【doc】龟裂链霉菌菌株MY02发酵液中抑菌活性组份SN06的分离纯化

【doc】龟裂链霉菌菌株MY02发酵液中抑菌活性组份SN06的分离纯化 龟裂链霉菌菌株MY02发酵液中抑菌活性 组份SN06的分离纯化 第31卷 2004正 第4期 12月 植物保护 ACTAPHYTOPHYIACICASINICA V01.31No.4 Dec.2Oo4 龟裂链霉菌菌株MY02发酵液中抑菌 活性组份SN06的分离纯化 刘秋吴元华'于基成 (1.大连民族学院生物工程系,大连116600;2.沈阳农业大学植物保护学院,沈阳110161) 摘要:本实验室自蔬菜保护地筛选的一株链霉菌菌株,经鉴定为Streptomyces rimosusdaishanensis,编号为MY02,其发酵液中活性组份SN06对多种蔬菜真 菌病害都有较好的防治效果.采用Betina溶剂系统进行了SN06薄层层析展开 剂的筛选,结果明,活性组分SN06在弱极性的展开剂中分离效果较好,可选 用正丁醇的水饱和溶液,甲醇:水(40:60),正丙醇:水(40:60)作为适宜的展 开剂.采用pH层析和纸电泳方法分析SN06的电离性质,结果表明,SN06属于 中性抗生素.在此基础上,确定选用萃取法初步分离SN06,选用的最佳萃取剂 为正丁醇,最后采用硅胶薄板层析法,得到活性组分SN06淡黄色晶体.经高压 液相色谱分析,分离提取的活性组分SN06纯度可达96%. 关键词:龟裂链霉菌;活性组分;纯化 农用抗生素作为生物农药的重要类群,因其具有低毒,高效,选择性强,残留时间短等 优点,正日益受到世界各国的重视,如井冈霉素,春雷霉素,多效霉素,农抗120,中生菌素 等在植物病害防治上已被广泛应用?J.目前,随着农用抗生素研究的深入,尤其是新型 农用抗生素的发现,研究人员也越来越认识到分离纯化对于获得自主知识产权的农用抗 生素,明确其化学结构和作用机理,保持和提高农用抗生素的防治效果,扩大其应用范围, 以及研制出新农药和加强国际市场竞争能力均具有重要的作用. 本实验室自蔬菜保护地筛选的一株链霉菌菌株,经鉴定为Streptomycesrimosusdaheis— hanensis,编号为MY02,其发酵液中活性组份SN06对多种蔬菜真菌病害都有较好的防治 效果J.笔者拟通过Betina溶剂系统进行SN06薄层层析展开剂的筛选,采用pH层析和 纸电泳方法,分析活性组分SN06的电离性质,以确定SN06适宜的分离纯化方法,进而获 得SN06纯品,为研制开发出新农药,进行SN06对植物病原真菌的作用机理研究,计算发 酵液中SN06的收率,以及为以后的中试放大生产等提供必要的前提. 基金项目:国家烟草专卖局攻关项目(叭138949);辽宁省自然科学基金(20022085)资助 作者简介:刘秋(1969一),女,副教授,主要从事生物农药的研制工作(E—mail:liuqiu@dlnu.edu.cn) 通讯作者(E—mail:wuyh09@vip.sina.corn) 收稿日期:2003—10—13 植物保护31卷 1材料与方法 1.1材料 供试菌株:菌株MY02为大连民族学院生物工程系微生物实验室分离保存. 仪器:uV一1601型紫外分光光度计,DYY-6C型电泳仪,J2一MC高速冷冻离心机,LC一 6A型高效液相色谱仪(日本岛津),具有紫外可变波长器,色谱处理机.色谱柱si— nocromC18柱(4.0mm×250mm,0.51xm). 1.2方法 1.2.1发酵液的制备 将菌株MY02的斜面菌种用无菌水洗下,转入另一个装有玻璃珠的无菌管中配成菌 悬液,震荡使成均匀的孢子悬浮液,最终浓度为10个孢-~/mL.按10%的接种量接人发 酵培养基内,然后置于28~C,转速160r/min的摇床上培养96h.发酵结束后将发酵液加 热沸腾终止菌体代谢后凉至室温,取15mL于6000r/min离心15min,取上清液作抑菌活 性测定. 1.2.2发酵液的预处理 摇瓶发酵后,将发酵液用草酸调pH至2—3,然后将发酵液离心沉降,上清液用 0.451xm的微孔滤膜过滤,滤出的液体冰箱储藏备用. 1.2.3活性组分SN06的分离纯化 纸层析和pH层析:纸层析是鉴别抗生素种类广泛应用的方法,采用Betina_6的溶剂 系统,根据层析结果,选择适宜的薄层层析展开剂.pH层析参照顾觉奋方法],在不同 pH的缓冲区间点样,点样量151xL,然后在水饱和的正丁醇中展层,用平板生物显影法测 值. 活性组分SN06的电离性质:缓冲系统及纸电泳方法见参考文献J.点样量15L, 电压400V,电泳时间1h,然后取出滤纸条晾干,紫外照射灭菌,用平板生物显影法进行 测定. 溶媒萃取:选用常用的4种萃取剂:氯仿,正丁醇,乙酸乙酯,乙酸丁酯,萃取剂与预处 理发酵液的比例为1:4.室温振摇1h,静置过夜.用滤纸片法分别测萃取液和萃取余液 的活性. 薄层层析:玻璃板规格8cm×20cm,以硅胶GF254铺制硅胶板.根据纸层析和萃取 试验的结果,展开剂选择正丁醇:丙酮(40:40);正丁醇:乙酸乙酯(40:40);正丁醇:甲 醇(40:40);正丁醇:甲醇:水(30:30:40);正丁醇:丙酮:水(40:20:40);正丁醇:丙酮 :水(30:30:40)等混合溶剂进行测试.展层前将硅胶板两侧刮掉0.5cm(避免边缘效 应),样品采用正丁醇萃取液,点样量为151xL,在密闭的层析缸中上行展层,254nm紫外灯 下观察萃取液分离结果. 1.2.4层析法制备活性组分SN06 层析时采用上述方法,只是将样品点成长条,点样量为2001xL,以甲醇:正丁醇:水= 30:30:40为展开剂,上行展层,观察色带分离状况.将分离的色带刮下,其余部分每隔 4期刘秋等:龟裂链霉菌菌株MY02发酵液中抑菌活性组份SN06的分离纯化355 1cm作为活性检测区.刮下后,分别用甲醇振摇浸泡提取6h.抽滤后,用滤纸片法测各 色带及各区上清液的活性.然后,将含有活性组分SN06的甲醇溶液于lO000r/min离心 10min,收集上清液,将甲醇挥发掉,得活性组分SN06晶体. 1.2.5高压液相色谱法检测组分SN06的纯度 色谱条件:流动相为甲醇:水=60:40;流速0.85mL/min;柱温,室温;进样量20~L; 紫外检测波长304nm. 活性组分SN06的纯度分析:将上述获得的SN06结晶用甲醇(色谱纯)溶解,经 0.45i~m孔径滤膜过滤,并在超声波浴槽中脱气20min.在相同色谱条件下,与未加样品 的空白HPLC级甲醇溶液进行对照,根据出峰多少及相应的峰面积确定样品中活性组分 SN06的纯度. 2结果与分析 2.1活性组分sNo6的分离纯化 2.1.1活性组分SN06纸层析与pH层析 Betina溶剂系统中,正丙醇:水(40:60,v/v),正丁醇的水饱和溶液,甲基乙基酮:正 丁醇:水(30:5:65,v/v),甲醇:3%氯化铵水溶液(70:30,v/v),甲醇:水(4o:60,v/v), 蒸馏水,乙酸乙酯的水饱和溶液,苯的水饱和溶液的Rf值依次为0.9669,0.6688,0.6623, 0.5286,0.2113,0,0,0.活性组分SN06的纸层析结果说明,活性组分SN06在弱极性的 展开剂中展层效果较好,可选用正丁醇的水饱和溶液,甲醇:水(40:60),正丙醇:水(40 :60)作为展开剂.在以水饱和的正丁醇作为展开剂时,活性组分SN06的pH层析图谱说 明,该抗生素基本属于中性.在不同的溶剂系统中其Rf基本一致,在各系统中均没有出 现两个抑菌圈,说明活性组分SN06可能为单组分,结果见图1. 23456789 pH值pHvalue 图1活性组分SN06的pH层析结果 Fig.1nlepH?PCresu1tofSN06 注:展开剂为水饱和的正丁醇.Note:Thedevelopingsolvent isn-butanolsoltItionsaturatedwithdistilledwater. 2.1.2活性组分SN06的电离性质 纸电泳后经平板生物显影法测定抑菌圈的位置.在pH4及pH8的缓冲系统中,抑菌 植物保护3l卷 圈均紧挨点样点,基本未见移动,根据电泳结果,可推断出此抗生素为中性抗生素. 2.1.3溶媒萃取 影响萃取的因素主要有萃取剂的选择,萃取剂与溶液的比例等.根据前人的研究,采 用萃取剂与发酵液的比例为1:4.由萃取液和萃余液的抑菌活性可以看出,4种萃取剂 中,只有正丁醇的萃取效果很好,正丁醇萃取液抑菌圈直径为28.32mm.其它3种常用 的萃取剂对活性组分SN06根本没有萃取的功能,因此选用正丁醇作为活性组分SN06的 最佳萃取剂(表1). 表1不同萃取剂对活性组分SN06的萃取结果 TaJ)lelTheextractionresultsofSNO6indifferentsolvents 2.1.4薄层层析 根据活性组分SN06萃取液在6种溶剂系统中的薄层结果见表2,以正丁醇:甲醇: 水(30:30:40)作为展开剂的层析结果较好,紫外观察(254nm)能出现3个较清晰的点, Rf值分别为0.34,0.84,0.91. 表2活性组分SN06萃取液在6种溶剂系统中的薄层结果 TaJ)le2TheTLCresultsofSNO6indifferentsolvents 溶剂系统SolventRf溶剂系统SolventRf 正丁醇:丙酮(40:40)0.44正丁醇:甲醇:水(30:30:40)0.34,0.84,0.91 N—butanol:Acetone脱尾TailingN.butanol:Methanol:Water 正丁醇:乙酸乙酯(40:40)0.24正丁醇:丙酮:水(40:20:40)0.34 N?butanol:ButylacetateN.butanol:Acetone:Water脱尾Tailing 正丁醇:甲醇(40:40)0.33,0.78正丁醇:丙酮:水(30:30:40)0.27 N?butanol:Methanol脱尾TailingN?butanol:Acetone:Water脱尾Tailing 2.2层析法制备活性组分SN06 为较大量制备组分SN06及活性检测需要,层析时将样品点成条状,点样量为200pLL, 在正丁醇:甲醇:水(30:30:40)溶剂系统中上行展层,同样可见3条分离的黄色色带,3 条色带及每隔1cm区域活性检测结果表明,只有Rf为0.842的色带具有活性.将具有活 4期刘秋等:龟裂链霉菌菌株MY02发酵液中抑菌活性组份SN06的分离纯化357 性组分SN06的甲醇溶液真空冷冻抽干,得到 活性组分SN06的淡黄色晶体. 2.3高压液相色谱法检测组分SN06的纯度 因为活性组分SN06溶于甲醇,而甲醇一 水系统是在十八烷基柱中应用最多的流动相, 以键合十八烷基硅烷柱进行色谱分离时影响其 分离效果的主要因素是流动相的组成及浓度, 以甲醇:水分别为65:35,60:40,40:60,20:80 四种流动相的液进行分离,以甲醇:水为 60:40的分离效果较好.因此,选甲醇:水(60 :40)作为流动相.活性组分SN06晶体在上述 条件下进行色谱分析,检测波长304nm时,在 2.296min时出现吸收峰,吸收峰峰形尖锐,对 称性好,杂峰较小,说明采用该种分离方法可获 得高纯度的SN06,其纯度达96%(图2). 3讨论 箸 一 七 2 0 《 ,-一 瑙 宦i 24 时间Time(min) 图2活性组分SN06的色谱分离图 Fig.2ChromatographseparationofSNO6 活性组分SN06极性及溶解度试验是确定抗生素提取方法的前提条件,而纸层析和 薄层层析法是在鉴别抗生素过程中比较常用的方法,在新抗生素筛选中起着重要作用,它 不仅能用于定量分析,还可用于早期鉴别和决定提取方法等J.层析法的关键就是展开 剂的选择,展开剂既可以是单一溶剂,也可以是混合溶剂,选用的溶剂系统应对被分离溶 质有一定的溶剂溶度,可取溶解度较大的溶剂与较小的溶剂按不同的比例配制,有时还需 加人第三种溶剂,以使前两种溶剂的互溶度增加J.本试验首先采用分离抗生素中常用 的Betina溶剂系统,再经过pH纸层析和纸电泳,以选择发酵液中活性组份SN06适宜的 分离纯化方法.试验结果,采用萃取法和硅胶薄板层析纯化活性组分SN06是可行 的,得到了SN06的淡黄色晶体. 参考文献(References) l尹莘耘.农用抗生素和抗生菌的筛选.抗生素,1983,8(1):6_4—65 2朱昌雄,谢德龄.农抗120防治作物真菌病害的效果.生物防治通报,1990,6(4):179—182 3蒋细良,谢德龄.中生菌素的抗生作用.植物病理,1997,27(2):133—138 4周启.农抗5102抗真菌性能的研究.抗生素,1982,6(1):l一6 5刘秋,杜春梅,祁岑,等.凯地菌素对植物病原真菌的拮抗性及其产生菌SY20-4的 鉴定.植物病理学研究进展.北 京:中国农业出版社,2001,105—109 6BetinaVA.Systematicanalysisofantibioticsusingpaperchromatography.JournalofChro matography,1964,15:379-392 7顾觉奋.分离纯化工艺原理,北京:中国医药科技出版社,1994,30—87 8何培青,田黎,李光友,等.海洋细菌B-9987发酵条件的优化及胞外抑菌物质的理 化特性.中国海洋药物,2001, (2):8一l2 m?加 OOOOOOOOOO 358植物保护31卷 9顾觉奋.微生物药品化学与分析.北京:军事医学科学出版社,1995,50—94 PurificationofactivecomponentsSN06infermentation ofStreptomycesrimosusMY02 LIUQiu,一wuYuan.huaYUji-cheng (1.BioengineeringDepartment,DalianNationalitiesUniversity,Dalian116600, China;2.PlantProtectionCollege,ShenyangAgricultural University,Shenyang110161,China) Abstract:Streptomycesrimosusdaheishanensiswasscannedfromprotectedvegetablefield ?Ac. tivecomponentsSN06extractedfromfermentationofStreptomycesrimosusdaheishanensi s showedantagonismagainst dissolutionandionization screenedbyBetinapaperC pathogenicfungussuchasFulvialva,Botrytiscinema.Polarity, characteristicshavebeenanalysed.ThedevelopingsolventWas hromatographysystem.theresultshowedthatn.butanolsolutionsat. uratedwithdistilledwater.methanol:distilledwater(40:60),n-propylalcohol:distilledwa. ter(40:60isthegooddevelopingsolvent.SN06isaneutralantibioticbypH-PCandpapere. lectrophoresis.AtfirstthefermentationWasfilteredandextractedwithn-butanol,andthenthe slightvellowcrystalofSN06obtainedbysilicagelseparation.AnalysisofHPLCshowedthat thepurityofSN06is96%. Keywords:Streptomycesrimosus;activecomponent;purification