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绝经前盆腔器官膨出患者子宫主韧带中Elastin、LOX基因表达的研究

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绝经前盆腔器官膨出患者子宫主韧带中Elastin、LOX基因表达的研究绝经前盆腔器官膨出患者子宫主韧带中Elastin、LOX基因表达的研究 作者:张琳琳,于浩,张师前 单位:山东大学齐鲁医院妇科, 济南 【摘要】 目的 检测女性盆底器官膨出(pelvic organ prolapse, POP)患者子宫主韧带中弹性蛋白(Elastin)和赖氨酰氧化酶(1ysyl oxidase, LOX)表达水平,探讨Elastin、LOX基因与POP发生机制间的关系。方法 选择因POP而行全子宫切除术的绝经前患者42例,同期选择因妇科良性疾病、无压力性尿失禁(stress urinary incon...
绝经前盆腔器官膨出患者子宫主韧带中Elastin、LOX基因表达的研究
绝经前盆腔器官膨出患者子宫主韧带中Elastin、LOX基因表达的研究 作者:张琳琳,于浩,张师前 单位:山东大学齐鲁医院妇科, 济南 【摘要】 目的 检测女性盆底器官膨出(pelvic organ prolapse, POP)患者子宫主韧带中弹性蛋白(Elastin)和赖氨酰氧化酶(1ysyl oxidase, LOX)表达水平,探讨Elastin、LOX基因与POP发生机制间的关系。方法 选择因POP而行全子宫切除术的绝经前患者42例,同期选择因妇科良性疾病、无压力性尿失禁(stress urinary incontinence,SUI)或POP行全子宫切除术绝经前患者27例作为对照。术中取子宫主韧带,采用逆转录-聚合酶链式反应(RTPCR)法测定Elastin和LOX的mRNA表达,免疫蛋白印迹法(Western blotting)检测两种蛋白的表达。结果 POP组子宫主韧带中Elastin、LOX mRNA及其蛋白表达水平明显低于对照组(P,0.05),POP组患者子宫主韧带中Elastin与LOX mRNA及蛋白表达水平呈明显的正相关(P,0.05)。结论 POP患者子宫主韧带Elastin表达减弱影响弹性纤维形成,同时LOX表达减弱可通过影响胶原与弹性纤维的交联亦使盆腔支持结构稳定性降低,进而参与POP的发生。 【关键词】 盆底器官膨出;弹性蛋白;蛋白赖氨酸6 ZHANG Linlin, YU Hao, ZHANG Shiqian (Department of Gynecology, Qilu Hospital of Shandong University, Jinan 250012, China) To investigate the Elastin and 1ysyl oxidase(LOX) expressions in the cardinal ligament of premenopausal women with pelvic organ prolapse(POP)so as to determine the alteration that contributes to POP. Methods Cardinal ligament samples were obtained from 42 premenopausal POP subjects and 27 non POP control women that underwent a hysterectomy. Reverse transcription polymerase chain reaction(RTPCR)was used to verify the mRNA level of Elastin and LOX. The concentration of Elastin and LOX was determined by the Western blotting technique, electrophoretic separation and quantification. Results The POP group demonstrated a significant decrease of expressions of Elastin and LOX in the cardinal ligament than in the control group (P,0.05). There was an identical tendency in protein level of these two groups (P,0.05). Also, there was a positive correlation between the two groups(P,0.05). Conclusion The significant decrease in Elastin production in the cardinal ligaments may lead to a loss of functional tissue elasticity, a condition that may progress to the development of POP, and collagen and elastin metabolism in POP is altered by LOX. This alteration results in less flexible connective tissue, which is probably more likely to break. LOX might be involved in the pathogenesis of POP. Pelvic organ prolapse; Elastin; Protein Key words: lysine 6oxidase 盆腔器官膨出(pelvic organ prolapse, POP)又称盆腔脏 器脱垂,是一种常见的、严重影响妇女生活质量的疾病。随着人 口老龄化和对生活质量要求的提高,POP的发病率逐年增高。POP 发病机制的研究已有几十年,其确切的发病机制至今尚不清楚 ,1,。近年来,许多学者提出对盆腔器官起支持作用的结缔组织 的异常可能是POP发生的关键因素。有研究发现胶原蛋白的含 量、结构、功能、?型/?型胶原相应比例异常与POP的关系密 切,24,。另有研究表明POP患者盆内筋膜胶原代谢活跃,胶 原的分解增加可能是POP发生机制之一,5,。但对盆底结缔组织 的另一主要组成成分Elastin)在POP发生发展中 的作用研究不多。本研究旨在从mRNA及蛋白水平检测POP患者 子宫主韧带中Elastin、赖氨酰氧化酶(1ysyl oxidase, LOX) 的表达,其在POP发生中的作用,进一步阐明POP的发病机 制。 1 资料与方法 1.1 研究对象与分组 选择2005年9月,2007年3月山东大学齐鲁医院妇科收治的因子宫脱垂行全子宫切除术绝经前患者42例(POP组),同期选择住院的无POP和(或)压力性尿失禁(stress urinary incontinence,SUI),因妇科良性肿瘤行全子宫切除术的绝经前患者27例为对照组,所有入选者近3个月内均未服用雌激素类药物,术后病理结果证实无子宫内膜异位症、子宫肌瘤、功能性卵巢肿瘤等雌激素相关疾病,POP组与对照组在年龄、产次、体重指数等方面差异无统计学意义(P,0.05),具有可比性。参照POPQ评估分类系统诊断,POP组患者均为?、?期。 1.2 组织标本存放 POP组和对照组开腹或阴式手术中取子宫主韧带约500?mg,用生理盐水充分洗净血液后立即至于-80??冰箱或液氮中保存备用。 1.3 RTPCR 法检测Elastin、LOX mRNA的表达 Trizol(TaKaRa公司)法抽提两组组织标本总RNA,经MMLV逆转录系统合成cDNA。逆转录系统构成如下:RNA 1?μg, oligodT 1?μL, dNTP 4?μL, 5×buffer 4?μL, MMLV逆转录酶1?μL,加Rnase灭活蒸馏水补充至20?μL。逆转录条件:42?? 1?h,95?? 5?min。PCR反应系统构成如下:cDNA 3?μL,上、下游引物各1?μL, 2×Taq PCR Master Mix 10?μL,加双蒸水补充至20?μL。引物序列:Elastin上游引物:5′AAA GCAGCAGCAAAGTTCGG3′,下游引物:5′ACCTGGGACAACTGGAATCC3′;扩增产物276?bp;LOX 上游引物:5′ATGAGTTTAGCCACTATGACC3′,下游引物:5′AACACCAGGCACTGATTT A3′;扩增产物402?bp; βactin上游引物:5′AAACTGGAACGGTGA AGGTG3′,下游引物: 5′GTGGCTTTTAGGATGGCAAG3′;扩增产物160?bp。扩增条件:94??变性30?s,54??退火30?s,72??延伸30?s,共35个循环,最后72??延伸5?min。取10?μLPCR产物在1.5%琼脂糖凝胶电泳,溴乙啶(EB)染色后,紫外灯观察。捷达801专业凝胶图像采集与分析系统(3.3 版)采集分析图片。以不加MMLV逆转录酶为阴性对照,βactin为体系内控制。Elastin、LOX与βactin的RTPCR产物吸光度比值作为两种基因mRNA的相对含量。 1.4 免疫蛋白印迹法(Western blotting)检测Elastin、LOX蛋白的表达 取少量组织块放于1.5?mL EP管中,用干净的剪刀将组织块尽量剪碎。加入400?μL细胞裂解液(50?mmol,L TrisHC1 pH8.0、150?mmol/L NaCl、5?mmol,L EDTA、1, triton X100、1?mmol PMSF),于匀浆器中进行匀浆。然后置于冰上重复 碾磨几次使组织尽量碾碎。裂解30?min后,4??下12?000? r/min 离心5?min,取上清分装于0.5?mL EP管中。考马斯亮蓝测蛋白含量,取蛋白样品各50?μg上样,经SDSPAGE电泳进行蛋白转膜,加入5,脱脂奶粉封闭,加入羊抗人LOX(V20) 多克隆抗体(sc25736)、兔抗人Elastin(H300)多克隆抗体(sc 32409)(1?200,购自SANTA CRUZ生物技术有限公司),和二抗(1?1?000;购自北京中杉金桥生物技术有限公司)孵育,ECL显色, 暗室曝光显示条带。实验重复3次,UVP凝胶成像系统扫描成像,比较各条带的吸度值。 1.5 统计学处理 所有数据资料应用SPSS 13.0统计软件进行处理。 2 结 果 2.1 两组患者子宫主韧带中Elastin、LOX mRNA表达结果 POP患者子宫主韧带中Elastin mRNA表达水平为0.42±0.22,明显低于对照组0.79±0.30,平均降幅为46.8%,差异有统计学意义(t=5.52, P,0.05);与Elastin mRNA变化趋势相一致,LOX mRNA在两组患者子宫主韧带中均有表达,POP组子宫主韧带中表达量为0.37±0.18,亦明显低于对照组0.65±0.22,平均降幅为43.1%,差异有统计学意义(t=5.53, P,0.05),见图1。 2.2 两组患者子宫主韧带中Elastin、LOX蛋白表达结果 POP患者子宫主韧带中Elastin蛋白表达量为 0.44±0.32,较对照组0.89±0.27明显降低,平均降幅为50.6%,差异有统计学意义(t=6.28, P,0.05);POP组患者子宫主韧带中LOX蛋白表达量为0.45±0.27,较对照组0.85±0.39亦明显降低,平均降幅为47.1%,差异有统计学意义(t=4.65, P,0.05),见图2。 2.3 子宫主韧带中Elastin、LOX mRNA及蛋白表达的相关性分析 相关分析显示,子宫主韧带中Elastin mRNA 与LOX mRNA表达水平呈明显的直线正相关(r,0.995?9, P,0.05);两种基因蛋白表达亦呈明显的直线正相关(r,0.970?8, P,0.05)。 3 讨 论 女性POP发生与盆底起支持作用的结缔组织结构、功能完整性的破坏密切相关,盆底结缔组织的异常可能是POP发生的一个关键因素。胶原纤维和弹性纤维是盆底筋膜、韧带的主要成分,是连接固定盆腔脏器的主要组织结构。两种蛋白的代谢异常可能为引起女性盆底器官膨出疾病的机制之一。 Elastin是一种细胞外基质(ECM)蛋白,主要由成纤维细胞、大动脉平滑肌细胞和弹性软骨的软骨细胞等产生,在体内可与微原纤维结合形成弹性纤维,其主要功能是被动伸缩,赋予所在组织和器官以伸缩性和可逆的变形能力。因而,在经常受力而变形的器官,如肺、大动脉、韧带、耳廓软骨及皮肤中都有大量Elastin,对维持这些器官的功能起重要作用。冯翔等,6,研究 发现,弹力蛋白含量的减少在腹主动脉扩张过程中起主要作用,而胶原含量仅轻度下降。这与Yamamoto等,8,的研究结果相一致,说明POP患者Elastin的合成减少导致盆底结缔组织的弹性减弱,从而使其弹性机能减退,促进POP的发生。 LOX是铜依赖性单胺氧化酶,主要是由活性的平滑肌细胞和成纤维细胞产生,是胶原和弹性纤维交联的关键酶,在胶原和Elastin可溶性单体转变为不溶性纤维过程的初始阶段发挥重要作用。LOX通过催化作用提供胶原和弹性纤维强大的机械强度,促进胶原和弹性纤维发育成熟,保持组织内环境稳态,其活性下降会导致蛋白交联的程度下降,从而影响ECM的稳定性。Szauter等,9,发现皮肤真皮层内LOX的表达量随年龄增长和皮肤老化逐渐降低,催化活性亦降低;Maki等,10,报道LOX活性对小鼠呼吸系统的正常发育和功能形成、组织中胶原和弹性纤维发育是非常重要的。本研究结果表明,与Elastin表达变化趋势相同,POP组患者子宫主韧带中LOX mRNA及蛋白表达较对照组明显减弱(P,0.05),这与Kobak等,11,的研究结果相一致,另外,本研究首次分析了Elastin与LOX两种基因的关系,两种基因在mRNA和蛋白和水平上有相同的变化趋势,且呈明显的直线正相关(r,0.995?9,r,0.970?8,P,0.05),说明LOX mRNA水平及蛋白表达减弱使得其对胶原和弹性分子间交联的水平下降,无法形成稳定的胶原与弹性纤维,使其机械强度改变,易于断裂分解,或是胶原或弹性纤维对蛋白酶水解作用的敏感性增高,导致 盆底组织支持(下转第213页)(上接第209页) 作用减弱,引起 POP及SUI的发生。此外,LOX辅助因子铜的缺乏,也可能是导 致弹性纤维的形成发生障碍的原因,从而出现松皮病、先天性肺 气肿、POP等疾病。 综上所述,POP患者子宫主韧带中存在Elastin、LOX表达减弱, 且两者的变化存在明显的相关性,两者的共同作用可能使盆底结 缔组织中的胶原与弹性纤维交联异常,导致其功能异常,从而导 致POP的发生。 因此,通过上调LOX内源性表达、应用外源性替代LOX从而加 强胶原与弹性纤维交联,增强盆底支持结构的稳定性,可能成为 预防和治疗POP的有效方法。另外,老年人适当补铜有可能会预 防或减少本病的发生。 【参考文献】 ,1,刘春燕,郎景和,朱兰. 女性盆腔器官脱垂病因学研 究进展,J,. 中华全科医师杂志,2007,6(3):157159.

,2,Jackso S, James M, Abrams P. The effect of oestradiol on vaginal collage metabolism in postrnenopausal women with genuine stress incontinence,J,. BJOG, 2002, 109(3):339344.

,3,Fitzgerald M P, Mollenhauer J, Hale D S, et al. Urethral collagen morphologic characteristics among women with genuine stress incontinence,J,. Am J Obstet Gynecol, 2000, 182(6):1565 1574.

,4,Chen B, Wen Y, Warrington J A, et al. Menstrual phasedependent gene expression differences in preiurethral vaginal tissue from women with stress incontinence,J,. Am J Obstet Gynecol, 2003, 189(1):89 97(

,5,Chen B, WenY, Wang H, et al. Differences in estrogen modulation of tissue inhibitor of matrix metalloproteinse1 and matrix metalloproteimse1 expression in cultured fibroblasts from continant and incontinent women,J,. Am J Obstet Gynecol, 2003, 189(1):59 65.

,6,冯翔,景在平,赵癇,等. 弹力蛋白在腹主 动脉瘤发病中的作用,J,. 解放军医学杂志,2001,26(9):693 695.

,7,Yamamoto M, Aoyagi M, Tajima S, et al. Increase in elastin gene expression and protein synthesis in arterial smooth muscle cells derived from patients with moyamoya disease,J,. Stroke, 1997, 28(9):17331738.

,8,Yamamoto K, Yamamoto M, Akazawa K, et al. Decrease in elastin gene expression and protein synthesis in fibroblasts derived from cardinal ligaments of patients with prolapsus uteri,J,. Cell Biol Inter, 1997, 21(9):605 611.

,9,Szauter K M, Cao T, Boyd C D, et al. Lysyl oxidasein developmetat, aging and pathologies of the skin,J,. Pathol Biol, 2005, 53(7):448456.

,10, Maki J M, Sormunen R, Lippo S, et al. Lysyl oxidase is essential for normal development and function of the respiratory system and for the integrity of elastic and collagen fibers in various tissues,J,. Am J Pathol, 2005, l67(4):927936.

,11,Kobak W, Lu J, Hardart A, et al( Expression of lysyl oxidase and transforming growth factor beta2 in women with severe pelvic organ prolapse,J,. J Reprod Med, 2005, 50(11):827831. 申明:本

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