的堆放、垃圾渗滤液的泄漏等。城市垃圾在焚烧堆放填埋过程中产生的飞灰、渗滤液中的重金属量通常也会严重超标。污水处理厂如果不经处理直接排放，就会对土壤环境造成二次污染。第三，农业污染。不合理使用化肥和大量使用农用薄膜，其中的重金属如铬、铜、镍、锌、铅、镉等杂质就会直接污染土壤。第四，交通运输污染。其中的汽油燃烧、汽车轮胎添加剂也导致公路旁的土壤受到污染。研究发现,交通主干道两侧土壤中重金属元素的含 [20]量显著高于公园土壤，这表明交通运输过程中产生的重金属污染十分严重。 1.3.3重金属元素对植物生长发育的影响 重金属在环境中不能降解时就会通过空气、水、土壤等途径进入动植物体。在这些金属中，有些是植物必需的微量元素(如锌、铜等)，有些重金属并不是植物必需的微量元素(如汞，铬等)，它们对植物的生长发育起着十分重要的作用。当其含量超过一定量时，植物体的核酸代谢水平、激素水平就会降低，光合 4 玉林师范学院毕业论文(设计) 作用、呼吸作用也会受到抑制，植物体内生理生化过程发生混乱从而影响植株正 [21]常生长。土壤中的微生物活性也会受到重金属影响，当微生物受到伤害时，植物根系吸收土壤营养元素就会减少;重金属毒害甚至会引起植物体内如氨基 [22]酸、蛋白质、可溶性糖等化学成分的变化。但有些重金属在低浓度有益于某些植物的生长，如重金属Zn和Pb低浓度时促进油菜种子的萌发，高浓度时则 [23]抑制其种子的萌发。而Cu、As污染明显抑制黄豆种子萌发、幼苗生长，对作物种子萌发时的呼吸强度、酶活性有显著的抑制作用，且随着Cu、As浓度的增 [24]加，抑制作用增强,呈负相关。这也验证了重金属对植物种子萌发及植株生长发育的影响除与植物种类有关外，还与重金属浓度相关，表现出一定的剂量效应[23]。 1.3.4重金属铅的概况 铅是一种严重对人体健康危害非常严重的重金属元素。过量的Pb和可溶性铅盐都会对植物产生毒害效应，其主要表现在植物种子萌发率降低、叶绿素合成减 [25]少、生物量受到抑制、细胞活性紊乱和染色体等遗传基因受到破坏等。所以研究重金属铅对植物种子影响已经成为世界科学界的一个热点问题。 铅进入人体的主要方式为人体从外界摄取食物、饮用自来水等，储存在骨骼内的铅占90 %，其余的则通过血液循环流动到全身各组织和器官中，直接对血红细胞和脑、肾、神经系统功能造成影响。调查表明，一个成年人每天饮食中铅的摄入量为0.2-0.3 mg，而世界卫生组织规定的个人铅摄入量为0.43 mg/周，由此可 [26]见个人对重金属铅的摄入量要严格限定。所以当我们人体吸入过多的铅时就会中毒，还很有可能引起一系列的疾病。 1.4本研究的目的和意义 土壤重金属污染物在土壤中具有移动性差、滞留时间长、难以被微生物降解的特点，由此对于作物栽培造成的影响不可轻视，近年来越来越受到人们的关注。环境中的重金属浓度超过一定量时，就会对植物体有很强的毒害作用，在食 [27]物链中积累，对环境中的生物构成威胁。韭菜为我国一种美味的蔬菜，不仅具有丰富的营养价值还具有很高的药用价值，从文献资料来看，国内外对韭菜籽化学成分及药理功效研究并不多。本次实验通过观察、测量在Pb重金属溶液的浸泡处理下韭菜种子萌发情况及生理生化变化情况，分析重金属Pb对韭菜种子 5 苏青妮 重金属铅对韭菜种子萌发过程及某些生理生化的影响 萌发率和某些生理生化的影响，为加深对重金属污染的针对性研究提供实验依据，同时也为对韭菜防害、栽培和药用使用价值的研究提供一些参考。 6 玉林师范学院毕业论文(设计) 2 材料与方法 2.1材料 2.1.1供试种子 本实验所用种子是从玉林市花鸟市场销售面铺所购。 2.1.2仪器与设备 (1)仪器设备:温室培养箱(TS-211GZ)、可见分光光度计(722N型，上海精密科学仪器有限公司)、电热恒温水浴锅(HH.B11.600-S-II上海跃进疗仪器械厂)、电子天平(上海精密科学仪器有限公司)、滤纸、培养皿(12 cm)、烧杯、量筒、胶头滴管、玻璃棒、棕色滴瓶、剪刀、游标卡尺、高压灭菌锅、离心机。 (2)实验药品:浓硫酸、0.8 %次氯酸钠，蒸馏水，硝酸铅0.05 mol/LpH=5.5 磷酸缓冲液、0.05 mol/L愈创木酚溶液、质量分数为2 %的HO、质量为数为2220 %的三氯乙酸、蛋白质溶液(0.1 mg/mL)、考马斯亮蓝G-250溶液质量分数为10 %的三氯乙酸(TCA)、质量分数为6 %的硫代巴比妥酸(TBA)。 2.1.3金属溶液配制 2+实验前用硝酸铅和蒸馏水配制好含Pb分别为0 mg/L、300 mg/L、600 mg/L、900 mg/L、1200 mg/L、1500 mg/L、1800 mg/L、2100 mg/L、2400 mg/L的单盐溶液各1000 mL。 2.2实验方法 2.2.1挑选种子 挑选并选择发育良好、成熟饱满的韭菜种子。 2.2.2种子浸泡处理和消毒处理 将称量完的韭菜种子直接置于装有蒸馏水的10 mL小烧杯中，再将小烧杯置于40 ?的水浴锅浸种5 min。再用0.8 %次氯酸钠进行种子消毒。 将实验所需的滤纸和培养皿在高压灭菌锅内以0.1 MPa的蒸汽压、121.5 ? 7 苏青妮 重金属铅对韭菜种子萌发过程及某些生理生化的影响 的温度灭菌20 min。 2.2.3种子萌发试验方法 (1) 选取籽粒饱满一致的种子，取培养皿分成9组，每组3个培养皿，并标号1-9号，每个皿100粒，置于垫有1层滤纸的培养皿中，并用盖子盖好。(1号为对照组，2-9号为Pb实验组)向2-9号培养皿中各加入相应浓度的铅处理液5 mL，使其浸透滤纸并完全浸润种子。1号培养皿以蒸馏水为对照，加入5 mL的蒸馏水，每个浓度设3次重复。把种子放在培养箱中培养，设置温度为25 ? 、光照度为750 lx、相对湿度75 %。在对应培养皿中每天加入5 mL铅离子溶液，对照组则加入5 mL蒸馏水，隔3天换1次滤纸，以保持滤纸的湿润和清洁。 (2) 幼根约为种子长度一半时做为发芽的标准，每天观察和记录发芽种子数，第三天计算韭菜种子的发芽势，第10天计算种子的发芽率，连续3天没有种子萌发则结束实验。 (3) 取第10天的种子测定相关的生理指标。 2.3实验过程中所需测量的项目和方法步骤 (1)优良度和千粒重:随机挑取实验所用种子100粒，称量其重量，如此重复4次，求出4次所称得的重量的平均值，再乘以10，得出本次试验所用种子的千 [28]粒重，用以评判所用种子的质量。 (2)发芽势(GP):GP=n/N×100 %(n表示日发芽种子达最高峰时发芽的种yy 子数，N表示供试种子粒数)。 (3)发芽率(GR):GR=n/N×100 %(n表示发芽试验规定的天数内记录的00 发芽种子数，N表示供试种子粒数)。 2+ (4)幼苗生长指标的测定:幼苗经Pb溶液培养10 d后，从每个培养皿中随机选取10株幼苗，用滤纸吸干幼苗表面水分，置于滤纸上，用电子游标卡尺 [29]测量幼苗的长度，精确到0.01 mm，并记录。 (5) 过氧化物酶活性(POD)测定:参照张立军的POD活性测定 —愈创木酚[30]法，以1 min内A470变化0.01为1个酶活性单位(U)。吸取4.9 mL酶活性测定的反应体系(1.0mL0.05 mol/L愈创木酚溶液，2.9 mL0.05 mol/L磷酸缓冲液，1.0 mL质量分数为2 % 的HO)，加入0.1 mL酶液。反应体系加入酶液后，立22 8 玉林师范学院毕业论文(设计) 即于37 ?水浴中保温15 min，然后迅速转入冰浴中，并加入2.0 mL 质量为数为20 %的三氯乙酸终止反应，然后，过滤(或以5000 r/min离心10 min)，适当稀释。用加热煮沸5 min的酶液作为对照。在波长470 nm下测定吸光度。根据以下公式可计算出过氧化物酶的活性。 -1 过氧化物酶活性=(A470×V)?(0.01W?V?t) TFS 式中A470——反应时间内吸光度的变化;W——样品鲜重;t——反应时间F min;V——提取酶液体积(mL);V——测定时取用酶液体积(mL)。 TS (6)可溶性蛋白质含量测定: 参照张立军的蛋白质含量测定 —采用考马斯 [30]亮蓝G-250法。吸取酶提取液1.0 mL，放入试管中(每个样品重复两次)，加入5.0 mL考马斯亮蓝溶液，充分摇匀，放置2 min后在595 nm下比色，测定吸光值，以牛血清白蛋白(BSA)为标准蛋白作标准曲线。根据以下公式计算可溶性蛋白质含量 -1 蛋白质含量(mg/g)=(C?V)?(1000V?W)TSF 式中的C——从标准曲线上查得的蛋白质含量(μg);V——提取酶液总体T 积(ml);Vs——测定时酶液的加用量(mL);W——样品的鲜重(g)。 F (7)丙二醛(MDA)含量测定:参照张立军的MDA含量 —测定硫代巴 [30]比妥酸(TBA)法。称取剪碎的试材1 g，加入2 mL l0 ,TCA和少量石英砂，研磨至匀浆，再加8 mLTCA研磨，匀浆在4000 r?min-1离心10 min，上清液为样品提取液。吸取离心的上清液2 mL(对照加2ml蒸馏水)，加入2 mL 0.6 ,TBA溶液，混匀物置于沸水浴上反应15 min，迅速冷却后再离心。取上清液于波长450 nm、532nm和600 nm下测吸光值。根据以下公式计算丙二醛含量: CMDA(μmol/L),6.45(A532-A600)-0.56A450 MDA含量(μmol/g?FW)=[CMDA(μmol/L)?V(ml)]/[F(g)?1000] W 式中V——提取液体积(mL)，F——样品鲜重(g)。 W 2.4 数据处理与方差分析 所有的数据均为4次重复的平均值，采用SPSS19.0统计分析软件(LSD单因素方差分析)、Word 2013、Excel 2013等软件进行进行数据分析。 9 苏青妮 重金属铅对韭菜种子萌发过程及某些生理生化的影响 3 结果与分析 3.1 韭菜种子优良度和千粒重 千粒重是以克表示一千粒种子的重量，是体现种子大小与饱满程度的一项指标，是检验种子质量和作物考种的内容，也是田间预测产量时的重要依据。从种子育苗角度上来看，千粒重越大，种子储藏的营养物质越多，种子越有活力，有 [31]利于种子萌发。 经过实验测量，韭菜种子的优良度为93.75 %，千粒重为4.07 g，韭菜种子的千粒重一般为4.0-4.15 g，说明本实验种子的大小、饱满程度以及种子质量都符合要求。 3.2 重金属对韭菜种子萌发的影响 植物种子在重金属污染的情况下能否正常萌发是植物能否在受重金属污染的土壤中生长的先决条件。发芽势、发芽率表征种子活力、出苗整齐度等，决定种子是否适宜于播种、播种量的大小、反映种子品质优劣并能够发芽并长成正常植株的能力。 表3.1 不同Pb离子浓度胁迫下对韭菜种子发芽率和发芽势的影响 Table 3.1 The impact of Allium tuberosum Seed by different concentrations 2+of heavy metals Pbgermination rate and germination energy. 10 玉林师范学院毕业论文(设计) 铅离子浓度(mg/L) 发芽率(%) 发芽势(%) 0 80?3.651 32.25?1.500 300 84.75?4.031 35.00?1.414 600 87.00?2.708* 38.50?1.291* 900 79.75?3.304* 36.50?2.380* 1200 73.50?3.416** 27.00?2.160** 1500 66.75?2.986** 24.25?2.500** 1800 42.75?2.500** 17.00?2.944** 2100 33.00?2.944** 7.25?2.754** 2400 14.75?2.062** 4.75?1.893** 注:表中表中数据为平均值?标准差，一个*代表差异显著(P<0.05)，两个*代表差异极显著(P<0.01) 2+图 3.1 不同浓度的Pb离子胁迫下对韭菜种子发芽率和发芽势影响 Figure 3.1 The impact of Allium tuberosum Seed by different concentrations 2+ of heavy metals Pbgermination rate and germination energy. 2+从表3.1、图3.1可以看出,不同Pb浓度处理对韭菜种子萌发有明显的影响， 2+随着培养液Pb浓度由0 mg/L增至600 mg/L时，韭菜种子的发芽势从32.25 %上升至38.50 %，发芽率从80.0 %上升至87.00 %，两项指标均表现为正相关，发芽率差异显著，但发芽势差异不显著;当浓度由600 mg/L增至900 mg/L时，发芽势从38.50 %降至36.50 %，韭菜的发芽率从87.00 %降至79.75 %，两项指标仍然表现 2+为降低现象，发芽率开始表现出极显著，发芽势差异不明显;当培养液中的Pb浓度继续增加时，增至2400 mg/L，与对照组相比，发芽势和发芽率的降低都表 现出了极显著作用。 11 苏青妮 重金属铅对韭菜种子萌发过程及某些生理生化的影响 2+2+与对照组相比，Pb浓度存在时，随着Pb浓度的继续增大，发芽率、发芽 2+势都逐渐减小，抑制效果越来越显著。表明一定的Pb浓度对韭菜种子的萌发有不同的影响作用。 2+2+2+Pb 0 mg/L Pb 300 mg/L Pb 600 mg/L 2+2+2+Pb 900 mg/L Pb 1200 mg/L Pb 1500 mg/L 2+2+2+Pb 1800 mg/L Pb 2100 mg/L Pb 2400 mg/L 图3.2不同浓度的Pb离子胁迫下对韭菜种子发芽和发芽势影响 Figure 3.2 The impact of Allium tuberosum Seed by different concentrations of 2+ heavy metals Pbgermination rate and germination energy. 由图3.2可以看出，不同浓度铅离子处理对韭菜种子萌发均有影响，较低浓度的处理能对韭菜种子的萌发及其幼苗生长具有促进作用，高浓度处理则会明显抑制其萌发和幼苗生长，且随处理浓度加大，抑制作用越明显，严重影响了种子 12 玉林师范学院毕业论文(设计) 2+发芽的整齐度。实验观察发现,，随着Pb 浓度的加深，根尖就会出现褐变枯萎 2+的现象，可能是因为在溶液中Pb毒害根冠细胞，使根尖细胞停止生长的缘故。 3.3铅胁迫下韭菜的幼苗长度 韭菜种子萌发10 天后，测量韭菜的苗长度(表3.2、图3.4)所示。随着溶 2+2+液中Pb浓度的不断增大，韭菜的幼苗长度逐渐减短，当溶液中Pb的浓度为300 mg/L时，与对照相比，韭菜幼苗长度从62.98 mm降至37.47 mm，其生长长 2+度受到明显的抑制。随Pb浓度的增大，幼苗受害加重，生长受阻，苗长度下降剧烈，在浓度为2100 mg/L和2400 mg/L时，韭菜的幼苗长度分别为7.47 mm和4.19 mm。幼苗叶片有发黄现象，根系短小发育不良，铅胁迫后的幼苗有部分变褐，生长停滞，严重时幼根甚至焦枯死亡(图3.3)，韭菜出现的这种毒害症状 2+同玉米幼苗在Pb胁迫下出现的症状较相似。 2+注:植株顺序按Pb浓度从0、300、600、900、1200、1500、1800、2100、2400 mg/L排列。 2+图3.3不同浓度Pb对韭菜幼苗长度的影响 2+ Figure. 3.4The Effects of different Pbconcentrations on the length ofAllium tuberosum seedlings 2+表3.2不同浓度Pb处理韭菜幼苗长度 2+ Table 3.2The Effects of different Pbconcentrations on the length of Allium tuberosum seedlings 铅离子浓度(mg/L) 幼苗长度(mm) 13 苏青妮 重金属铅对韭菜种子萌发过程及某些生理生化的影响 0 62.98?2.24 300 37.47?1.80** 600 34.30?3.30** 900 28.90?1.08** 1200 22.54?1.59** 1500 17.1?0.85** 1800 13.27?0.83** 2100 7.47?0.16** 2400 4.19?1.72** 注:表中表中数据为平均值?标准差，一个*代表差异显著(P<0.05)，两个*代表差异极显著(P<0.01) 2+图3.4不同浓度Pb处理韭菜幼苗长度 2+ Figure 3.4 The Effects of different Pbconcentrations on the length of Allium tuberosum seedlings 3. 4 萌发期过氧化物酶(POD)活性变化 表 3.3 不同浓度的Pb离子胁迫下对韭菜种子POD活性的影响 Table 3.3 The impact of Allium tuberosum Seed by different concentrations of 2+ heavy metals Pbctivity of Peroxidase. 铅离子浓度(mg/L) 过氧化物酶含量(U/mg) 0 0.475?0.018 300 0.778?0.011* 600 0.841?0.022** 14 玉林师范学院毕业论文(设计) 900 0.514?0.017** 1200 0.396?0.015** 1500 0.364?0.017** 1800 0.315?0.002** 2100 0.312?0.017** 2400 0.132?0.022** 注:表中表中数据为平均值?标准差，一个*代表差异显著(P<0.05)，两个*代表差异极显著(P<0.01) 图 3.5不同浓度的Pb离子胁迫下对韭菜种子POD活性的影响 Figure 3.5 The impact of Allium tuberosum Seed by different concentrations of 2+ heavy metals Pbctivity of Peroxidase. 在细胞代谢过程中过氧化物酶起着非常重要的作用，种子的萌发与休眠和种子的抗病、抗逆力与过氧化氢酶含量有很大的关联，可作为种子生活力的参考指[ 30]标。 随着铅离子浓度增大，过氧化物酶活性在0~600 mg/L呈增长趋势，由原来的0.475 U/mg上升为0.841 U/mg，在600 mg/L时过氧化物酶活性最高，之后随着铅离子浓度越来越高，过氧化物酶活性越来越低，最后降低为0.132 U/mg，变化幅度比较大，具有极显著差异。 15 苏青妮 重金属铅对韭菜种子萌发过程及某些生理生化的影响 3.5 萌发期可溶性蛋白质含量变化 表 3.4不同浓度的Pb离子胁迫下对韭菜种子可溶性蛋白质含量的影响 Table 3.4 The impact of Allium tuberosum Seed by different concentrations of 2+ heavy metals Pbsoluble protein . 铅离子浓度(mg/L) 可溶性蛋白质含量(mg/g) 0 0.507?0.014 300 0.677?0.012 600 0.825?0.011* 900 0.738?0.012** 1200 0.719?0.036** 1500 0.668?0.013** 1800 0.534?0.022** 2100 0.441?0.018** 2400 0319?0.021** 注:表中表中数据为平均值?标准差，一个*代表差异显著(P<0.05)，两个*代表差异极显著(P<0.01) 16 玉林师范学院毕业论文(设计) 图3.6不同浓度的Pb离子胁迫下对韭菜种子可溶性蛋白质含量的影响 Figure 3.6 The impact of Allium tuberosum Seed by different concentrations of 2+ heavy metals Pbsoluble protein 如图3.6所示，韭菜萌发过程中种子中可溶性蛋白含量在600 mg/L最高， mg/L浓度和300 mg/L 浓度的相比，增长幅度分别为62.72 %为0.825 mg/g，与0 和21.86 %，显著高于0 mg/L 和300 mg/L 浓度的含量。 随着铅离子浓度的升高，种子中可溶性蛋白质含量一直呈下降趋势。浓度为1800 mg/L 的可溶性蛋白含量为0.5343 mg/g，显著 ( P < 0. 05 )低于600 mg/L浓度可溶性蛋白质的含量。 3.6 萌发期丙二醛(MDA)含量变化 表 3.5不同浓度的Pb离子胁迫下对韭菜种子MDA活性的影响 Table 3.5The impact of Allium tuberosum Seed by different concentrations of 2+heavy metals PbMalondialdehyde (MDA) content. 铅离子浓度(mg/L) 丙二醛(MDA)含量(μmol/g) 0 0.600?0.023 300 0.633?0.022 600 0.776?0.017* 900 0.827?0.02** 1200 0.686?0.001** 1500 0.638?0.020** 17 苏青妮 重金属铅对韭菜种子萌发过程及某些生理生化的影响 1800 0.477?0.013** 2100 0.348?0.024** 2400 0.319?0.021** 注:表中表中数据为平均值?标准差，一个*代表差异显著(P<0.05)，两个*代表差异极显著(P<0.01) 图3.7不同浓度的Pb离子胁迫下对韭菜种子MDA活性的影响 Figure 3.7 The impact of Allium tuberosum Seed by different concentrations of 2+heavy metals PbMalondialdehyde (MDA) content. 丙二醛(MDA)含量的多少代表了膜脂过氧化的程度，间接地反映了植物组织 2+抗氧化的能力。随着Pb 浓度的升高, 韭菜种子中MDA含量呈升高趋势, 各浓度的丙二醛含量分别0.600 μmol/g、0.633 μmol/g、0.776 μmol/g、0.827 μmol/g、0.686 μmol/g、0.638 μmol/g、0.447 μmol/g、0.348 μmol/g、0.314 μmol/g，在铅离子浓度为900 mg/L时达到峰值, 与对照组相比，升高幅度为37.83 %，MDA含量的上升是为了加强机体防御能力。浓度为900 mg/L至2100 mg/L MDA含量呈下降趋势, 2100 mg/L~2400 mg/L MDA含量差异不显著，说明膜的受损程度较严重，保护酶不能发挥作用，韭菜种子不能正常萌发和生长。 18 玉林师范学院毕业论文(设计) 4讨论 种子萌发过程中非常容易受到重金属的影响迫害，重金属对植物生长毒害评价包括植物的生长情况，所以提高韭菜种子在萌发期间的耐金属性，对韭菜在重金属污染地区的栽培利用有极大的意义。本实验过程中，所选取的种子千粒重在规定的范围内，种子大小、饱满程度及种子质量都符合实验要求。在低浓度(?600 2+mg/L)的Pb胁迫下，韭菜种子的发芽势、发芽率都表现出增长趋势，在高浓 2+度(?600 mg/L)的Pb胁迫下，发芽率、发芽势表现出降低趋势，说明低浓度 2+(?600 mg/L)溶液对韭菜种子萌发具有促进作用，当Pb浓度大于600 mg/L时，对种子萌发的开始表现为抑制现象，且为显著水平，随着浓度的增加，当2+Pb浓度大于900 mg/L时，对种子萌发的抑制作用开始表现为极显著水平。而在铅胁迫下幼苗的长度也深受影响，随着铅离子浓度的增加，幼苗的长度与对照组相比，一直呈现出下降趋势，表明高浓度的铅离子溶液对幼苗长度有抑制作用。POD活性随韭菜种子萌发进程呈先上升后下降趋势，表明POD在萌发的初期和中后期已明显启动，种子生命活力增强，胚的萌动与生长发育也在增强，抗逆能力和对活性氧的清除也在不断增强。在逆境或衰老的条件下，生物膜中的自由基与不饱和脂肪酸发生过氧化反应，破坏了膜的正常功能。韭菜种子最重要的营养物质之一是蛋白质, 当种子萌发时，在蛋白酶的作用下种子中的贮藏蛋白质降解 19 苏青妮 重金属铅对韭菜种子萌发过程及某些生理生化的影响 为各种多肽 氨、基酸，为新陈代谢提供原料和部分能源。试验中可溶性蛋白含量呈先增加后下降趋势，说明韭菜种子中贮藏的蛋白质被降解情况随着浓度的变化而变化，不同浓度得到的原料和能源都有所不同。整个试验过程中MDA的含量呈先上升后逐渐下降趋势，含量上升是为了加强机体的防御能力，放出大量的能量, 加快膜质过氧化程度，MDA含量组价降低，说明膜的受损程度较严重，种子丧失了保护能力。 综上所述，低浓度的铅离子溶液对韭菜种子发芽势发芽率有促进作用，高浓度的铅离子溶液则有抑制作用，POD活性、可溶性蛋白质含量和MDA的含量都随着浓度的升高而呈先增长后降低趋势，而幼苗长度则一直呈下降的现象。低浓度的铅离子溶液处理下，POD活性、可溶性蛋白质含量和MDA的含量的增加，说明蛋白质降解为各种氨基酸、多肽等，种子生命活力增强，同时由于铅离子作用，韭菜种子增加机体的防御能力加强，膜质氧化程度加快，所以发芽势和发芽率都同时增大;反之，当铅离子浓度过高时，种子的膜受损，失去保护能力，蛋白酶可能受到破坏，可溶性蛋白质不再增多，韭菜的发芽势发芽率也随之降低，韭菜 2+生长过程中最先接触到重金属溶液的是根部，幼苗的生长速度变得缓慢，受Pb毒害的韭菜根尖呈深褐色坏死，所以幼苗的长度随着铅离子浓度是升高而减短。 2+因此，不同浓度的Pb溶液对韭菜种子萌发过程的幼苗长度、发芽势、发芽率、过氧化物酶活性、可溶性蛋白质含量及丙二醛(MDA)的含量有不同的影响。 20 玉林师范学院毕业论文(设计) 致谢 时光匆匆如流水，转眼便是大学毕业时节，毕业论文的完成也随之进入了大学尾声。从开始进入课题到论文的顺利完成，一直都离不开老师、同学、朋友给我热情的帮助，在此我向生科院所有老师表示衷心的感谢，谢谢你们四年的辛勤栽培，谢谢你们在教学的同时更多的是传授我们做人的道理，谢谢四年里面你们孜孜不倦的教诲～ 特别要感谢我的指导老师张慧。在本课题在选题以及研究过程中，我得到了张慧老师的悉心指导。在她悉心的指导、关心和鼓励下，才使得我养成科学严谨的治学态度，也让我学会了如何去解决所遇到的问题。感谢你您让我懂得了科学探索的奥秘在于永远保持一个乐观积极向上的心态以及脚踏实地勤勉的务实作风。 最后，感谢生技11班同学们的关心与帮助;感谢本实验组成员们特别是祖慧同学在实验过程中给予的帮助与支持;最后，我要感谢参与我论文评审和答辩的各位老师，是他们给了我一个审视大学四年来学习成果的机会，我将会在今后的工作、学习中加倍努力，以期能够取得更大的进步。 21 苏青妮 重金属铅对韭菜种子萌发过程及某些生理生化的影响 祝大家今后身体健康、工作如意、事事顺利，谢谢～ 参考文献 [1] 国家中医药管理局《中华本草》编委会(中华本草[M](8卷(上海:上海科学技术出版社，1999( [2] 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