实验8 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的分子量

实验8 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的相对分子量Mr原理蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶电泳中，蛋白质的迁移率取决于它所带净电荷及分子的大小和形状。在聚丙烯酰胺凝胶系统中加入阴离子去污剂十二烷基磺酸钠（sodiumdodecylsulfate,简称SDS）和还原剂（如巯基乙醇）处理蛋白质样品，则蛋白质分子中的二硫键被还原，1g蛋白质可定量结合1.4gSDS。由于SDS呈解离状态，使蛋白质亚基带上大量的负电荷，其数值大大超过蛋白质分子原有的电荷量，因而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别。各种蛋白质-SDS复合物现出相等的电荷密度，在聚丙烯酰胺凝胶上电泳时，它们纯粹按照分子的大小由凝胶的分子筛效应来进行分离，有效迁移率与相对分子量的对数成很好的线性关系。用这种方法测定蛋白质的Mr，简便、快速，只需要廉价的设备和μg量的蛋白质样品。所得的结果，在Mr为15000~200000的范围内，与用其他方法测得的Mr相比，误差一般在±10%以内。因此SDS测定Mr的方法，已得到非常广泛的应用和迅速的发展。现在经SDS-聚丙烯酰胺凝胶研究过的蛋白质已经有很多种了。实验证明，在蛋白质溶液中加入SDS和巯基乙醇后，巯基乙醇可使蛋白质分子中的二硫键；SDS能使蛋白质的氢键、疏水键打开，并结合到蛋白质分子上形成蛋白质-SDS复合物。在一定的条件下，SDS与大多数蛋白质的结合比为1.4gSDS/1g蛋白质。由于十二烷基硫酸根带负电，使各种蛋白质的SDS复合物都带上相同密度的负电荷，它的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，因而掩盖了不同种类的蛋白质间原有的电荷差别。在用SDS-凝胶电泳法测定蛋白质的Mr时，应注意以下几个问：1.如果蛋白质-SDS复合物不能达到1.4gSDS/1g蛋白质的比率并具有相同的构象，就不能得到准确的结果。影响蛋白质和SDS结合的因素主要有以下3个：⑴二硫键是否完全被还原：只有在蛋白质分子内的二硫键被彻底还原的情况下，SDS才能定量地结合到蛋白质分子上去，并使之具有相同的构象。一般以巯基乙醇作为还原剂。在有些情况下，还需要进一步将形成的巯基烷基化，以免在电泳过程中重新氧化而形成蛋白质聚合体。⑵溶液中的SDS浓度：溶液中SDS的总量，至少要比蛋白质的量高3倍，一般需达10倍以上。⑶溶液的离子强度：溶液的离子强度应很低，最高不能超过0.26，因为SDS在溶液中是以单体和分子团的混合体而存在的，SDS结合到蛋白质分子上的量，仅决定于平衡时SDS单体的浓度而不是总浓度，在低离子强度的溶液中，SDS具有较高的平衡浓度。2.不同的凝胶浓度适用于不同的Mr范围，Weber的实验指出，在5%的凝胶中，Mr25000~200000的蛋白质，其Mr的对数与迁移率呈直线关系；在10%的凝胶中，10000~70000Mr蛋白质呈直线关系；在15%的凝胶中，10000~50000Mr的蛋白质呈直线关系；3.33%（以上各种浓度的凝胶，其交联度都是2.6%）的凝胶可用于Mr更高的蛋白质。可根据所测Mr范围选择最合适凝胶浓度，并尽量Mr范围和性质与待测样品相近的蛋白质做蛋白质。标准蛋白质的相对迁移率（蛋白质的电泳迁移距离除以染料迁移距离即为相对迁移率）最好在0.2~0.8之间均匀分布。在凝胶电泳中，影响迁移率的因素较多，而在制胶和电泳过程中，很难每次都将各项条件控制的完全一致，因此，用SDS-凝胶电泳法测定Mr，每次测定样品必须同时做标准曲线，而不得利用另一次电泳的标准曲线。3.有许多蛋白质，由亚基（如血红蛋白）或两条以上肽链（如α-胰凝乳蛋白酶）组成的，它们在SDS与巯基乙醇的作用下，解离成亚基或单条肽链。因此，对于这一类蛋白质，SDS-凝胶电泳测定的只是它们的亚基或单条肽链的Mr而不是完整分子的Mr。为了得到更全面的资料，还必须用其他方法测定其Mr及分子中肽链的数目等，与SDS-凝胶电泳的结果相对照。4.不是所有的蛋白质都能用SDS-凝胶电泳法测定其Mr，已发现有些蛋白质用这种方法测出的Mr是不可靠的.这些蛋白质有：电荷异常或构象异常的蛋白质,带有较大辅基的蛋白质(如某些糖蛋白)以及一些结构蛋白，如胶原蛋白等。例如组蛋白F1，它本身带有大量的正电荷，尽管结合了正常比例的SDS，仍不能完全掩盖其原有正电荷的影响，她Mr是21000，但SDS-凝胶电泳测得的结果却是35000。因此在SDS-凝胶电泳所测得的结果时，应该小心。一般至少用两种方法来测定未知样品的Mr，互相验证。为了判断待测样品是否可用SDS-凝胶电泳法来测定Mr，也可使蛋白质-SDS复合物在不同浓度（交联度相同）的SDS凝胶中电泳，得到Ferguson图。如果待测样品的自由迁移率m0与标准蛋白质的m0基本交于一点，而且在不同浓度的SDS-凝胶中测得的Mr都相同，则表明此蛋白质在SDS-凝胶电泳中的行为是正常的，可以用SDS-凝胶电泳法测定其Mr。现在常用做SDS-凝胶电泳的缓冲系统有好几种，有连续系统的也有不连续系统的。操作方法一贮液及凝胶溶液的配置方法，参照聚丙烯酰胺凝胶电泳中的贮液配制方法，只是在分离胶和浓缩胶液中加入SDS，使SDS的浓度达到0.4%，电极缓冲液中SDS浓度达到1mg./ml,样品缓冲液中的SDS浓度为2g/100ml.SDS-凝胶电泳可采用垂直柱型，也可采用垂直板型。由于垂直板型电泳操作方便，样品泳动的起点一致，便于对样品的分离情况做比较，目前大多采用此型。二样品的制备一般是将样品溶解在含1%SDS、1%巯基乙醇的0.01mol/L,pH7.2的磷酸缓冲液中，在100℃加热2~5分钟。蛋白质的最后浓度一般为0.05~1mg/ml。也可以将上述溶液在37℃保温2小时而不是100℃加热。一般说来，两种处理的结果都一样。但如果蛋白质样品中混有少量蛋白水解酶，37℃保温处理就会引起样品的水解，使测定失败，而100℃加热3分钟一般都能使蛋白酶失活，得到满意的结果。也有少数例外的情况，需采用特殊的样品处理方法。1.标准蛋白样品的制备称取细胞色素c、胰凝乳蛋白酶原A、胃蛋白酶、卵清蛋白、牛血清清蛋白各0.2mg左右，分别放入小试管中，按0.5mg/ml溶液的比例，向样品中加入“样品溶解液”（见试剂的配制），使充分溶解，轻轻盖上软木塞（不要盖紧，以免加热时迸出），将小试管放入沸水浴中加热3分钟，取出冷至室温。2.待测蛋白质样品的制备固体样品的制备与标准蛋白质相同。如待测样品已在溶液中，可先配制“浓样品溶解液”（各种溶质的浓度均比“样品溶解液”高1倍，将待测液与“浓样品溶解液”等体积混匀，然后同上加热。若待测溶液太稀可事先浓缩：若溶液的含盐量太高，则需先行透析。处理好的样品即可用于电泳。每个凝胶样品孔内加5μg蛋白质（或更少）便可得到清晰的区带。处理好的样品溶液可在冰箱中保存较长的时间，使用前在100℃水浴中加热1分钟，以除去可能出现的亚稳态聚合物。三电泳将聚合好的凝胶连同制胶模具装置在电泳槽上，拔掉样品槽模板（梳子），用电泳缓冲液清洗样品孔，然后将上下电极槽注满缓冲液，检查上槽无泄露，即可加样。用微量注射器按号向凝胶样品孔中加样，没孔加20μl（含蛋白质1~5μg），稀的样品可适量增加其体积。加样完毕后，打开直流稳压电源（负极接上槽，正极接下槽，事先接好），将电流调至50~80mA（根据凝胶板的横截面积适当调节增减），保持电流强度不变，待染料（染料已事先加在“样品溶解液“中）迁至距凝胶下端约1cm处，停止电泳。四染色、脱色将凝胶取出，滑入一白瓷盘或大培养皿中，在染料区的中心插入细铜丝做为标志，加入染色液，染色1小时左右。倾出染色液，用蒸馏水洗凝胶数次后加入脱色液，数小时换液一次，直至背景清晰。五Mr的计算通常以相对迁移率mR来表示迁移率，相对迁移率的计算方法如下：用直尺分别量出样品区带中心及铜丝与凝胶顶端的距离见图3，按下式计算：相对迁移率mR=样品迁移距离(cm)/染料迁移距离（cm）以标准蛋白质Mr的对数对相对迁移率做图，得到标准曲线如图4所示，根据待测样品的相对迁移率，从标准曲线上查出其Mr。图3、4试剂和器材试剂1.标准蛋白质（纯品） 标准蛋白质 来源 Mr 细胞色素c 马心 12500 胰凝乳蛋白酶原 牛胰 25000 胃蛋白酶 猪胃 35000 卵清蛋白 鸡卵 43000 牛血清清蛋白 牛血清 67000      2.0.2mol/l,pH7.2磷酸盐缓冲液：取280ml0.2mol/L磷酸二氢钠溶液，加入720ml0.2mol/L磷酸氢二钠溶液，混匀后调pH至7.2。此溶液用来进一步配置凝胶缓冲液、电极缓冲液和样品溶解液。3.样品溶解液：0.01mol/L,pH7.2磷酸盐缓冲液，内含1%SDS，1%巯基乙醇，10%甘油，0.02%溴酚蓝。用来溶解标准蛋白质及待测蛋白质样品。配制方法如下：SDS           100mg巯基乙醇         0.1ml甘油           1ml溴酚蓝          2mg试剂2          0.5ml加蒸馏水至总体积     10ml4.电极缓冲液：0.1%SDS，0.1mol/L,pH7.2磷酸盐缓冲液（或Tris-HCl缓冲液）：取1gSDS，加入500ml试剂2，用蒸馏水定容到1000ml.5.染色液：0.25g考马斯亮蓝R250，加入454ml50%甲醇和46ml冰乙酸。6.脱色液：75ml冰乙酸，875ml蒸馏水与50ml甲醇混合。7.SDS：市售化学纯SDS需要结晶后使用。重结晶的方法如下：称取20gSDS，放入50ml圆底烧瓶中，加约半牛角匙活性炭及300ml无水乙醇，搅拌，摇匀。烧瓶上接一个小冷凝管。在水浴上加热到乙醇微沸，回流约10分钟，用热过滤漏斗趁热过滤。滤液应是无色透明。滤液冷至室温后，移至－20℃冰箱中过夜。次日，通过预冷的布氏漏斗抽滤，用少量－20℃无水乙醇洗沉淀3次，尽量抽干，将结晶置真空干燥器中干燥或40℃以下烘箱烘干。简明操作方法1.将成套的两块玻璃板正确防如硅胶条中，然后夹在电泳槽中，按对角线顺序旋紧螺丝，注意用力均衡以免夹碎玻璃。安装好电泳槽后，用1.5%琼脂封底，待琼脂凝固后即可制胶。2.将已经配制好的分离胶液轻轻混匀后，灌入玻板胶腔中至适当高度，表面加一薄层蒸馏水或双蒸水封闭胶液表面。开始加入水后，会在凝胶液和水之间形成分界线，在聚合过程中，分界线会逐渐消逝，待分界面再次出现时，说明分离胶已经聚合完全。3.待分离胶聚合后，倒掉表面的水，再将配制好的浓缩胶轻轻混匀后灌满玻璃板胶腔，迅速插入样品梳，静置聚合。