MDA等生理指标测定方法

MDA等生理指标测定方法 1 叶绿素含量测定 取样 0.2g 左右，剪碎，放入黑色胶卷盒中加 20ml 等量丙酮乙醇混合液(0 ，48h 以后，待材料变白，取上清夜于 440、645、663nm 处测其 OD号调零管:20ml 等量丙酮乙醇混合液)值。 计算: 叶绿素 a 含量 C,12.7d663-2.69d645 叶绿素 b 含量 C,22.9d645-4.68d663 叶绿素总含量 C,20.2d6458.02d663 类胡罗卜素含量 C,4.7d440-0.27叶绿素 a 含量叶绿素 b 含 量2 脯氨酸含量的测定配药:13磺基水杨酸溶液: 6g----200ml 22.5酸性茚三酮显色液:冰乙酸和 6mol/l 磷酸经 3:2 混合，作为溶剂进行配制。 冰乙酸 90ml 85磷酸(15mol/l) 24ml 用去离子水定溶至 60ml 茚三酮 3.75g (1)脯氨酸提取:取不同处理的剪碎叶片 0.5g，分别置于大试管中，加入 5ml 3磺基水杨酸溶液，测定:管口加盖玻璃球，于沸水浴中浸提 10min. 2取出试管，待冷却至室温后，吸取上清液 2ml，加 2ml 冰乙酸和 3ml 显色液(0 号调零管:2ml ，于沸水浴中加热 40min.冰乙酸3ml 显色液2ml 去离子水) 3取出冷却后向各试管加入 5ml 甲笨充分振荡，以萃取红色物质。静置，待分层后吸取甲笨层，以 0 号管为对照在波长 520nm 下比色。计算: 从曲线中查出测定液中脯氨酸浓度，按下式计算样品中脯氨酸含量。 Y C V / A W ，ug式中:C――提取液中脯氨酸含量(由标准曲线求得)V――提取液总体积，5 mlA――测定时所吸取的体积，2mlW――样品量，g ，ug/g.Y――脯氨酸含量(干重或鲜重)SODPODMDA 酶和可溶性蛋白质的配药:3 个重复， 1 SOD 1 pH7.8 磷酸缓冲液:a14.4gNa2HPO412H2O 溶于 400mL 水中取 366mL; (b)6.24gNaH2PO42H2O 溶于 400mL 水中取 34mL两液混成 400mL，即为 pH7.8 磷酸缓冲液。 2 104 mmol/L 蛋氨酸甲硫氨酸:称取 0.39g 蛋氨酸，用蒸馏水定容至 25mL 容量瓶中 3 300 umol/L NBT氮兰四唑:称取 0.0125gNBT，用蒸馏水定容至 50mL. 4 0.8mmol/L EDTA:称取 0.012mgEDTA，用蒸馏水定容至 50mL 容量瓶中 5 320uM/L 核黄素:称取 0.012g 核黄素，用蒸馏水定容至 100mL 容量瓶中 反应液: 配药用量 pH7.8 磷酸缓冲液: 2ml 100ml 104 mmol/L 蛋氨酸甲硫氨酸 0.5ml 25ml 300 umol/L NBT氮兰四唑 1ml 50ml 0.8mol/L EDTA: 0.5ml 25ml 2 POD 1 pH7.0 的 10mmol/L 磷酸缓冲液a 称取 1.56g NaH2PO42H2O定容于 1000ml 容量瓶中取 390ml.b 称取 3.5g Na2HPO412H2O 定容于 1000ml 容量瓶中。取 610ml.混合后即为 1000ml pH7.0 的磷酸 缓冲液. 2 40mmol/LH2O2 0.3ml ------100ml 用蒸馏水配制 3 20mmol/L 愈创木酚 0.1ml------50ml 用蒸馏水配制 4 20,三氯乙酸 10g------50ml 用蒸馏水配制 反应液: 配药用量 (1) 磷酸缓冲液 (pH7) 2.91ml 291 ml 2 愈创木酚 0.05ml 5 ml 3 40mmol/LH2O2 0.02ml 2 ml 3 MDA 110三氯乙酸(TCA) 10g------100ml 2 0.6硫代巴比妥酸(TBA) 先加少量的氢氧化钠(1mol/l)溶解， 再用 10的三氯乙酸定溶。 0.6g------5ml------95ml 4 可溶性蛋白质 溶 加 考马斯亮蓝 G,250: 称 0.1g 考马斯亮蓝 G,250， 于 50ml 90乙醇中， 85的磷酸中 100ml， 最后用蒸馏水定溶至 1000ml，贮于棕色瓶中，此溶液常温下可放置一个月。 酶液制备:取洗净的鲜材料 0.5g 置于冰浴的研钵中，先加 2mLpH7.8 的磷酸缓冲液，充分研磨至无粗纤维 为止倒入离心管中，再用 3mL(21)磷酸缓冲液洗净研钵并入离心管，在 10000 转离心 20 分钟，上清液 即为 SOD、POD 粗提液。 1 SOD 测定 取 4mL 反应液，加入 50uL 的酶提取液再加 50uL 核黄素 另作 6 支不加酶液的处理 (用缓冲液代替)作为最大光化还原管(0 号调零管:pH7.8 的磷酸缓冲液) ，立即置于 4000LX 的荧光灯 (光照培 养箱全光照:H1。温度为室温即可)下进行光还原反应，15 分钟后，用黑纸遮光，终止反应。 并用 0 号调零管调零点，在 560nm 波长下比色测定 OD 值。按下式计算 SOD 活性。 对照 OD 值,样品 OD 值样品体积 SOD 活性 对照 OD 值样品鲜重,测定时样品用量2 POD 测定 取 3mL 反应液，加入 20uL 的酶提取液于小管中，充分混合后，在 34?C 恒温水浴中反应三分钟。然后加 20,三氯乙酸 20uL，终止酶活性。以 pH7.0 的磷酸缓冲液调零点，在 470nm 波长下测其光密度。 样品 ODPOD 的 OD 值, 稀释倍数 0.5g3 MDA 测定 取酶液 2ml 加 2ml0.6的 TBA 于试管中(0 号调零管:2ml2mlTBA) ，摇匀后沸水浴中加热 15min，冷却后，4000 转/分钟，离心 10min.取上清液于 532、600、450nm 处测其 OD 值，以 0号调零管调零。 ,MDA 浓度6.45(OD532-OD600)-0.56OD450(μmolL 1) (μmol/g FW)MDA 含量MDA 浓度提取液体积5ml/鲜重(0.5g)4 可溶性蛋白质测定 取酶液 1ml 加 5ml 考马斯亮蓝 G,250 于试管中(0 号调零管:5ml 考马斯亮蓝 G,2501mlpH7.8 的磷酸缓冲液)，充分混合，放置 15min，.取上清液于于 593nm 处测其 OD 值，以5ml 考马斯亮蓝 G,2501mlpH7.8 的磷酸缓冲液调零。计算:样品中蛋白质含量(mg/g)CVt/V1Fw1000C查标准曲线的蛋白质含量Vt提取液总体积ml原始提取液Fw样品鲜重gV1测定时加样量(ml)原始提取液