清香大曲及酒醅中地衣芽孢杆菌的分离鉴定

清香大曲及酒醅中地衣芽孢杆菌的分离鉴定 清香大曲及酒醅中地衣芽孢杆菌的分离鉴定 芽孢杆菌是大曲中常见微生物,也是重要类群之一。地衣芽孢杆菌一直以来被认为是酱香型白酒高温大曲中特有的微生物,就我们研究发现,在牛栏山酒厂生产用的多种清香大曲、出池酒醅中同样存在地衣芽孢杆菌,对分离出23株芽孢杆菌进行生理生化实验,鉴定出12株地衣芽孢杆菌,鉴定结果与中国食品发酵工业研究院分子鉴定结果一致。本文主要介绍地衣芽孢杆菌的生理生化鉴定实验方法,为地衣芽孢杆菌的鉴定提供比较完备的一套方法。 1 地衣芽孢杆菌的分离 1.1 牛栏山酒厂生产用清香大曲、酿酒车间酒醅 1.2分离用培养基 肉汁培养基,牛肉膏0.3,,蛋白胨1.0,,NaCl 0.5,,琼脂2.0,,pH 7.0-7.2,121?,灭菌30min。 1.3分离方法 取大曲干粉或酒醅0.5g,加入带有玻璃珠的无菌水三角瓶中,摇床培养30min,60?水浴30min,然后用接种环蘸取,在肉汁培养基平板上划线分离。挑取菌落继续划线分离,直到得到单菌落纯菌株为止。 2 地衣芽孢杆菌生理生化鉴定实验 根据上述分离培养基和分离方法,共计分离得到芽孢杆菌23株,编号分别为1,、2,、3,、4,……22,、23,,接下来通过实验对这些菌株进行筛选和鉴定。地衣芽孢杆菌鉴定参考《伯杰氏细菌鉴定手册》及《常见细菌系统鉴定手册》,东秀珠,蔡妙英等编著，的方法,有所改进,以下为具体的生理生化实验鉴定方法。 2.1柠檬酸盐与丙酸盐利用实验 某些细菌能利用柠檬酸盐或丙酸盐作为唯一碳源,并利用磷酸铵作为氮源,将柠檬酸分解为二氧化碳,则培养基中由于有游离钠离子存在而呈碱性。培养基配方,柠檬酸钠,或丙酸钠，0.2,,NaC1 0.5,,MgSO4•7H2O 0.01,,(NH4)2HPO4 0.1,,K2HPO4•3H2O 0.1,,1%溴百里酚蓝水溶液10ml,琼脂2,。以上成分除指示剂外其余加热溶解,调节pH,6.8-7.0,并加入指示剂,使培养基呈草绿色,分装试管,灭菌后摆斜面。 取幼龄菌种接种于斜面上,适温培养3-7d,培养基呈碱性,蓝色，者为阳性反应,不变者为阴性。只有地衣芽孢杆菌可以利用丙酸钠,为阳性反应,而其他芽孢杆菌均不能利用丙酸钠,为阴性反应,但很多种芽孢杆菌都可以利用柠檬酸钠。 2.2产酶实验 2.2.1过氧化氢酶实验 过氧化氢酶又称接触酶,能催化过氧化氢分解水和氧。将芽孢杆菌接种于肉汁培养基斜面上,适温培养18-24h。取干净的载玻片,在上面滴1滴3-5,的H2O2,挑取1环培养18-24h的菌苔,在H2O2溶液中涂抹,若有气泡,氧气，出现,则为过氧化氢酶阳性,无气泡者为阴性。也可将过氧化氢溶液直接加到菌种斜面上,观察气泡的产生。 1 2.2.2淀粉酶实验 某些细菌可以产生分解淀粉的酶,把淀粉水解为无色糊精等小分子,或进一步水解为麦芽糖或葡萄糖。淀粉水解后,遇碘不变蓝色。 培养基,在肉汤蛋白胨琼脂中添加0.2,的可溶性淀粉,分装三角瓶,121? 20min灭菌备用。卢戈氏(Lugol)碘液,碘片1g,碘化钾2g,蒸馏水300ml,先将碘化钾溶解在少量水中,再将碘片溶解在碘化钾溶液中,混匀,定容。 将灭菌后放入培养基冷却到50?左右,倒成平板,凝固后,取18-24h的纯培养物点于平板上,每皿可点种3-5个菌株,适温培养2-4d,形成菌落后,在平板上滴加卢戈氏碘液,以铺满菌落周围为度,平板成蓝色。如果菌落周围有无色透明圈出现,说明淀粉已经被水解,实验为阳性,否则为阴性。透明圈的大小一般说明水解淀粉的能力。 2.2.3 纤维素酶实验 采用刚果红染色法,如果有刚果红存在,刚果红可以与纤维素结合成红色螯合物,培养基颜色为红色。如果培养基中有能够产纤维素酶的细菌,将纤维素分解,不能形成螯合物,在菌落周围形成透明圈。这样可以鉴定产纤维素酶的细菌。 培养基的配制,CMC-Na 5-10g,酵母膏 1g,KH2PO4 0.25g,琼脂15g,将上述物质溶解后,用蒸馏水定容到1000ml,加入5ml 10mg/ml的刚果红溶液,121?,灭菌20min,冷却倒平板,凝固后待用。取18-24h的培养物点于平板上,每皿可点种3-5个菌株,适温培养2-4d,形成菌落后,观察产生透明圈情况,产生纤维素酶的菌落周围将会出现明显的透明圈,否则为阴性。 2.2.4明胶液化实验 明胶是一种动物性蛋白,明胶的水解是由于有些细菌具有明胶酶,亦称类蛋白水解酶，,能将明胶先水解为多肽,又进一步水解为氨基酸,失去凝胶性质而液化。 ?则自行液化。明胶分解后,其分子变明胶培养基本身低于20?凝固,高于24 小,虽在低于20?的温度下也不再凝固。培养基,蛋白胨5g,明胶120g,蒸馏水1000ml,调节pH7.2-7.4,分装试管,培养基高度约4-5cm,115? 20min灭菌。 挑取18-24h培养物,以穿刺法接种于试管中央,于20-22?培养。每天观察结果,液化为阳性,否则为阴性。 2.3需厌氧实验 在培养基中加入还原剂,如巯基醋酸钠和甲醛合次硫酸钠等,以除去培养基中的氧气或氧化型物质,使厌氧菌能在有氧情况下生长。培养基,酪素水解物20g,NaC1 5g,巯基醋酸钠HS•CH2COONa 2g,甲醛合次硫酸钠HOCH2•SO2Na 1g,琼脂15g,蒸馏水1000ml,调节pH 7.2,分装试管121?灭菌20min,培养基不摆斜面。 用1环肉汤菌液,穿刺接种到上述培养基中,必须穿刺到管底。30?培养3-7d观察结果。如细菌在琼脂柱表面上生长者为好氧菌,如沿着穿刺线生长者为厌氧菌或兼性厌氧菌。 2.4乙酰甲基甲醇实验(V.P实验) 某些细菌在葡萄糖蛋白胨水培养基中能分解葡萄糖产生丙酮酸,丙酮酸缩合,脱羧成乙酰甲基甲醇,后者在强碱环境下,被氧化为二乙酰,二乙酰与蛋白胨中的胍基生成红色化合物,称V.P阳性反应。培养基,蛋[FS:PAGE]白胨5g,葡萄糖5g,NaC1 5g,蒸馏水1000ml。调节pH7.0-7.2,分装试管,每管约装4-5ml,115?灭菌20min。试剂,40,NaOH,或KOH，,肌酸。 2 接种于上述培养液中,适温培养4-6d。如为阴性,可适当延长培养时间。取培养液,约2ml，和等量的40,NaOH相混合,加少量,约0.5-1.0mg，肌酸,充分振荡2-5min,如培养液出现红色即为阳性。有时需放置更长时间或在热水中稍加热,以加速反应进行。 2.5酪素水解实验 牛奶平板的制备,取5g脱脂奶粉加入50ml蒸馏水中,或用50ml脱脂牛奶，,取1.5g琼脂溶于50ml蒸馏水中,将两溶液分开灭菌。待冷至45-50?时,将两液混匀倒平板,即成牛奶平板。将平板倒置过夜,使表面水分干燥,然后将菌种点接在平板上,每皿可点接3-5个株菌。适温培养3-5d,菌落周围和下面酪素是否已被分解而呈透明。配制该培养基时,切勿将牛奶和琼脂混合灭菌,以防牛奶凝固。 2.6酪氨酸水解实验 有些细菌具有酪氨酸酶,能使含酚类的化合物如酪氨酸、酚等氧化成醌,再经脱水、聚合等一系列反应,最后形成黑色沉淀物质。培养基,采用肉汤蛋白胨培养基加0.1,L-酪氨酸,调节pH为7.0,分装121?灭菌20min后摆成斜面。接种后培养3-7d,观察斜面有黑色素者为阳性反应。 2.7酸性培养基实验 培养基,蛋白胨10g,葡萄糖20g,蒸馏水1000ml,调节pH 5.7,115?灭菌20min。取菌液一环,接种于上述培养基中,同时接种普通肉汤液,pH 7.0，作对照。适温培养1-3d内观察生长情况。该培养液要求十分澄清,pH必须准确,用pH计调测。 2.8耐盐性实验 耐盐性实验是观察渗透压对细菌生长的影响。由于不同菌类耐盐性不同,故常以此作为鉴别特征。一般可根据不同种类的菌株,选择其适合生长的培养基,在其中加入不同量的NaCl,接种后观察其生长与否,以判断其耐盐性。 根据鉴定需要,以肉汤培养液配成不同浓度NaCl溶液,如2,、5,、7,、10,等。培养基要求十分澄清,接种时应采用幼龄菌液接种,适温培养3-7d,与未接种的对照管对比,目测生长情况。 2.9生长温度实验 细菌生长的最高、最适、最低温度,常常是某些细菌鉴定的特征之一。测定细菌的生长温度,要求培养液十分澄清,如营养肉汁培养基，,并采用液体菌种直接接种,放置于恒温水浴培养。在指定温度下培养2-5d,观察生长情况。若在接近0?的低温培养,则观察时间可延长7-10d或更长。培养5d能生长者按生长计算,否则按不生长计算,可疑者需重新进行培养实验。 2.10产酱香实验 地衣芽孢杆菌在酱香型白酒生产中的一个重要作用就是产生酱香物质,这与其产生蛋白酶类有关,蛋白酶将蛋白质分解成肽类和氨基酸,经过发酵会产生酱香物质。本实验采用三种培养基鉴定地衣芽孢杆菌是否产生酱香物质。 甘氨酸培养基,甘氨酸5g,葡萄糖10g,NaCl 3g,蒸馏水1000ml,pH 6-7,分装50ml到100ml三角瓶中,121?灭菌20min。营养肉汁培养基,牛肉膏3g,蛋白胨10g,NaCl 5g,蒸馏水1000ml,pH 7.0-7.4,分装50ml到100ml三角瓶中,121?灭菌30min。以上两种培养基均为液体培养基,取培养18-24h菌种接入到液体培养基中,摇床37?培养48-60h,取出,鉴定是否产生酱香物质。 3 麸皮培养基,麸皮1000g,NaOH 6g,蒸馏水600ml,分装到500ml三角瓶中,121?灭菌40min。接入液体培养菌种10,,恒温箱培养3-5d,取出,鉴定是否产生酱香物质。 2.11糖发酵实验 糖发酵实验主要是看该种糖能不能被微生物利用,如果能够利用则会发酵产酸,培养基中的指示剂会由紫色变黄色,同时可能伴有气泡产生,如果发酵产气则试管中倒扣的杜氏管中培养基会被排出,里面充满气体。本实验中糖发酵实验选取葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖、果糖、甘露醇、阿拉伯糖、木糖等。培养基配方为,(NH4)2HPO4 1g,MgSO4•7H2O 0.2[FS:PAGE]g,KC1 0.2g,酵母膏0.2g,糖或醇类10g,蒸馏水1000ml,0.04,溴甲酚紫乙醇溶液20ml,调节pH 7.0-7.2,分装试管,每管装10ml培养基,试管内放有杜氏发酵管,115?灭菌20min,排净杜氏管中的空气。 以18-24h的幼龄菌种,接种一环到上述培养基中,适温培养3-5d,观察指示剂是否由紫色变黄,杜氏管中是否有空气。 3生理生化实验鉴定结果,具体结果见附表1,2,3， 3.1柠檬酸盐与丙酸盐利用实验结果 23个菌株均可以利用柠檬酸盐,这也与多种芽孢杆菌都可以利用柠檬酸钠的特征符合。只有地衣芽孢杆菌可以利用丙酸盐,2,、5,、8,、10,、13,、14,、16,、17,、18,、19,、21,、22,这12株均可以利用丙酸盐,可以初步认为这12株为地衣芽孢杆菌,还需要其他的生理生化实验来验证。 3.2淀粉酶实验结果 ,、7,、9,三实验的23个菌株中,11,菌株不能水解淀粉,未产生透明圈。3个菌株产生的透明圈最大,几乎铺满整个平板,其余各个菌株产生的透明圈大小不一。各个菌株水解淀粉的能力各不相同,3,、7,、9,三个菌株水解淀粉的能力最强,在初步筛选出的12株地衣芽孢杆菌中,5,菌株产淀粉酶能力较强,21,产淀粉酶能力较差。透明圈如图1,2,3,4,5,6。 4 3.3酪素水解实验结果 牛奶的重要组成成分为酪蛋白,所以配制牛奶琼脂培养基,如果菌株可以利用酪蛋白则产生透明圈,给人的印象很直接。在实验菌株中,1,、3,、7,、9,菌株产生的透明圈最大,其中接种9,菌株的平板完全变为透明的,说明水解酪素的能力最强。其余菌株对酪素水解能力各不相同。 3.4明胶液化实验结果 在明胶液化实验中,1,、2,、3,、4,、7,、8,、9,、11,、12,、16,、17,菌株液化明胶的能力最强,接种7d后就将明胶全部液化。说明这些菌株产生的类蛋白酶类丰富,使明胶水解迅速。在所有菌株中,6,、19,对明胶的液 5 化能力最弱。 3.5产酱香实验结果 地衣芽孢杆菌是酱香大曲中的重要微生物,能够产生酱香物质,实验的23个菌株均是从清香大曲和酒醅中分离得到的,因此我们对其是否产酱香进行确认。通过两种液体培养基,甘氨酸培养基和营养肉汁培养基，和麸皮固体培养基发酵培养,我们发现这些菌株虽然能够产生酱香物质,但酱香气味不典型,不明显,而且每个菌株产生的味道都各不相同。 4.地衣芽孢杆菌分子鉴定实验 对以上经过生理生化实验筛选出来的地衣芽孢杆菌进行分子鉴定。从地衣芽孢杆菌中提取16S rDNA片段,通过测序获得16S rDNA序列信息,再与16S rDNA数据库或其他数据库进行比较,从而鉴定种类。本实验与中国食品发酵工业研究院合作完成。 鉴定中用到的两对细菌通用引物是WBAC1/WBAC2和341/534。DNA提取采用煮沸法和TIANGEN试剂公司的细菌基因组提取试剂盒两种提取方法,DNA纯化使用上海申能博彩琼脂糖凝胶回收纯化试剂盒。采用美国ABI 9700型PCR仪进行扩增。 由上海生工生化公司测序,将测定的序列处理后提交到NCBI的Gene Bank进行序列比对,与Bacillus licheniformis,地衣芽孢杆菌，的一致率达到100,。鉴定结果为地衣芽孢杆菌。 5. 总结与讨论 5.1从大曲和酒醅中分离微生物,60?水浴30min可以排除酵母、霉菌等的干扰,而芽孢杆菌也不会死亡,所以该方法比较容易分离得到纯芽孢杆菌菌株。 5.2只有地衣芽孢杆菌可以利用丙酸盐,所以是否利用丙酸盐可以作为鉴定地衣芽孢杆菌的一个重要依据,但是其他生理生化实验同样是必不可少的。 5.3 在产酶实验中,所有菌株均产生过氧化氢酶,这与芽孢杆菌的性质相符合,但是分离得到的所有芽孢杆菌均不产纤维素酶。产淀粉酶实验中,淀粉水解是逐步进行的过程,与菌种产生淀粉酶的能力、培养时间,培养基淀粉含量和pH等均有一定关系。培养基必须为中性或微酸性,以pH7.2最适。 5.4 地衣芽孢杆菌产酱香不典型,因为这些菌株都是从清香大曲和酒醅中分离的,所以在发酵过程中的所起的作用也各不相同,产酱香不典型的特征正好可以应用到二锅头酒的生产中,不会将酒的香型改变,而且还可以增加酒体的醇厚度。 5.5全部的生理生化实验都是与地衣芽孢杆菌的特征相对应的,结合丙酸盐利用实验和一系列的生理生化实验可以基本鉴定地衣芽孢杆菌。本文为地衣芽孢杆菌的鉴定提供了简便、易行的实验方法。 6 7 8 9