丙烯醛氧化对大黄鱼肌肉组织和肌原纤维蛋白结构性质的影响

丙烯醛氧化对大黄鱼肌肉组织和肌原纤维蛋白结构性质的影响 丙烯醛氧化对大黄鱼肌肉组织和肌原纤维蛋白结构性质的 影响 现代食品科技 Modern Food Science and Technology 2014, Vol.30, No.10 丙烯醛氧化对大黄鱼肌肉组织和肌原纤维蛋白 结构性质的影响 李学鹏，王祺，周凯，渠宏燕，高艳蕾，张晓琳，刘裕，励建荣 (渤海大学食品科学研究院，化学化工与食品安全学院，辽宁锦州 121013) 摘要:采用不同浓度(0~10 mmol/L)的丙烯醛溶液对大黄鱼鱼肉进行体外模拟氧化，大黄鱼肌肉组织和肌原纤维蛋白结构性质的影响。结果显示:丙烯醛处理会导致大黄鱼肌纤维缝隙变大，时肌纤维发生断裂和小片化，达0.1 mmol/L以上可导致肌肉持水性的下降。当丙烯醛浓度大于0.1 mmol/L时其含量比对照组减少了40.8%。SDS-PAGE氧化还能破坏肌原纤维蛋白的凝胶性质，使其凝胶强度、凝胶持水性、凝胶白度降低。织结构，并能引起肌原纤维蛋白氧化，从而破坏其结构和功能性质。 关键词:丙烯醛;大黄鱼;蛋白质氧化;肌原纤维蛋白;结构性质 文章篇号:1673-9078(2014)10-1-7 Pseudosciaena ——————————————————————————————————————————————— LI Xue-peng, WANG Xiao-lin, LIU Yu, LI Jian-rong Abstract: In order to of aldehydes (among secondary lipid oxidation products) on the muscle structure in croaker (Pseudosciaena crocea), the fish muscle was treated with lead to increased gaps croaker. Muscle fiber fracture and fragmentation occurred when the acrolein increase 0.1 mmol/L, whereas the contents of total sulfhydryl groups decreased significantly. Active The showed that acrolein oxidation could cause conjunction of some protein subunits, which formed aggregates ku. In addition, the oxidation caused damage of the gel properties of the myofibrillar proteins, including Key words: acrolein; large yellow croaker (Pseudosciaena crocea); protein oxidation; myofibrillar protein; structural property 收稿日期:2014-05-01 基金项目:国家自然科学基金资助项目(31301569);“十二五” 国家科技支撑项目(2012BAD29B06);高等学校博士学科点优先 发展领域专项科研基金(20113326130001) 作者简介:李学鹏(1982-)，男，博士，讲师，主要研究方向: 水产品贮藏加工;通讯作者:励建荣(1964-)，男，博士，教授，主 要研究方向:水产品贮藏加工与食品安全 1 现代食品科技 Modern Food Science and Technology 2014, Vol.30, No.10 大黄鱼(Pseudosciaena crocea)俗称大黄花，属鲈形目 ——————————————————————————————————————————————— (Perciformes)、石首鱼科(Sciaenidae)、黄鱼属(Pseudosciaena)，是我国特有的重要海水经济鱼类之一，在我国海洋渔业中占有重要的地位[1]。然而，由于大黄鱼属多脂鱼类，脂肪含量较高(11%左右)，尤其含有较多长链多不饱和脂肪酸和过渡态金属离子(Fe2+等)，极易发生由脂质氧化引起的腐败[2]。研究明，脂质氧化的次生产物(包括氢过氧化物、活性醛类等)能引起蛋白质氧化，形成蛋白质羰基衍生物和共价交联物，从而使蛋白质结构和功能性质发生改变[3]。 近年来，蛋白质氧化成为食品化学领域的热点研究问之一，它是指蛋白质分子在活性氧(Reactive oxygen species，ROS)(包括羟基自由基?OH、超氧阴离子自由基O2-?、H2O2等)的直接作用下，或通过次生氧化产物(主要指脂质氧化副产物中的氢过氧化物、活性醛类等)间接作用于蛋白质，进而引起蛋白质结构和功能性质的变化[4]。相比自由基和脂质氢过氧化物，活性醛类(丙烯醛、丙二醛等)更为稳定，能够在更大范围内造成蛋白质的氧化。丙烯醛是迄今为止所有α，β-不饱和醛中反应活性最强的脂质过氧化产物。丙烯醛分子中含有不饱和双键，可与蛋白质白质发生共价交联[5]。 畜禽肉、大豆蛋白等方面[6~7]质氧化的关注较少，仅有[8] 鱼肉蛋白质氧化机制研究及鱼类保鲜加工提供依据和参考。 贸市场，平均体长32?5 cm、体重480?50 g。冰水致死后宰杀去皮，取背部肌肉切成厚度约1.0 cm的肉片，再轻轻钻取直径约2.5 cm的小块，将肉块进行真空包装，并于-80 ?超低温冰箱冻藏备用。 主要试剂:丙烯醛，纯，购于国药集团化学试剂有限公司;——————————————————————————————————————————————— 盐酸胍、乙酸乙酯、乙醇、三氯乙酸(TCA)、乙醚、5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、2,4-二硝基苯肼(DNPH)、2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)等，均为 1.2 仪器设备 MS105DU-(上海)有限公司;BHT-312公司;Mini 公司;UV-2550Shimadzu公司;Minolta公司;Stable MicroSystemStratos冷冻高速离心机，美国集热式恒温加热磁力搅拌器，MDF-382E(CN)医用低JHG-Q60-P100型实上海融合机械设备有限公司;THZ-D型台式恒温振荡器，太仓市实验设备厂。 试验方法 1.3.1 丙烯醛模拟氧化和肌原纤维蛋白提取 将大黄鱼肌肉块分别置于浓度为0、0.01、0.10、1、5、10 mmol/L的丙烯醛溶液中，密封避光条件下在25 ?恒温水浴中孵化24 h。反应结束后将反应液置于冰浴中使之温度迅速降到4 ?以下，样品取出、沥水后绞碎，加入5倍体积的10 mmol/L的Tris-HCl(pH 7.2)，高速均质，在5000 r/min、4 ?条件下离心10 min，取沉淀，上述过程反复3次，在最后一次沉淀中加入5倍体积的10 mmol/L Tris-HCl 缓冲液(含0.6 mol/L NaCl，pH 7.2)，高速均质，在4500 r/min、4 ?条件下离心10 min，取上清液贮藏在-80 ?冰箱中备用。 1.3.2 肌肉组织观察和肌肉持水性的测定 肌肉组织观察:将氧化处理的鱼肉切成5×5×5 mm的小块，-20 ?冷藏20 min，用冷冻切片机切成8 μm薄片，置于载玻片上，采用——————————————————————————————————————————————— 苏木素-伊红(HE)染色法染色，在光学显微镜下放大40倍观察。 鱼肉持水性的测定:将鱼肉(约5 g，精确记重 1 与方法 1.1 材料与试剂 原料及预处理:鲜活大黄鱼购于杭州市文二路农 2 现代食品科技 Modern Food Science and Technology 2014, Vol.30, No.10 W0/g)置于底部垫有纱布的50 mL离心管中，在4000 g，4 ?下离心10 min后记重(W1/g)，持水率由(1)式计算得到。 WHC/%?( W0?W1 )?100% (1) W0 运用Quantity One软件进行分析和处理。 1.3.5 肌原纤维蛋白凝胶性的测定 凝胶的制备:将1.3.1中得到的蛋白冷冻干燥，用磷酸盐缓冲液将蛋白质浓度稀释到80 mg/mL，加2.5%(m/V)的NaCl，搅拌均匀后置于10 mL小烧杯中，40 ?水浴30 min后转入85 ?水浴30 min，于4 ?冷藏过夜。 凝胶强度的测定:用TA.XT plus质构仪对蛋白凝5 )1.3.3 肌原纤维蛋白羰基含量的测定 取1 mL蛋白溶液(浓度为5 mg/mL)放入塑料离心管并加入1 mL DNPH溶液(10 mmol/L含2 mol/L ——————————————————————————————————————————————— 3光度计测定其荧光强度。测定条件为:激发波长374 nm，狭缝5 nm，扫描范围250~500 nm。以荧光强度对蛋白浓度作图，曲线初始斜率即为蛋白质分子的表面疏水性指数。 SDS-PAGE凝胶电泳:参考Xiong等人的方法略做修改[9]:分离胶12%，浓缩胶4%，还原剂为DTT， ) 肌肉纤维发生不同程度的扭曲，肌肉纤维发生断裂，在丙烯醛浓度为10 mmol/L时产生明显的肌纤维小片化现象。由此可见，丙烯醛处理能够显著破坏大黄鱼肌肉组织结构，而组织结构劣变是导致肌肉质地软化和品质下降的主要原因。 2.1.2 鱼肉持水性的变化 3 现代食品科技 Modern Food Science and Technology 2014, Vol.30, No.10 纤维间隙变大并产生小片化，破坏了肌肉组织的网状结构，从而使大量储存于肌肉组织间隙的自由水难以被束缚而被排出，最终导致肌肉持水力的下降[10]，从而降低鱼肉的营养品质和加工品质。 a b 2.2 丙烯醛处理对肌原纤维蛋白氧化程度的影响 c d 图1 丙烯醛氧化体系对大黄鱼肌肉组织结构的影响(纵切，× ——————————————————————————————————————————————— 40) Fig.1 Effects of acrolein oxidation on the muscle tissue structure of Pseudosciaena crocea (longitudinal section, ×40) 注:a:对照组;b:0.1 mM丙烯醛处理组;c:1 mM丙烯醛处理组; d:10 mM丙烯醛处理组。 myofibrillar proteins 3中可以看出，丙烯醛浓度较低时(?0.1 mmol/L)，羰基含量没有显著的变化，而浓度超过0.1 时，羰基含量随着丙烯醛浓度的增加而显著增加(P<0.05)，这表明高浓度的丙烯醛对大黄鱼鱼肉蛋白羰基含量影响较大。作为反应活性最强的α, β-不 图2 注:P=0.05下同。 饱和醛，丙烯醛造成蛋白质羰基化的研究时有报道。Uchida等人[11]研究1 mmol/L丙烯醛在37 ?条件下氧 化牛血清白蛋白时发现，蛋白质羰基值随反应时间的延长而增加，通过化学和免疫学方法分析发现，丙烯醛与牛血清白蛋白中的赖氨酸残基和组氨酸残基形成迈克尔加成产物是造成蛋白质羰基化的原因。Pocernich等人[12]发现室温条件下50 μmol/L丙烯醛处理蛋白含量为4 mg/mL的突触体30 min使蛋白质羰基值增加了4.5倍。丙烯醛分子中存在的双键可以与蛋白质中组氨酸残基的咪唑基团、赖氨酸残基的ε-氨基以及半胱氨酸残基的巯基等发生亲核加成反应，从而导致了羰基的形成。 ——————————————————————————————————————————————— 2为大(0.01 mmol/L)氧化对持水性无显著影响(P,0.05)。随着丙烯醛浓度的增加，大黄鱼肌肉持水性呈显著下降趋势(P,0.05)。分析其原因可能是:一方面，氧化使得蛋白质氨基酸侧链和肽键会发生不同程度的破坏或导致一些蛋白质通过共价交联形成聚集体，从而影响了肌原纤维蛋白的水合能力，使一部分结合水变成自由水逸出;另一方面，从2.1.1肌肉组织结构观察可知，丙烯醛氧化处理使肌 4 2.3 丙烯醛氧化对肌原纤维蛋白结构性质的影响 2.3.1 巯基含量的变化 现代食品科技 Modern Food Science and Technology 2014, Vol.30, No.10 半胱氨酸是对氧化修饰最敏感的氨基酸之一，但蛋白质羰基化并不能反映半胱氨酸的氧化状态，可以用总巯基和活性巯基含量来表征半胱氨酸氧化修饰后的情况[13]。由图4可以看出，随着丙烯醛浓度增加，总巯基和活性巯基含量均呈下降趋势。活性巯基在未被氧化时约占总巯基含量的66.7%，说明大部分的半胱氨酸残基几乎都暴露在外。相比总巯基，活性巯基含量在低浓度丙烯醛时的变化更为显著(P<0.01)，丙烯醛浓度仅仅为0.01 mmol/L时，活性巯基含量相比对照组下降了40.8%。由于丙烯醛是一种软亲电试剂，而蛋白质巯基是一种软亲核试剂，丙烯醛与蛋白质巯基反应活性很高，可迅速与暴露在外的活性巯基发生迈克尔加成反应，而内部的巯基则需要随着进一步氧化使得蛋白质变性伸展而逐——————————————————————————————————————————————— 渐释放，才能进一步与丙烯醛反应。丙烯醛氧化能使得半胱氨酸中巯基形成二硫键，进一步生成小分子含硫化合物，如次磺酸和亚磺酸等氧化产物。因此，暴露在蛋白质外部的半胱氨酸极容易被丙烯醛氧化修饰，而内部的巯基由于受到蛋白质立体结构的保护氧化较为缓慢。 迅速与其周围其他蛋白的酪氨酸残基产生了共价交联，因此形成了较多的酪氨酸二聚体。 图5 2.3.3 6 丙烯醛氧化体系对大黄鱼肌原纤维蛋白表面疏水性的影 响 Fig.6 Effect of acrolein oxidation on the hydrophobicity of 图4 Pseudosciaena crocea myofibrillar protein surface 蛋白质的表面疏水性反映蛋白质分子表面疏水性氨基酸的相对含量，其变化情况可以用来衡量蛋白质的变性程度。鉴于它能够观察出蛋白位点在化学上或物理上的微妙变化，疏水性被作为评价蛋白变性的一个重要参数[15]。蛋白质的疏水性还与蛋白质溶解性和乳化性等性质密切相关，对蛋白质的加工性质有重要影响。ANS探针是应用最广泛的疏水探针，它通过非共价的形式结合到蛋白质分子的非极性区域，增强了荧光强度，在一定范围内，荧光强度与蛋白质的浓度具有良好的线性关系，因此被广泛用于蛋白质表明疏水性的测定。图6是利用ANS疏水探针法测定丙烯醛氧化前后大黄鱼肌原纤维蛋白表面疏水性的变化情况。由图可知，低浓度丙烯醛对大黄鱼肌原纤维蛋——————————————————————————————————————————————— 白表面疏水性的影响并不明显，丙烯醛浓度大于0.1 mmol/L时，表面疏水性显著增加(P,0.05)。这可能是因为，在氧化体系中蛋白构像发生变化使蛋白质 5 2.3.2 [14]。图5显示了丙烯醛氧变化情况。 由图可知，低浓度丙烯醛(?0.1 mmol/L)对二聚酪氨酸的含量并没有显著影响，而当浓度大于0.1 mmol/L时，随后丙烯醛浓度的升高二聚酪氨酸含量显著增高(P<0.05)。可能的原因是:丙烯醛浓度很低时，对酪氨酸残基的影响很小，聚合作用较微弱且不稳定;随着丙烯醛浓度的增加，对氨基酸侧链的进攻机会更多，酪氨酸单体被丙烯醛氧化的几率更大， 现代食品科技 Modern Food Science and Technology 2014, Vol.30, No.10 解折叠，一些疏水性的脂肪族与芳香族氨基酸侧链基团从蛋白分子内部暴露到极性的溶液中，导致了疏水值的增加。表面疏水性增加主要是因为蛋白质变性，蛋白质的内部结构改变，使埋藏在蛋白质内部的疏水性氨基酸残基暴露出来。另外，不同氨基酸间的疏水作用及巯基的氧化也会影响蛋白质的疏水性。相比而言，高浓度的丙烯醛溶液可以使蛋白质内部结构发生严重破坏，且对巯基的氧化程度也较大，从而使表面疏水性显著增加。 肉蛋白质凝胶能力有显著破坏作用，凝胶强度和持水性均发生显——————————————————————————————————————————————— 著降低(P,0.05)。而当丙烯醛达到较高浓度时，对蛋白质结构性质的氧化破坏作用已经达到一定限度，对凝胶网络结构形成过程中氢键、疏水和静电相互作用等的破坏趋于饱和，凝胶强度和持水性不再发生明显变化，此时凝胶也难以形成。另外，蛋白质凝胶白度也随着丙烯醛浓度的增加而降低(P,0.05)，且与凝胶持水性呈正相关关系。Park[16]认为Xia等[17]关。 2.3.4 SDS-PAGE电泳分析 图7 大黄鱼肌原纤维蛋白SDS-PAGE电泳图谱 Fig.7 SDS-PAGE patterns of Pseudosciaena crocea myofibrillar proteins SDS-PAGE或降解等情况。从图7球蛋白重链条带(约200 kuIV白。 图 Fig.8 Effect of acrolein oxidation on the gel properties of Pseudosciaena crocea myofibrillar proteins 3 结论 3.1 丙烯醛处理对大黄鱼肌肉组织具有显著破坏作用，会导致肌纤维间隙明显增大、结构变疏松，并逐步出现肌纤维小片化，同时会使鱼肉的持水性降低。 3.2 丙烯醛处理能使大黄鱼肌原纤维蛋白发生显著氧化，从而引起其结构和性质发生明显改变，主要表现在:蛋白质羰基含量随丙烯醛浓度的升高显著增加;半胱氨酸被丙烯醛氧化修饰导致总巯基和活性巯基含量显著降低;丙烯醛氧化使酪氨酸发生了聚集，形成了酪氨酸二聚体，使得二聚酪氨酸含量增加;丙烯醛——————————————————————————————————————————————— 氧化同时使蛋白质内部的疏水性氨基酸残基暴露出来，表面疏水性显 著增加。丙烯醛氧化使肌原纤维蛋白某些亚基发生交联或聚集，在肌 球蛋白重链条带上方区域产生了高分子化合物，同时也会引起原肌球 蛋白等蛋白质肽键的断裂而发生降解。丙烯醛氧化对肌原纤维蛋白的 凝胶性具有破坏作用，会导致凝胶强度、凝胶持水性和凝胶白度值的 下降。 3.3 脂质氧化产生的小分子醛类能够破坏大黄鱼肌 2.4 丙烯醛氧化对肌原纤维蛋白凝胶性质的影响 凝胶性是鱼肉蛋白质最主要的功能性质之一，对鱼肉加工适用性 影响显著。图8为丙烯醛氧化后大黄鱼蛋白凝胶性能的变化情况。可 以看出，丙烯醛对鱼 6 现代食品科技 Modern Food Science and Technology 2014, Vol.30, No.10 肉组织结构，并引起肌原纤维蛋白发生氧化，破坏肌原纤维的结 构和功能性质，从而导致鱼肉品质劣变，影响其加工适用性。 oxidative Environments [J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2009, 57: 153-159 [10] 刘泽龙.蛋白质氧化对肉及肉制品持水与水合特性的影响 机理研究[D].无锡:江南大学,2012 LIU Ze-Long. Mechanism of the alterations of water-holding capacity and hydration in meat and meat products induced by protein ——————————————————————————————————————————————— oxidation [D]. Wuxi, Jiangnan University, 2012 [11] Uchida K, Kanematsu M, Sakai K, et al. Protein-bound acrolein: potential markers stress [J]. Proceedings of the National of the [12] elevation and disease [J]. [13] ,,究进展[J].,2011,32(11):483-486 oxidation mechanism and evaluation Science and Technology of Food Industry, : 483-486 ，Gatellier P，Ssyd T，et al(Chemical oxidation proteolytic susceptibility of skeletal muscle myofibrillar proteins [J]. Meat Science, 2006, 73(3): 536-543 Chelh I, Gatellier P, Sante-lhoutellier V. Technicalnote: a simplified procedure for myofibril hydrophobicity determination [J]. Meat Science, 2006, 74(4): 681-683 [16] Park J W. Surimi gel colors as affected by moisture content and physical conditions [J]. Journal of Food science, 1995, 60(1): 15-18 [17] Xia X F, Kong B H, Xiong Y L, et al. Decreased gelling and ——————————————————————————————————————————————— emulsifying properties of myofibrillar protein from repeatedly frozen-thawed porcine longissimus muscle are due to protein denaturation and susceptibility to aggregation [J]. Meat Science, 2010, 85(3): 481-486 参考文献 [1] 杨华,娄永江.养殖大黄鱼营养成分及组织结构分析[J].中 国食品学报,2013,13(6):240-248 YANG Hua, LOU Yong-jiang. Analysis of nutrient composition and configuration in cultured pseudosciaena crocea’s muscle [J]. Journal of Chinese Institute of Food Science and Technology, 2013, 13(6): 240-248 [2] Timm-Heinrich M, Eymard S, Baron C P, et al. Oxidative changes during ice storage of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) fed different ratios of marine and vegetable feed ingredients [J]. Food Chemistry, 2013, 136(3-4): 1220-1230 [3] Lund M N, Heinonen M, Baron C P, et al. Protein oxidation in muscle foods: A review [J]. Molecular Nutrition & Food Research, 2011, 55(1): 83-95 [4] Estévez M. Protein carbonyls in meat systems: A review [J]. Meat Science, 2011, 89(3): 259-279 [5] Wu W, Wu X J, Hua Y F. Structural modification of soy protein by the lipid peroxidation product acrolein [J]. [6] Rebecca M Delles, Xiong Youling. The oxidation on hydration and water-binding in an ——————————————————————————————————————————————— oxygen-enriched atmosphere 97: 181-188 [7] [8] Li Y, Xia X, changes of the common (Cyprinus carpio) [9] ariation in the cross-linking pattern of myofibrillar protein exposed to three 7 ———————————————————————————————————————————————