低分子肝素对滋养层细胞在抗子宫内膜抗体环境中增殖与凋亡能力调节作用的探讨

低分子肝素对滋养层细胞在抗子宫内膜抗体环境中增殖与凋亡能力调节作用的探讨 低分子肝素对滋养层细胞在抗子宫内膜抗体环境中增 殖与凋亡能力调节作用的探讨 分类号:. 单位代码: 学 密级: 号: ‖紊只孥 硕士学位论文 ’ 论文题目:低分子肝素对滋养层细胞在抗子宫内膜抗 体环境中增殖与凋亡能力调节作用的探讨作 者: 马丽娜 专 业: 妇产科学 导 师: 徐永萍 教授 年月 原创性声明 本人郑重声明:所呈交的学位论文,是本人在导师的指导 下,独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容 外,本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科 研成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体,均已在文 中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。 日 期:丛』 论文作者签名:詈啤 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论 同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文 电子版,允许论文被查阅和借阅;本人授权山东大 学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学 保密论文在解密后应遵守此规定 期 论文作者签名:碑导师签名:目 录 中文摘要? 英文摘要? 符号说明? 论文正文:低分子肝素对滋养层细胞在抗子宫内膜抗体环境中增殖与凋亡能 力 调节作用的探讨 前 言? 和..:??. 一实验材料??. 研究对象? 血清收集.. 主要试剂和仪器二实验方法??. 滋养细胞单细胞悬液的制备?.. 滋养细胞行纯化培养密度梯度离心法?. 滋养细胞行纯度鉴定免疫细胞化学法? 实验分组?. 四氮唑盐细胞增殖实验细胞增殖情况流式细胞术检测细胞凋亡??. 免疫荧光化学检测细胞增殖细胞核抗原??. 三实验结果滋养细胞的培养与鉴定 细胞增殖实验检测滋养细胞增殖状态? 免疫荧光检测滋养细胞中的表达.?. 流式细胞术检测细胞凋亡??. 讨 论? 一绒毛滋养层细胞体外研究模型的构建滋养细胞的分离培养.. 滋养细胞的纯化与鉴定 二与自然流产有关的免疫学抗体??. 三滋养细胞生物学特点与妊娠 ?滋养细胞的功能特点. 滋养细胞的增殖与妊娠??.. 滋养细胞的凋亡与妊娠??.. 四洲治疗自身免疫因素所致流产的研究??.. 抗凝作用? 免疫调节和免疫抑制作用对滋养细胞发育能力及侵袭力的影响. 结 论? 临床意义与展望附图表? 参考文献? 致 谢?山东大学学位论文 低分子肝素对滋养层细胞在抗子宫内膜抗体环境中增殖与凋亡 能力调节作用的探讨 专 业:妇产科学 研究生:马丽娜 导 师:徐永萍教授 中文摘要 目的 探讨体外培养的人早孕绒毛滋养层细胞,在含有抗子宫内膜抗体 血清环境中,低分子肝素对其细胞增殖能力和凋亡情况的调节作用。 方法 抽取在我院门诊就诊的阳性而其它与自然流产相关的免疫性抗体均 阴性的病人肘静脉血,各相关免疫性抗体均阴性的正常育龄妇女肘静脉血 ,离心后取上清,.?保存备用。无菌条件下获取正常妊娠一.周绒毛组 织,经胰蛋白酶/酶联合消化后,密度梯度离心法行纯化培养, 将最终获得的滋养层细胞应用免疫细胞化学法对其进行纯度鉴定,并同时传 代 培养。将传.代的滋养层细胞随机分为组:组研究组:加入 血清不加,组研究组:加入血清及, 组对照组:加入.血清不加,组对照组:加 入.血清及。按上述分组培养小时后,采用法检测 值;细胞免疫荧光法检测增殖细胞核抗原;流式细胞术检 测细胞凋亡率。 结果 .法检测 值 组值为.?.,组为.?.,两者比较差异有 统计学意义户.;组为.?.,与组比较差异有统计学 意义尸.;组为.?.,与组比较差异无统计学意义山东大学学位论文 .。 .细胞免疫荧光法检测平均荧光灰度值% 组、组平均荧光灰度值分别为.?.%和.?.%, 两者比较差异有统计学意义.;组为.?.%,与组 比较差异有统计学意义尸.;组为.?.%,与组比较 差异无统计学意义.。 .流式细胞术检测细胞凋亡率% 组、组细胞凋亡率分别为.?.%和.?.%,两者 比较差异有统计学意义.;组为.?.%,与组比较差 异有统计学意义尸.;组为.?.%,与组比较差异无统 计学意义尸.。 结论 本实验证明,可通过抑制绒毛滋养层细胞的增殖、促进细胞的凋亡, 影响此细胞的发育能力,进而对滋养层细胞的生物学行为产生影响,而 能调节对滋养层细胞的这种影响,推测这是阳性流产患者发生流 产的原因之一;也是提高此类患者妊娠成功率的机理之一。 关键词流产;低分子肝素;抗体,抗子宫内膜;增殖细胞核抗原;细胞凋亡 山东大学学位论文?? . ? ? .? , ,.. . . , ,. . , .,, , .士., .士.,.士.,.士.,. 山东大学学位论文 .; .; .. . % .士. %, . .:.%,.士.%,.士.% ,,.; .; .. . ,, , .. %,.::.%,..%,.士.%. .; .; .. , .. 【 ;;; ; 山东大学学位论文 符号说明 缩略语 英文名称 中文名称抗子宫内膜抗体复发性自然流产 ? 低分子量肝素 合体滋养层细胞 绒毛细胞滋养层细胞 绒毛外细胞滋养层细胞 抗心磷脂抗体糖蛋白.抗体一 四甲基偶氮唑盐比色法 吸光度流式细胞术 牛血清白蛋白磷酸盐缓冲液 ? 增殖细胞核抗原 山东大学学位论文 前言 自然流产是指妊娠在不足周、胎儿体重不足而自行终止者,是妊 娠常见并发症,其发生率约占妊娠总数的%.%,且多数为早期流产。发病 原因除了有遗传、解剖、内分泌、感染及全身性疾病等因素外,还有一部分原 因不明。在原因不明的流产中,%.%与免疫因素有关,约/与自身免疫 性抗体相关?。 作为一种自身免疫性抗体,有器官特异性。文献报道:能增加 自然流产率】,自然流产组阳性率明显高于正常对照组【。关于 导致流产的主要病理机制:一是与子宫内膜中的靶抗原结合,发生抗原抗体反应, 破坏子宫内膜结构,使子宫内膜发育不良,从而降低了对受精卵的接受性,进而 二是和子宫内膜细胞中的抗原结合,激活补 影响到胚胎着床造成自然流产; 体系统,使局部发生免疫病理变化,进而直接影响子宫内膜腺体功能,导致营 养胚胎的糖原等分泌不足,致使胚胎发育不良,最终干扰和妨碍了孕卵着床和 胚胎发育,导致自然流产。 胎盘免疫学和胎盘病理学研究表明:正常妊娠的建立和维持的机制之一是: 胎盘的免疫保护功能。而这种机制的形成是以胎盘滋养细胞的正常发育为基础。 因此,在胚胎形成与发育过程中,滋养细胞的增殖能力下降、细胞凋亡数目增 多都会影响到胎盘的生长发育和功能,从而导致病理妊娠。诸多研究证实,反 复自然流产作为一种病理妊娠,往往伴有滋养层细胞增殖能力的下刚】和细 胞 凋亡数目增多。 增殖细胞核抗原本质是聚合酶的蛋白辅助因子,只出现在 增殖状态细胞核中,无种属及组织特异性,其表达合成与细胞增殖周期相关,由 期开始,于期达到峰值,至期及期则明显减少。因此,阳 性细胞的多少可以反映出细胞的增殖状态【。等【报道,在正常早孕的 绒毛滋养层细胞中检测到大量的,其表达水平可反映滋养层细胞的增殖 能力,已被认为是一个可靠地能反映滋养细胞群体增殖活性的指标。 近年来在复发性流产的治疗中使用广泛,过去一直认为 的抗凝作用是治疗关键。但对临床此类患者流产绒毛及蜕膜的组织学研究发现, 几乎无法找到明显的血栓,说明的治疗效果可能与高凝状态无关,后 续研究发现,可以调节滋养细胞的生长、分裂、抗原抗体的结合、抑 山东大学学位论文 制滋养细胞的凋亡及诱导滋养细胞的侵袭、增殖等过程【。在多种产 科并发症和合并症中可以改善胎盘功能,逆转不良妊娠结局,它在产科的成功 应用,使得我们将研究重点逐步转向其可能发挥作用的机制,以期更好的指导 在临床的应用。由于其分子生物学基础仍不十分明确,因此需更多的体内外研 究来评估在调节滋养层细胞增殖能力及凋亡情况方面的效能。 胎盘滋养层细胞的正常发育是正常妊娠建立和维持的机制之一。与 自然流产的发生有密切的联系。自然流产作为一种病理妊娠,往往伴有滋养 层 细胞增殖能力的下降和细胞凋亡数目增多。治疗流产的机制不仅是通过 其抗凝作用,还直接或间接促进滋养细胞增殖和胎盘的形成。因此本研究采 用 了滋养层细胞的原代培养,作为研究滋养层细胞功能的模型,观察滋养层细 胞 在含有血清环境下细胞增殖能力及凋亡情况的改变,以期发现 对早期胎盘形成的可能影响及的调节作用,对治疗早孕 期妊娠并发症可能作用机理的研究具有重要意义。 山东大学学位论文 材料与方法 一、实验材料 研究对象 本实验经过山东大学第二医院道德伦理委员会批准后,随机选择年 .月份在我院门诊自愿要求人工流产的健康妇女例,年龄~岁,月 经规律;无任何内外科合并症及并发症;超证实为宫内妊娠,发育正常;征 得孕妇同意,无菌条件下获取正常早孕绒毛组织,孕周为一周。 血清收集: 选择年.月份在我院门诊就诊的而其它与流产有关的 免疫性抗体阴性的患者,空腹抽取肘静脉血,静置于无菌试管后, /,离心,取上清,作为血清,.保存备用。同法抽 取与流产有关的免疫性抗体均阴性的正常育龄妇女静脉血,经上述同样处 理后,作为.血清备用。 主要试剂和仪器 .实验仪器 一?超低温冰箱:日本公司;.。冰箱:青岛海尔公司。 数显电热恒温水浴箱:宁波市机电工业研究设计院。 .可调培养箱:日本公司产品。 一培养箱:日本 公司产品。 .倒置显微镜:日本奥林巴斯公司产品。 荧光显微镜:日本奥林巴斯公司产品。 光学显微镜:日本奥林巴斯公司。 超净工作台:苏州净化设备公司产品。 公 高速低温离心机及配套转子:美国 司产品。 .高速台式离心机:上海安亭科学仪器厂产品。 型自动双重纯水蒸馏器:上海玻璃仪器一厂产品。 .型酶标仪:美国 公司产品。 微量振荡器.:北京海淀电子医疗仪器厂生产。 山东大学学位论文 , 微量移液器, , :法国公司产 品。 一次性塑料培养瓶 、底面积 培养皿及六孔培养板: 公司。 吸管,离心管,眼科解剖剪、镊子,目、目不锈钢筛网、玻 璃培养皿、培养板等操作器械。 .主要试剂 /:培养基:美国公司。 胎牛血清 ,:杭州四季青公司。 胰蛋白酶:美国公司。 酶:晶美生物工程有限公司。 细胞分离液:瑞典公司生产,购自北京明日百傲生 物科技发展研究所。 青霉素和链霉素:山东鲁抗医药股份有限公司。 低分子量肝素钠注射剂齐征:齐鲁制药有限公司。 丙酮:天津市科盟化工工贸有限公司。 %多聚甲醛:天津市科盟化工工贸有限公司。 .%枸橼酸钠:天津市科盟化工工贸有限公司。 . ,:天津市广成化 磷酸盐缓冲液 学试剂有限公司。 ×.’液:天津市广成化学试剂有限公司。 中性树胶 :武汉博士德生物工程有限公司。 水溶性封片剂甘油磷酸缓冲液:武汉博士德生物工程有限公司。 小鼠抗人细胞角蛋刍和波形蛋白单克隆抗体工作液:北京 中杉金桥生物技术有限公司。 免疫组化染色试剂盒:北京中杉金桥生物技术公司。 显色试剂盒,二氨基联笨铵盐酸盐:北京 中杉金桥生物技术有限公司。 公司。 四甲基偶氮唑盐: 鼠抗增殖细胞核抗原单克隆抗体:北京中杉金桥生物技术有限公司。 标记山羊抗小鼠二抗:北京中杉金桥生物技术有限公司。 山东大学学位论文 :联星生物工程有限公司。 .%.:法国 公司。 ?凋亡检测试剂盒:公司。 .试剂配制 . 磷酸盐缓冲液 ,:. . . 溶于 蒸馏水,调整值为..。 ×.’液: . . . . . 溶于 蒸馏水,调整值为.~.。 .%胰酶: .胰酶蒸馏水,过滤除菌备用。 全培养基: %/:培养基%胎牛血清/青霉素/ 链霉素胎牛血清在使用前需?水浴灭活 %悬液样品一: . 贮存液. .%. ,共计 ,置于 离心管中,将份×与份贮存液混合。 %液: 取 样品一.% ,置于 共计 离心管中。 样品一.% 共计 ,置于 %液:取 离心管中。 :免疫组化染色试剂盒: ; ?%封闭液: ?二抗: ,山羊抗兔; 山东大学学位论文 ?: ,链酶亲和素一生物素.过氧化物酶复合物。 显色试剂盒,二氨基联笨铵盐酸盐: ; 试剂:浓缩缓冲液×, ; 试剂:浓缩溶液×, ; 试剂:浓缩过氧化氢溶液×, 一滴约试剂 双蒸水中,混合均匀,一滴约 试剂和一滴约 试剂加入其中,再次混匀。 .中性福尔马林: %甲醛. 蒸馏水 %多聚甲醛: 多聚甲醛.磷酸缓冲液。 二、实验方法 滋养细胞单细胞悬液的制备 在超净工作台内将新鲜绒毛组织孕周为.周用生理盐水含青 霉素 /,链霉素 /反复漂洗~次,尽量除去血块及蜕膜组 织,用眼科剪将绒毛组织剪成约的小碎块。 向盛有新鲜绒毛组织碎块的培养皿中,加入.%的胰蛋白酶和 /的酶各 具体量就绒毛组织体积给予加减调整/:, ?水浴箱中振荡消化、一,如果剩余组织较多可同法再消化一次, 用等体积的含%胎牛血清的/培养基终止消化。 终止消化后,将得到的消化液分别经目、目不锈钢筛网过滤, 滤液经 /离心后,弃上清,用含%胎牛血清的/培 养液重悬细胞,制成单细胞悬液。 滋养细胞行纯化培养密度梯度离心法 .实验原理 滋养层细胞的密度约为../,%悬液密度为 . /,选择密度为./的%浓度和密度为./的%浓度山东大学学位论文 的细胞分离液分离和纯化滋养细胞,在两个浓度梯度之间形成了明显的 细胞带。 .不连续密度梯度层的制备 将试管壁用胎牛血清湿润,倒掉多余血清,这种预处理可使逐层叠加的 液平稳沿管壁流下,形成满意的界面。在制备过程中一般用长针头注射 器从高密度向低密度逐层放置,有时相邻两层比重相差不大时,可将 液放入注射器中,小针头斜面紧贴管壁,任其自然慢慢流下。 .滋养细胞行纯化培养的具体步骤 装样:将 单细胞悬液缓慢置于液上层; 离心、取样:离心 /,后收集两个浓度液面交界处 的灰白色云雾状细胞层,抗生素盐水和培养液洗涤三次; 将收集液 /,离心后,弃上清,用含%胎牛血清的 /培养基重悬,调整细胞数为~×个/,接种于内置有载玻 片的孑培养板内,置?、%培养箱内进行培养。 滋养细胞行纯度鉴定免疫细胞化学法 .细胞爬片的制备 将处理好的无菌盖玻片放入无菌孔板中; 按细胞传代的方法,将对数生长期的滋养细胞经.%胰酶消化后制 成细胞悬液细胞数为~×个/; 将细胞悬液加入到盖玻片上,使细胞均匀分布; 待细胞贴壁培养基本均匀长满盖玻片时约需.天,用%多聚 甲醛固定,备用。 .滋养细胞行纯度鉴定的具体步骤 取出上述细胞爬片,严格按照试剂盒规定步骤操作,通过免疫细胞化学法 对滋养细胞进行小鼠抗人细胞一、染色,并计算细胞阳性率计算公式: 细胞阳性率染色阳性细胞数/细胞总数×%。具体步骤: 细胞爬片室温干燥; 用。冷丙酮固定; 缓冲液洗次×; 加入%的: 缓冲液洗次×; 山东大学学位论文 加入特异性一抗温盒内放置; 甩去多余液体, 缓冲液洗次× 加入复合物; 缓冲液洗次 显色镜下见阳性细胞显色; 苏木素染核后流水冲洗; %盐酸酒精分化数秒后,流水冲洗; %氨水返蓝后,流水冲洗; 常规脱水,二甲苯透明,中性树胶封片; 结果判定:.、染色阳性为细胞浆呈清晰棕褐色颗粒; 荧光显微镜下用自动图像分析仪随机计数个视野中每个细胞 中的阳性细胞数,即为。阳性细胞的百分比。 实验分组 调整细胞滋养层细胞数为 个?.,接种于六孔板内,置 于。、%孵箱内进行培养,稳定后,将滋养细胞随机分为如下 组进行培养小时后备用: 组:血清组:/清. . 组:一血清.组:血清. “ 四氮唑盐,细胞增殖实验检测细胞增殖情 况 待细胞生长至对数期,.%胰酶消化后计数,以以×细胞接 种于孔板内; 分为四组进行培养分组见,每组设三个复孔; ; 培养后加肛,孵育 ,振荡; 弃净上清,然后加 酶标仪检测各孔处的吸光度值; 上述实验重复次。 流式细胞术检测细胞凋亡 按实验分组进行处理培养,后常规 滋养细胞接种于六孔板中,山东大学学位论文 胰酶消化后,收集各组细胞悬液; 冷洗次,弃上清,加入 %预冷多聚甲醛中,轻轻吹打至细 胞均匀,?固定; 洗涤去多聚甲醛,,,洗两次; .结合缓冲液重悬细胞; ,震荡; 取细胞悬液,加入 加入? ,震荡混匀,室温避光孵育 ; 加 重悬后用流式细胞仪检测细胞凋亡率; 上述实验重复次。免疫荧光化学检测细胞增殖细胞核抗原 , 取出上述细胞爬片,冲洗次: %多聚甲醛固定分钟,冲洗次; .%嘶?.细胞打孔,后用冲洗次×; 滴加%室温放置 ,用以封闭非特异性抗原; 滴加:稀释的一抗,湿盒孵育过夜;振洗 次, 吹干; , :稀释的标记山羊抗小鼠二抗,?湿盒避光孵育 振洗次; %缓冲甘油封片,荧光显微镜观察照相; 图像处理软件分析各组细胞的荧光灰度值; 采用 上述实验重复次。 山东大学学位论文 统计学方法 实验结果用 .统计软件分析,各计量资料以均数土标准差吐, 表示,统计学方法采用检验,.为差异有统计学意义。 山东大学学位论文 实验结果 滋养细胞的培养与鉴定 光镜:倒置显微镜下见以单个核细胞为主,呈圆形或卵圆形,核较圆, 接种开始贴壁,后大部分贴壁,贴壁后的细胞呈上皮样,形态多样, 以类圆形或方形为主,细胞伸出较多伪足;胞浆丰富,胞浆内可见颗粒;胞核 大呈圆形,可见多核细胞。见图、图和图。 免疫荧光细胞化学染色显示:根据滋养细胞.表达阳性,阴 性,荧光显微镜下观察显示大多数贴壁生长的细胞.表达阳性,而阴性, 证实所分离的细胞大部分为滋养细胞。在荧光显微镜下计数个视野中每 个细胞中的.阳性细胞数,计算.阳性细胞的百分比一阳性细胞数 占细胞总数的%以上,即经细胞分离液获得的滋养细胞的纯度达% 以上,可以用于实验。见图。 法检测滋养细胞增殖状态 . 对滋养细胞细胞增殖能力的影响见图. 血清组组处的值为.?., .血清组组为.?.,两者比较,差异有统计学意义尸 .,见表。 . 对滋养细胞细胞增殖能力的影响见图. 血清加入组的值为.?., 不加组为.?.,两组比较差异有统计学意义尸., 见表,加入后能够明显提高细胞的增殖能力;.血清组加 组与不加组比较差异无统计学意义尸., 见表,值分别为.?.、.?.。 免疫荧光检测滋养细胞中的表达 . 对滋养细胞表达的影响见图. 免疫荧光化学显示阳性信号主要在细胞核内表达,表达越多,荧光 信号越强,血清组组细胞内表达与.血清 山东大学学位论文 组组比较明显减少,荧光信号较弱见图,平均荧光灰度值分别为. ?.和.?.,两组比较有差异有统计学意义尸.,见表。 . 对滋养细胞表达的影响见图. 血清加组与不加组比较细胞 表达明显增多,荧光信号增强,平均荧光灰度值分别为.?.和 .?.,两组比较有差异有统计学意义.,见表。.血 清加组与不加组比较差异无统计学意义尸 .,见表,平均荧光灰度值分别为.?.和.?.。 流式细胞术检测滋养细胞凋亡 . 对滋养细胞凋亡率的影响见图. 血清组组和.血清组组细胞凋亡率分 别为..%和.?.%,血清使滋养细胞凋亡率 表达明显多于对照组.,见表。 . 对滋养细胞凋亡率的影响见图. 加入后血清组组细胞凋亡率为.士.%, 与不加组前.?.%比较差异有统计学意义., 见表。.血清组加组与不加组比较 差异无统计学意义.,见表。 山东大学学位论文 讨论 一绒毛滋养层细胞体外研究模型的构建 胎盘是妊娠期间具有物质交换、代谢、分泌激素、合成和防御功能的重要 器官。胎盘屏障由滋养层细胞、绒毛毛细血管内皮细胞及基膜构成,是母体 和 胎儿之间进行营养物质和代谢产物交换的场所,同时也是阻止各种病原体由 母 体进入胎儿体内的天然屏障。滋养层细胞是构成胎盘屏障的主要成分,来源 于 滋养内胚层,在孕期不同阶段的胎盘中,存在不同类型、不同数量的滋养层细 , 胞。至胎盘形成时可分为两种类型:合体滋养层 ,,在胚胎发育过程中参与营 和细胞滋养层细胞 养、代谢、免疫等过程。细胞滋养层细胞具有分裂能力,可不断产生新细胞加 入合体滋养层。胚胎植入后,细胞滋养层可向绒毛和绒毛外两个方向分化。绒 ,位于绒毛的表层,覆 毛细胞滋养层细胞 盖在绒毛的外表面,参与营养物质和代谢产物的物质转运。绒毛外细胞滋养层 细胞 ,具有侵袭力,可向子宫间质和 螺旋动脉内呈侵袭性生长,参与子宫螺旋动脉生理性重铸,使螺旋动脉转化为 低阻力高流量血管,保证子宫.胎盘充足的血液供应【】。 滋养层细胞对研究胎盘绒毛在妊娠期间的作用及其机制有很重要的生物学 意义。但由于体内试验研究受到多种因素的影响和限制,妨碍了对其功能的研 究。建立滋养细胞体外培养模型,是研究胎盘血管形成【、物质交换‘及病 原 体宫内感染机制【 】的实验基础。原代培养的滋养细胞与体内的真实情况最为接 近,可以作为研究体内滋养层细胞功能的模型,能够客观地反映滋养层细胞在 不同培养条件下,细胞功能的变化。 滋养层细胞的分离培养 目前国内外报道的滋养层细胞原代培养方法主要有组织块培养法和消化分 离培养法。组织块培养法因原代细胞生长周期长,容易污染且容易混杂成纤维 不能在短时间内获得大量可供实验研究利用的细胞故常常不被采用。细胞, 消 化分离培养法目前公认的是,用胰酶消化法分离培养,但试剂的质量,尤其是 胰酶的质量不同,消化条件很难统一。控制酶浓度、作用时间及酶处理温度在 解离细胞中有很大关系,较常用的胰酶浓度为.%,?, 。本实验 / 根据相关文献【 ‘,并对其方法进行了改进,用.%胰酶 , 山东大学学位论文 ?低匀速消化 ,减少细胞损伤,力求在短期内获得大量高纯度的滋 养层细胞。 滋养层细胞的纯化与鉴定 滋养细胞体外研究模型的构建和应用的关键是建立获得足够纯度和数量的 滋养层细胞的实验【】。实验中取材来源为妊娠周的绒毛组织。在早期 胎盘绒毛组织中主要含有两种细胞成分,分别是滋养层细胞和间质细胞。绒毛 膜滋养层培养时需要排除间质细胞等其他细胞成分而仅保留所需细胞成分。本 实验采用了国内外许多学者常采用梯度离心法分离出纯的滋养层细胞。 滋养层细胞的密度约为.一./,根据的浓度/密度曲线, %浓度时溶液的密度为. /,%浓度时溶液的密度为. /。选 %和%浓度的细胞分离液分离纯化滋养层细胞。 择 原代细胞培养过程中易发生污染,而且在长期培养的情况下,细胞的一些 特性又会发生变化,所以,必须对培养的细胞进行鉴定,明确细胞的来源,便 于利用细胞进行下一步的实验研究。对于滋养细胞的鉴定指标,目前国内外报 道没有、统一的鉴定系统。主要方法有两种:一种是免疫化学法。二是流 式细胞术。滋养细胞的检测较认同的分子标志有细胞角蛋白、波形蛋白、人绒 毛膜促性腺激素和人胎盘催乳素等【 。角蛋白是构成上皮细胞的骨架蛋白,波 形蛋白是内皮细胞和间质细胞的标志蛋白【。是所获得的细胞中唯一的 上皮样细胞,所以细胞角蛋白染色应为阳性,而波形蛋白染色应为阴性。细胞 角蛋白. 一,一对的特异性最强?,而波形蛋白 染色阳性的细胞主要为成纤维细胞,是早孕绒毛培养中主要需要去除的细 胞。我们对细胞进行一和的免疫荧光染色,采用鼠抗人细胞角蛋白. 单克隆抗体,鼠抗波形蛋白单克隆抗体对进行纯度检测:鉴定结果表明经 密度梯度离心获得的纯度可高达%以上,符合实验要求。 通过胰酶/酶联合消化法获得单细胞悬液,经密度梯度离心 法获得较高纯度的滋养层细胞并进行培养,建立了的体外培养模型,有助 于进一步研究胎盘血液循环网络的构建及各种妊娠相关疾病的发病机制。 二与自然流产有关的免疫学抗体 自然流产是妊娠常见的并发症之一,多发生于早期。免疫学研究认为,妊娠 是一种同种移植现象,流产则是移植排斥的结果,在正常妊娠过程中,胚胎作 山东大学学位论文 为一种半同种异体组织抗原却能不受母体排斥而存活的条件为:?母体形成 了 封闭抗体,主要是指组织相容性抗原复合体、滋养层及丈夫淋巴细胞等,对 于致敏细胞对胚胎的攻击能起到预防作用;?母.胎间接触面相关影响原因; ?母体内出现各种免疫抑制因子产生的效果;?胎儿本身存在的生理因素。 以 上的几种条件,只要某一项发生异常,都将使得滋养层或胚胎遭到免疫攻击, 导致胚胎无法存活,并出现自然流产等不良妊娠结局。近年来随着生殖免疫 学 的发展,从免疫学的角度来认识自然流产引起高度关注。目前引起自然流产 的 抗体己发现多种,但主要有以下几种,抗心磷脂抗体、抗子宫内膜抗体 、抗精子抗体、和抗人绒毛膜促性腺激素抗体.】, 各种免疫性抗体通过不同机制造成滋养细胞发育障碍进而导致胚胎死亡及 妊娠 丢失【】。 是抗磷脂抗体中的一种,是以血小板和内皮细胞膜上带负电 荷的心磷脂作为靶抗原的自身抗体。被认为是造成栓塞的最常见的获得性 危险因素已及流产的可治病因。在下列情况下可以检测到,如自身免疫异 常例如抗磷脂抗体相关的重复流产、系统性红斑狼疮,感染性疾病例如梅 毒、艾滋病及淋巴细胞增殖异常如淋巴瘤、淋巴细胞性白血病等。研究表 明。与相关的产科并发症,包括流产、早产、子痫前期、胎儿生长受限、 妊高症和胎盘早剥等,其临床表现主要为反复习惯性自然流产和不孕不育。 早在 年,就被报道是自身抗体中最常见的一种,也是中最重要的一 种。一般认为,是针对磷脂和和 糖蛋白混合物或仅磷脂产生的多种 抗体。认为是由其靶抗原.磷/磷脂结合蛋白复合物引起的,复 合物中主要是磷脂、 一及凝血酶原,产生的抗磷脂抗体与临床的关系最 密切【】。 主要存在于线粒体膜上,阴离子的磷脂存在于膜的内面,具有两面空 间构象,本身并没有抗原性,然而与其辅助作用蛋白如 糖蛋白结合可成为 易识别和稳定的抗原【,在流产患者中的阳性检出率文献报道各不相同, 在%~%之间【。的测定结果可受某些感染性疾病和药物的干扰而产 生假阳性,直接测定 .可避免测定中的不足。文献报道 .在 流产者中的发生率为.%。 .是主要的抗原,它参于了凝血及 抗凝两条途径,其产生的抗体扰乱了这两条途径导致血栓的形成【】。另外在 合 体细胞分化时,滋养层表达的细胞膜带阴离子磷脂能与带阳离子的 .结 山东大学学位论文 合,这种结合蛋白易被所识别,一旦抗原抗体结合,体外试验证明,可以 抑制胎盘滋养细胞的生长,减少滋养层的增生,促进细胞凋亡,这是早期复发 性流产的机制】。 由于 糖蛋白是的主要抗原,广泛存在于人的血浆 中,它产生的抗体扰乱了凝血途经,导致血拴的形成,这种凝血系统的紊乱是 晚期复发性流产的机制。抗磷脂抗体可通过多种途径促进血栓形成:?作用 于 血管内皮上的磷脂,抑制花生四烯酸的释放及前列腺素产生,从而促进血管 收 缩及血小板聚集;?与血小板磷脂结合,诱导血小板的粘附与活化;?与一 的结合抑制了.的抗凝血活性。抗磷脂抗体还可直接干预受精卵的发育、着 床和胚胎的生长:?抑制细胞滋养细胞分化为合体滋养细胞,使胎盘. 合成和分泌减少;?抑制滋养细胞殖;?减弱滋养细胞侵蚀能力,干扰子宫螺 旋动脉血管重铸。这些因素与促血栓形成作用可合并发生亦可单独发生。】 等的研究表明,自身抗体促进细胞凋亡,抑制细胞的增殖; 等人的 研究表明,自身抗体可减弱滋养细胞侵蚀能力,影响胚胎的植入。抗磷脂抗体 也可激活补体,引起炎症反应和血栓形成,导致流产。抗磷脂抗体还可与血小 板膜磷脂结合激活血小板,使其聚集增加而被巨噬细胞吞噬、破坏,导致血小 板减少例。 可能通过以下途径导致流产发生【’】:可与内皮细胞、血小板 膜上一种或多种带负电荷的磷脂发生抗原抗体反应,引起血小板凝聚、血栓 形 成,使胎盘微小血管处形成血栓或梗死灶,容易梗塞从而干扰胚胎着床、发育 以及胎盘形成引起流产、胎儿宫内发育迟缓、胎死宫内等;可与血管内皮 细胞磷脂部位结合,损伤血管内皮,使前列环素合成减少,前列环素与血栓素 比例失常,导致局部血管收缩,胎盘血容量减少,造成胎儿营养供给不足而 流产和死亡;可影响子宫内膜,使孕激素分泌不足,不利于孕卵着床,导 致不孕或反复自然流产发生。还能降低膜联蛋白 在绒毛 细胞间及血管内皮细胞表面的表达,阻止 与表面促凝物的结合,干 扰其抗凝的功能。曾有研究发现,能够减少细胞表面的膜联蛋白【】。在 // 另一研究中,有学者发现将抗膜联蛋白的抗体注入 小鼠体内可导致其体内膜联蛋白一与滋养细胞结合的能力,包括胎盘栓塞、 组 织坏死和胚胎丢失【】。 正常位置的子宫内膜无抗原性,但当女性生殖道感染使其机体生理屏障受 到破坏,内部环境发生改变时,女性体内独特型抗体和抗独特型抗体的网络功 山东大学学位论文 能就会出现紊乱,同时也可使免疫系统受损及包括损伤子宫内膜,这样就会导 致机体将自身内膜组织作为抗原刺激机体产生,另外异位的子宫内膜也 可作为抗原刺激机体免疫系统,产生特异性的。抗子宫内膜抗体 是一种器官特异性抗体。关于导致流产的主要机制:一般认 为一是与子宫内膜中的靶抗原结合后,通过发生抗原抗体反应,破坏子宫内膜结 构,使子宫内膜发育不良,从而降低了对受精卵的接受性,进而影响到胚胎着 床【】造成自然流产;二是通过和子宫内膜细胞中的抗原结合,来激活补体系统, 使局部发生免疫病理变化,进而直接影响子宫内膜腺体功能,导致营养胚胎的 糖原等分泌不足,致使胚胎发育不良,最终干扰和妨碍了孕卵着床和胚胎发育, 导致自然流产。 精子作为一种独特抗原与机体免疫系统接触后,可引起自身或同种免疫反 应,产生。正常情况下,由于血睾屏障的存在,不会发生免疫反应,但当生 殖系统存在局部炎症、外伤、手术等因素时,就会损伤了这一屏障,导致精子及 其可溶性抗原漏出并被局部的巨噬细胞吞噬,进而致敏淋巴细胞,发生免疫反应, 产生。引起早期自然流产的可能机理为:与进入输卵管内的 精子或受精卵结合,使之沉积;活化巨噬细胞,对配子及胚胎产生毒性作 用;滋养层可能与精子有共同的抗原特性,可直接损伤滋养层。越来越多 的研究表明影响妊娠的结局,与自然流产有一定的关系【。 人绒毛膜促性腺激素,是在胚胎发育成长过程中,由胎盘合体滋养 细胞合成、分泌的糖蛋白激素,在配子着床和维持妊娠中有重要作用,是怀孕早 期维持黄体功能及胎盘生物学功能必不可少的特异性激,能阻止胎儿滋养细胞 与母体血清中抗体结合或被母体淋巴细胞识别。抗抗体的产生可能与流 产过程中绒毛膜组织的作为抗原刺激母体产生抗体有关。它可直接中和 的促黄体作用,从而阻止或破坏受精卵着床。最终破坏了对胎儿的 保护,致母体的免疫功能起作用引起流产【】。临床调查表明,在有流产史的妇 女,或曾接受过注射治疗,或在促排卵的妇女中,其机体中抗抗体 可能为阳性,此类患者在临床上往往较多表现为不孕或反复自然流 产【引。大样本对自然流产妇女进行抗体的检测,其阳性率为.%, 与对照组比较,有极显著差异.。说明自然流产妇女与抗抗体有 着密切的关系。 抗心磷脂抗体、抗子宫内膜抗体、抗精子抗体、山东大学学位论文 抗人绒毛膜促性腺激素抗体.是造成自然流产的不可忽视免疫因素。 在查找原因不明自然流产患者的流产原因时,应重点考虑免疫学因素可能,及早 检测上述免疫性抗体,为早期自然流产和反复自然流产的病因诊断及治疗提供 依据,防止再次流产的发生。 曾指出除了血栓形成之外,自身抗体对滋养细胞的直接损害也可 能是造成流产的原因。关于这方面的研究并不多。本实验通过对滋养细胞增殖 及凋亡等细胞发育相关指标的检测,评价对滋养细胞发育的影响。 是临床上常见的自然流产病因检查的指标之一,以前的研究主要是集 中于对子宫内膜的作用,关于对滋养层细胞在细胞水平上影响的 系统研究甚少。我们的实验利用人早孕绒毛滋养细胞体外培养后,待细胞纯度 达到试验要求后,用而其它免疫相关抗体均阴性的妇女血清对细胞 进行体外干预,观察滋养层细胞本身的变化,从细胞水平上探讨了在体 外对滋养层细胞的影响,从而研究和自然流产的关系。结果显示: 能够抑制滋养层细胞的生长。这可能是导致自然流产的原因之一。是导 致免疫性自然流产的原因之一,临床上对反复自然流产患者常规检测抗子宫 内 膜抗体,可以提高反复自然流产的治愈率【引。 三滋养细胞生物学特点与妊娠 滋养细胞的功能特点 .分化功能 胎盘植入蜕膜后,滋养层细胞可分化为两种,一种是绒毛滋养层,即彼此 融合形成合体滋养层细胞,参与营养物质和代谢产物的转运;另一种是绒毛外 滋养层,向子宫间质和螺旋动脉内呈侵袭性生长,如果滋养细胞侵袭力不足, 可能导致自然流产。体外培养的细胞滋养层细胞可自发的形成这两种表型。 增殖能力 . 早孕期滋养细胞的增殖能力很强,随着妊娠的进程而逐渐下斛 ,滋养细 胞的增殖能力可受到早孕期母.胎界面的氧压力及滋养细胞与细胞基质的相互 作用等因素的调节‘引,研究证实:反复自然流产及宫内发育迟缓等,均伴有滋 养细胞增殖能力的下斟。 .凋亡能力 早孕期细胞滋养细胞及合体滋养细胞均存在明显的凋亡现象,而且随妊娠山东大学学位论文 进展凋亡细胞所占比例有所不同。妊娠足月时,滋养细胞的凋亡率比早孕、中 孕期显著增高,而合体滋养细胞的凋亡率仅在早孕期较高,随着妊娠进展则 明 显下降,提示滋养细胞的凋亡可能与胎盘形成和分娩有关。 .侵袭能力 滋养细胞侵袭过程类似于肿瘤细胞,但它侵入的深度和范围是有节制的, 并受到严格的时序调控。仅发生在早孕期,而且部位仅限于子宫。 滋养细胞在胚胎植入过程中起重要的调节作用,其分化、增殖、凋亡、侵 袭等功能的失调与各种妊娠相关疾病的发生发展密切相关。 滋养细胞的增殖与妊娠 细胞增殖是细胞扩增及组织和器官发育的基础,在胚胎发育过程中至关重 要。一旦此过程受到破坏或干扰,就会影响到胚胎发育,进而有可能导致胚胎 发 育停滞。自然流产作为一种病理妊娠,近年研究证实,反复自然流产往往伴有 滋养层细胞增殖能力的下降‘。增殖细胞核抗原 ,又称周期蛋白, 是一种只出现在增殖状态细胞核中的蛋白质,由个氨基酸组成,无种属及 组织特异性,其本质是聚合酶的蛋白辅助因子,为的多肽,其表达 合成与细胞增殖周期相关,由期开始,于期达到峰值,至期及期 则明显减少。因此,阳性细胞的多少可以反映出细胞的增殖状态【】。因 此,是伴随细胞增殖而表达的一种核内蛋白。已被认为是一个可靠地能 反映滋养细胞群体增殖活性的标志物,对分析和判断细胞的生长、增殖有意 义。 作为一种与细胞增殖有关的抗原,目前己列为一项常规检测增生细胞的方 法。 以和的表达来检测纤维蛋白对滋养细胞增殖和分化的影 响,结果表明的表达和滋养细胞增殖成正相关。等【报道,在 正常早孕的绒毛滋养层细胞中检测到大量的,其表达水平可反映滋养层 细胞的增殖能力。 本实验采用细胞免疫荧光技术,通过检测的阳性表达率,来反映滋 养细胞在不同的干预条件下体外增殖能力。结果表明:与.血清组相 比,血清组的滋养层细胞,的表达水平明显下降,反映此时 的细胞增殖能力明显下降,与等的报道一致。 滋养细胞的凋亡与妊娠 研究表明,细胞凋亡在胚胎着床、胎盘发育、老化以及胎儿生长发育中起 山东大学学位论文 着至关重要的作用。凋亡可以促进母体界面免疫耐受的形成,但是异常或过度 的凋亡往往与孕期多种并发症的病理生理过程相关,如复发性流产、妊娠期高 血压疾病、胎儿生长受限【、早产等。有研究表明,自然流产妇女中绒毛和蜕 膜的/明显降低,与胎盘凋亡的发生具有一致性,提示凋亡因子可能通 过诱导绒毛与蜕膜组织的这一比例下降,诱导细胞凋亡,导致流产。 各种病理因素刺激包括感染、细胞毒性物质、免疫性抗体、射线等所 致的妊娠不良结局最终主要是通过细胞凋亡途径实现的。】等用病毒 干预体外培养的早孕绒毛滋养层细胞后,发现.、.、.等炎 症因子的表达明显增加,且滋养细胞的凋亡也明显增加,表明病毒可能 通过一种炎症机制诱导早孕滋养细胞的凋亡。等研究表明,能通 过/途径诱导早孕滋养细胞的炎症反应,从而触发滋养细胞凋亡, 危害滋养细胞的生存。 本实验表明:用而其它免疫相关抗体均阴性的血清对滋养层 细胞进行体外干预后,用流式细胞术检测细胞凋亡率,滋养层细胞的凋亡率 明 显增高,与.滋养层细胞的凋亡率相比,差异有统计学意义.。 综上所述:滋养细胞增殖与凋亡的平衡对于正常妊娠的维持以及病理妊娠 凋亡细胞数目增多是自然流产发的产生至关重要,滋养细胞增殖能力降低, 生 的病理过程之一【。通过研究,我们可以认为,血清能够明显抑制 滋养层细胞的增殖能力,并促进其凋亡,因而打破了滋养细胞增殖与凋亡之 间 的平衡,最终导致不良妊娠的发生,但是其确切的机制还无从得出,还有待于 进一步研究。 四治疗自身免疫因素所致流产的研究 肝素作为一种抗凝药物已经应用于临床多年,是普通肝素通过 分离或降解等方法制成的分子量较小分子量一的肝素片段。与 普通肝素相比,的优点是:不易被细胞外基质、血浆蛋白和细胞受 体结合与灭活,皮下注射生物利用度可达%,生物半衰期..是普 通肝素的~倍,抗凝效果呈明显的量效关系;具有很高的抗 活性和较低的抗活性,抗血栓作用增强,出血副作用小;对已经与血 小板结合的因子仍有抑制作用,不易被血小板第?因子灭活,在富,比普 通肝素更有效;对血小板功能影响小,较少引起血小板减少症,减少出血山东 大学学位论文 并含血小板的环境中发症;对活化部分凝血活酶时间的影响不明 显,而且呈明显量效关系,可根据体重给药,使用方便;骨质丢失减少, 骨质疏松发生率明显降低;局部及全身的皮肤过敏反应发生率明显低。 不通过胎盘,亦不分泌于乳汁中,对胎儿安全、无致畸作用。故本实验 选用为研究对象。 近年来在孕期复发性流产的治疗中使用广泛,过去一直认为 的抗凝作用是治疗复发性流产的关键。但对临床此类患者流产绒毛及蜕 膜的组织学研究发现,几乎无法找到明显的血栓,说明的治疗效果可 能与高凝状态无关,后续研究发现,可以调节滋养细胞的生长、分裂、 抗原抗体的结合、抑制滋养细胞的凋亡及诱导滋养细胞的侵袭等过程。 等研究表明肝素可以抑制样受体诱导的凋亡途径中关键酶.的活 性从而抑制滋养细胞的凋亡,同时肝素能激活表皮生长因子 ,信号转导途径促进细胞滋养细胞的存活和增殖。 发挥作用的机制尚未十分明确,除了已知的抗凝作用外,可能与肝 素的免疫抑制和免疫调节有关【,可抑制干扰素.,降低在复发性流产中升高 的。另外,直接或间接的参与了胚泡对子宫蜕膜的黏附与侵入,促 进滋养细胞增殖及胎盘形成。 抗凝作用 肝素的抗凝一般认为主要通过两个方面作用:?对凝血酶的抑制作用;? 对凝血活性因子 的抑制作用。另外,肝素可促进内皮细胞合成并释放组织 因子途径抑制因子和纤溶酶原激活物,增强纤维蛋白溶解,减弱纤维 蛋白原对红细胞、血小板的聚集桥联作用,从而减少血液高凝和高粘滞状态, 发挥抗凝作用叫。 妊娠中晚期,随着孕妇血中雌激素升高,各种凝血因子和血小板数量的增 加,血小板聚集并且对血管的黏附性增强,同时抑制抗凝血酶的作用,使血呈 高凝状态。报道,而肝素可与抗凝血酶结合而拮抗上述过程【。而且 不通过胎盘,对胎儿安全,无致畸作用,可于妊娠早期开始使用。 免疫调节和免疫抑制作用 .抗炎作用 ..通过抗凝途径介导的抗炎作用 研究发现,炎症与凝血和血栓形成之间存在着密切的联系。一方面炎症加山 东大学学位论文 剧高凝状态。炎症因子,如肿瘤坏死因子师.、白介素..及.、 激活的补体、反应蛋白等,能刺激机体内皮细胞及单核细胞产生组织因 子 ,,由此启动凝血反应;另一方面血栓形成中的物质也可 引起炎症,如纤维蛋白沉淀引起组织缺血缺氧,刺激炎症因子释放。炎症反应 开始时即伴随凝血系统的激活,两者相互作用,逐级放大,共同参与全身炎症 反应。人体内皮细胞及白细胞上存在着特异性的.效应器蛋白酶受体. .,与这类受体结合后,就会通过激活胞内信号转导促进炎性介质的 表达,激活炎症反应。而可抑制的释放,阻断与特异性受体的 结合,从而发挥抗炎作用【】。的抗凝机制主要是通过抑制凝血活性因子 实现的,而同时是一个能促进炎症反应的酶。因而亦能 通过抗凝途径特异性阻断而起抗炎作用【。 ..抗炎抗细胞粘附作用 众所周知,炎症反应的物质基础是自细胞黏附及其黏附级联反应,而这种 黏附级联反应依赖于内皮细胞和白细胞表面黏附分子。研究证实‘, 具有良好的免疫调节及抗炎、抗细胞粘附作用。的抗炎作用是通过抑 制细胞间相互作用的粘附分子的表达而途径而实现的。细胞粘附分子分为五 大 类:钙粘附分子、整合素、免疫球蛋白超家族、选择素、。肝素及其衍生 物可通过与.选择素、.选择素结合,调节选择素介导的白细胞与内皮细胞粘 附活化,而发挥抗炎作用。同时有研究证实,还可通过抑制炎症细胞表 达粘附分子,减弱白细胞脱颗粒等炎症反应,减轻对内皮细胞的损伤【。还有 体外实验研究发现,在体内可以抑制介导的迟发性免疫应答相关 的白细胞浸润作用【引,证明具有抗炎/抗粘附作用,但其具体机制还有 待进一步研究。 .抑制补体活性 有越来越多的证据表明:对流产的治疗作用还表现在体外抑制补体 活性。 等报道,导致的复发性流产,在介导凝血功能障碍和介导细 胞活化的同时,增加了补体活化,肝素联合阿斯林治疗这类流产的机理更多的 是通过抑制补体的激活作用,而不是由于它的抗凝血作用【。 等通 过对名有复发性流产史的妇女进行研究,发现合并血栓倾向的妇女再次发 生流产或不孕得风险会增加,肝素可以调高此类患者的妊娠率,事实上肝素不 仅是通过抗凝血,可能同时具有抗发炎的作用,如改变向细胞因子之山东大学学位论文 间的比例,更重要的也可能通过激活补体的途径。 对滋养细胞发育能力及侵袭力的影响 凝血机制紊乱并不能解释所有自身免疫性抗体介导的流产。直接或 间接的参与了胚泡对子宫蜕膜的黏附与侵入,促进滋养细胞增殖及胎盘形成。 等【】等通过研究发现在流产患者中.钙粘素的表达下调,粘附能力降低, 进而影响滋养层细胞的侵袭力,导致侵入不足而诱发流产的发生。之后 等【】通过动物实验证实,可通过调节.钙粘蛋白的表达,改善滋 养层细胞侵袭力避免流产的发生。 】等证实:的发生主要出现在 . 合体细胞分化时,滋养层细胞膜上表达带负电荷的磷脂与带正电荷的 结合后形成结合蛋白,抗磷脂抗体可识别这种结合蛋白,干扰了滋养细胞的增 殖分化,影响胎盘的形成,最终导致的发生。而肝素及其制剂能够与 .蛋白特异性结合,干扰 .与磷脂的结合过程,阻断抗磷脂抗体与上 述结合蛋白的识别,能够促进滋养细胞的正常增殖分化,促进胎盘发育。 ?. 参照我们课题组前期的研究【,我们选择浓度为 进 行试验。本试验结果显示,可以改善对滋养细胞发育的不良影响, 使滋养细胞成活力改善,凋亡减少。提示治疗自然流产的机制可能不 仅限于其抗凝作用,直接或间接的参与了胚泡对子宫蜕膜的黏附与侵 入,促进滋养细胞增殖及胎盘形成。其对滋养细胞功能的直接调节作用也可能 是其治疗复发性自然流产的机理,本试验亦拟证实这一观点。山东大学学位论文 结论 血清能够抑制滋养细胞增殖,并促进其凋亡,影响人早孕 绒毛膜滋养细胞发育能力,对滋养层细胞的生物学行为产生直接的影响,这可 能是导致自然流产的原因之一。 能调节对滋养细胞增殖能力与凋亡情况的影响,这可能 是其提高此类患者妊娠成功率的机理之一,但其确切的调节机制尚有待于进一 步探讨。山东大学学位论文 临床意义与展望 滋养层细胞在环境中细胞增殖能力受到抑制,凋亡率增加,在 的作用下,细胞增殖能力可以得到显著改善,凋亡率有明显下降,滋养 层细胞在干预下细胞增殖能力和凋亡率的变化有助于进一步理解 在临床上用于治疗复发性流产的作用机制。本研究可以证实对 滋养细胞增殖能力及凋亡情况的直接调节作用,这可能是其治疗复发性自然 流 产的机理。进一步开展对滋养层细胞生物学功能调节的研究,可以为 研究胎盘功能障碍等妊娠相关性疾病的病理机制奠定基础。 目前已在多种产科并发症和合并症中广泛应用,它通过改善胎盘 功能,改变多种不良妊娠结局。在产科的成功应用,使得我们将研究重 点逐步转向其可能发挥作用的机制,以期更好的指导其在临床的应用。由于 分子生物学基础仍不明确,影响胎盘功能作用机制复杂,因此需更多的 体内外研究来评估其在调节滋养层细胞增殖能力及凋亡情况方面的效能。 山东大学学位论文 附图表 一、附表 表 血.清对滋养细胞增殖能力和凋亡情况的影响 表 对滋养细胞