细胞内酸性磷酸酶的显示

细胞内酸性磷酸酶的显示 1、掌握细胞中酸性磷酸酶的显示方法。 2、观察酸性磷酸酶在细胞中的存在部位。 细胞中存在着能分解磷酸酯的酶，它们可分为一磷酸酯酶、二磷酸酯酶和三磷酸酯 酶等三类，其中最主要的是一磷酸酯酶。这类酶按最适pH值又可分为两类，一类在pH9.5左右的条件下发挥作用，称为碱性磷酸酶；另一类在pH5.0左右的条件下发挥作用，称为酸性磷酸酶。当酸性磷酸酶与含有磷酸酶的作用底物（如甘油磷酸钠）一起保 温时，能水解磷酸酯使其释放出磷酸基，磷酸基进而与底物中存在的铅盐结合形成无色 的磷酸铅（PbHPO）沉淀物，当用黄色的硫化铵作用该沉淀时可形成黄棕色或棕黑色4 的硫化铅沉淀；从而使细胞中酸性磷酸酶显示出来。本实验项目以小鼠腹腔巨噬细胞为 材料显示该酶的存在。 1显微镜、恒温水浴锅、注射器、盖玻片、载玻片、剪刀、镊子、酒精灯 等。 2小白鼠。 36%淀粉肉汤、0.85%生理盐水、酸性磷酸酶工作液、福尔马林、钙固定 液、2%硫化铵溶液、甘油明胶封固剂。 4 （1）6%淀粉肉汤：称取牛肉膏0.3g、蛋白胨1g、氯化钠0.5g加入到100ml蒸馏水中溶解，再加入可溶性淀粉6g，温浴溶解，煮沸15分钟灭菌，置4:C冰箱中保存，使用时水浴融化。 （2）0.85%生理盐水：称取8.5gNaCl溶于1000ml蒸馏水中。 （3）酸性磷酸酶工作液： ? 0.05mol/L醋酸缓冲液：先用2ml注射器抽取1.2ml冰乙酸加入到98.8ml蒸馏水中均匀混制成0.2mol/L的醋酸液（A液），再称取醋酸钠（NaAc?3H O）2.72g溶2于100ml蒸馏水中配成0.2mol/L的醋酸钠溶液（B液）。取A液30ml加B液70ml混匀即成0.05mol/L醋酸缓冲液，置4:C保存。 ? 3%β-甘油磷酸钠溶液：称取β-甘油磷酸钠3g溶于100ml蒸馏水中，4:C保存。 ? 工作液：临用时，称取硝酸铅25mg,溶于22.5ml的0.05mol/L醋酸缓冲溶液中，待全部溶解后，再缓慢地滴加入3%的β-甘油磷酸钠液2.5ml，同时快速搅动，防止产生絮状物。 ２８ （4）福尔马林?钙固定液：先称取无水CaCl10g溶于100ml蒸馏水中配成10%2 氯化钙溶液，取该液10ml加入到80ml蒸馏水混匀，即成福尔马林?钙固定液。 （5）2%硫化铵：量取2ml硫化铵加入到98ml蒸馏水中，现配现用。 （6）甘油明胶封固剂：称取明胶7g加入42ml蒸馏水中，水浴加温溶解，再加入 50ml甘油并搅匀，另加少许麝香草酚作防腐剂，置4:C贮存，使用水浴加温融化。 1、取20g左右小白鼠一只，每日往其腹腔注射6%淀粉肉汤1ml，连续三天。 2、在第三次注射后3~4小时，再向腹腔注射生理盐水1ml。 3、过3~5分钟后取腹腔液0.1~0.3ml（注意抽取部位要尽量与注射部位相一致，否 则难以抽出）或用颈椎脱臼法处死小白鼠后，打开腹腔，用注射器（不装针头）直接吸 取腹腔液。 4、往预冷的盖玻片上滴一滴腹腔液，立即用牙签涂后放入小培养皿4:C冰箱中30分钟，使细胞自行铺展开。 5、冷风吹干玻片，如室温低于20:C，可任其自然干燥。 6、往盖玻片上滴加酸性磷酸酶工作液两滴（或将玻片插入盛有酸性磷酸工作液的 小染色缸中），37:C温育30分钟。 7、取出盖玻片用蒸馏水冲洗，然后立于吸水纸上吸去多余水分。 8、放入盛有10%福尔马林?钙固定液的小染色缸内处理5分钟，进行后固定。 9、取出玻片，在蒸馏水中漂洗，再吸去多余水分。 10、放入2%硫化铵溶液中处理3~5分钟。 11、蒸馏水漂洗。 12、取一载玻片，往其中滴一滴明胶甘油封固剂，将带水的盖玻片有细胞的一面朝 下，慢慢盖向载玻片上的明胶甘油，使盖玻片封固在载玻片上（注意避免气泡的产生）。 13、观察：将制备好的标本置于光镜下，在高倍镜下可见许多呈阳性反应的巨噬细 胞，其细胞质中出现许多大小不等的棕色或棕黑色颗粒和斑块，这便是酸性磷酸酶存在 的部位（溶酶体），有些细胞内酸性磷酸酶极为丰富，故整个细胞质都呈现出黑色沉淀。 1、简述酸性磷酸酶显示原理。 2、绘制3~4个巨噬细胞图，分别表示酸性磷酸酶存在部位。 ２９