香菇多糖的提取

香菇多糖的提取 项目三 前言 多糖(polysaccharide)是由糖苷键结合的糖链，至少要超过10个以上的单糖组成的聚合糖高分子碳水化合物，可用通式(C6H10O5)n表示。由相同的单糖组成的多糖称为多糖，如淀粉、纤维素和糖原;以没的单糖组成的多糖称为杂多糖，如阿拉伯胶是由戊糖和半乳糖等组成。多糖不是一种纯粹的化学物质，而是聚合程度不同的物质的混合物。多糖类一般不溶于水，无甜味，不能形成结晶，无还原性和变旋现象。多糖也是糖苷，所以可以水解，在水解过程中，往往产生一系列的中间产物，最终完全水解得到单糖。 多糖(polysaccharide)是由多个单糖分子缩合、失水而成，是一类分子机构复杂且庞大的糖类物质。凡符合高分子化合物概念的碳水化合物及其衍生物均称为多糖。 多糖 目前，多糖的临床作用有免疫调节、抗病毒及抗癌、降血糖、治疗肝肾疾病及消炎镇痛、美容、乳化等，除此之外，Sakata Shigenobu等通过对多种单糖、多糖及其衍生化糖类(如醛糖、黏多糖、多糖酵解后的糖)进行发酵或提取，得到一类稳定、安全的试剂，它可减少典型的有害物(如二氧芑、氰基化合物、多氯联苯等)对环境和人体的侵害，是极有意义的环保试剂。Watanabe Sa J用一种以吸附多糖(如淀粉)的羟磷灰石作载体的培养基质培养造骨细胞。此载体的特点在于不用加入血清、细胞生长因子等物质就可刺激造骨细胞生长因子受体，而且它可避免在培养某种造骨细胞时，由于血清种类的特异性而必须筛选最适血清所耗费的大量人力、财力，因而此项发明的问世无疑大大地降低了造骨细胞的培养费用，具有极高的经济价值和社会价值。 1 项目三 目录 一、香菇:(1)概述……………………………………………………3 二、香菇提取物:(1)成分及功能……………………………………5 (2)营养价值…………………………………….6 ( 3) 香菇多糖的简介………………………………7 三、香菇多糖的提取……………………………………………………..8 四、香菇多糖的检测……………………………………………………9 五、香菇多糖的应用和市场前景………………………………………10 六、本组实验报告………………………………………………………13 2 (2)功能…………………………………………………..4 项目三 第一章 认识香菇 3 项目三 香菇 高辅助性T 细胞的活力而增强人体体液免疫功能。大量实践，香菇防治癌症的范围广泛，已用于临床治疗。香菇还含有多种维生素、矿物质，对促进人体新陈代谢，提高机体适应力有很大作用。香菇还对糖尿病、肺结核、传染性肝炎、神经炎等起治疗作用，又可用于消化不良、便秘、减肥等。我国不少古籍中记载香菇“益气不饥，治风破血和益胃助食”。民间用来助痘疮、麻疹的诱发，治头痛、头晕。现代研究证明，香菇多糖可调节人体内有免疫功能的T细胞活性，可降低甲基胆蒽诱发肿瘤的能力。香菇对癌细胞有强烈的抑制作用，对小白鼠肉瘤180的抑制率为97.5%，对艾氏癌的抑制率为80%。香菇还含有双链核糖核酸，能诱导产生干扰素，具有抗病毒能力。香菇含有水溶性鲜味物质，可用作食品调味品，其主要成分是5’-乌苷酸等核酸成分。 4 项目三 担孢子萌发时不产生典型的芽管，而是先膨大为原来的2-5倍，孢子沿长轴方向生长，内部出现空泡;在细胞核分裂时，核先拉长，后中部收缩，核膜始终存在。担孢子在培养基上形成单核菌丝。 (2)单核菌丝 条件适宜时，单核菌丝的先端细胞反复分裂，向前伸长。细胞分裂时，细胞核首先分裂。单核菌丝不具产生子实体的能力。 (3)双核菌丝 两条可亲和的单核菌丝接合之后，一方细胞内的细胞核迁移到另一方的细胞内，这种现象称为接合或称质配。经质配后，每个细胞中含有两个细胞核的菌丝，称为双核菌丝。香菇的双核菌丝具有锁状联合。双核菌丝在适宜的条件下可大量形成子实体。 (4)子实体分化的程序 当外界具备香菇子实体分化和发育的条件时，达到生理成熟的菌丝就进入纽结阶段。最初菌丝互相交织成直径0.5-1.0mm的菌丝团，其后逐渐增大，内部变得很致密，当直径达1-2mm时，成为坚固的菌丝团称为盘状体或原基。以后逐渐分化、膨大而形成商品子实体。 第二章 香菇提取物 香菇(Lentinus edodes)在日本和中国已有数千年的使用历史。其同时作为一种食物和药用植物而闻名。很长时间以来，人们都相信香菇可以增长精力，治疗感冒和去除肠道寄生虫。香菇含有脂肪，碳水化合物，蛋白质，纤维，维他命和矿物质。然而，其关键成分则是被称作香菇多糖的多糖。香菇多糖是从香菇粉碎的菌丝体中提取，其中富含多糖和木脂素。利用在香菇顶盖和茎干生长之前出现的菌丝体，粉碎后制造的香菇制品可能可降低乙型肝炎传染力。香菇也可刺激白细胞制造干扰素。在实验室研究中其显示有助于增强免疫力。 一、功能 1. 减少血清胆固醇 香菇显示可减少血清胆固醇。香菇纤维80%是甲壳素。其为构成如跳蚤卵外壳和甲壳类动物身体等坚硬物质的坚固原料。在一篇1985年日本发布的论文中，显示甲壳素可降低血清胆固醇。香菇还含有香菇嘌呤。1971年 5 项目三 的一项试验显示香菇嘌呤使胆固醇降低了5%至10%。香菇中另一类胆固醇对抗物质是香菇多糖。根据东西方刊物，香菇提取物使进食高胆固醇的小鼠血中的血清胆固醇减少了25至45%。其使胆固醇在肝部加工活化，试验显示对受肝部损伤化合物影响的试验小鼠明显的护肝作用。 2. 增强免疫系统 当前研究主要集中在香菇作为免疫刺激剂的功能以及对抗众多疾病包括动脉粥状硬化，癌症，细菌和病毒感染等的能力。 近期的对香菇的科学兴趣主要集中在香菇所含的大量物质上，其中包括香菇菌丝状菌体(LEM)，其已经在对病毒感染患者如人体免疫力缺陷病毒(HIV)和获得性免疫缺陷综合症(AIDS)的治疗中表现良好。香菇LEM的抗病毒活性可能是因为其具有诱导干扰素这类产生对病毒感染细胞免疫的天然化学物质产生的能力。 香菇也被研究其降低血液凝结的能力;而且现在因其抗凝血性质而着重指出如患者在服用薄血药时在很长时期内必需避免食用过多的香菇。 3. 抗癌活性 一类被称为香菇多糖的，从香菇中提取的多糖物质也具有使肿瘤缩小的能力。香菇多糖当前正在被试验性质地作为抗癌药物使用，刺激T淋巴细胞和天然杀手细胞产生。科学家确信香菇多糖通过刺激某些免疫功能显著的白细胞从而抑制癌肿瘤。实际上，这种美味而多用途的真菌给予健康帮助的潜能是如此有前途，以致纽约斯隆/凯德琳癌症纪念研究中心的科学家确信香菇和其他药用菇类的预防或治疗致命健康情况的潜力应得到更加认真的研究。 二、香菇多糖的化学成分 香菇提取物以含10%或20%的多糖(香菇多糖)为。 香菇提取物用优质香菇为原料，经过工艺发酵提取而成。 香菇提取物提取物富含丰富的香菇多糖，香菇多糖是种具 β-(1?3)、(1?6)支链的β,(1?3)葡聚糖，香菇提取物中还含有香菇素和香菇腺嘌呤。 三、香菇提取物的营养价值 香菇含有的10余种氨基酸，其中有异亮氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、缬氨酸等7种人体必需的氨基酸及维生素B1、B2、PP及矿物盐和粗纤维等。 四、香菇提取物的保健价值 1、香菇中含不饱和脂肪酸甚高。除了含有还含有麦角甾醇 (ergosterol)外，还有菌甾醇(fungi sterol)，尤其所含大量麦角甾醇可转变为维生素D，有增强人体抗疾病和预防感冒的功效; 6 项目三 2、经常食用香菇对预防人体缺乏维生素D而引起的血磷、血钙代谢障碍导致的佝偻病有益(特别是婴儿)，可预防人体各种粘膜及皮肤炎症; 3、香菇中还有腺嘌呤(eriadenine)和胆碱，可预防肝硬化和血管硬化; 4、香菇中又含酪酸氧化酶，有降低血压的功效。 5、香菇中还分离出降血清胆固醇的成分(C6H11O4N5,C9H11O3N5) 五、香菇多糖( Lentinan,LTN )功效 1.香菇多糖具有免疫调节和抗肿瘤的作用:香菇多糖对调节人体免疫功能的 T细胞有促进作用，刺激抗体的形成和活化巨噬细胞，降低甲基胆蒽诱发肿瘤的能力，故对癌细胞有强烈的抑制作用。香菇多糖被称为免疫学中的外周疗法(Scheme efferent)而应用于抗肿瘤的临床上，在人体中，香菇多糖能增加DNA的合成和外周单核细胞免疫蛋白的产生。 2.香菇多糖的护肝解毒作用:香菇多糖可显著降低,, l4，硫代乙酰胺和强的松龙引起的,,,升高，并可拮抗,,l4肝损伤肝糖元含量降低，具有保肝解毒作用。 3.香菇还含有双链核糖核酸，能诱导产生干扰素，具有抗病毒能力。香菇提取物具有抗血小板凝集作用。 六、香菇性味功用 甘，平。能开胃健脾，补中益气，治风破血。适用于治疗贫血、痘疹、麻疹不透、佝偻病、食俗不振、高血压、扁桃体炎等症、亦可用于肝病防治和作维生素补偿剂。 七、香菇多糖用途 香菇多糖是从精选香菇子实体中提取的有效活性成分，其气味芳香，营养丰富，功效显著，可做各类保健品、食品及调味品的添加原料。 八、 香菇多糖的简介 香菇多糖又称香蕈、椎耳、香信、冬菰、厚菇、花菇，英文名:Lentinan。香菇是我国传统的著名食用菌，在世界上最早人工驯化栽培。香菇营养丰富，味道鲜美，被视为“菇中之王”。其中含 香菇多糖 有十多种氨基酸，其中有异亮氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、缬氨酸等7种人体必需的氨基酸，还含有维生素B1、B2、PP及矿物盐。 7 项目三 第三章 香菇多糖的提取 原理 利用深层液体发酵培养香菇菌丝体后，从发酵液中提取菌丝体，从而得到胞沉淀物加水600mL，于96~100?再次水浴浸提2.5H，离心收集上清夜，合并2次的离心上清夜，真空浓缩至4~5mL，加20mL无水酒精混匀，静置过夜，弃上清夜后，用85%酒精洗涤2次，再弃上清夜，晾干沉淀物即为香菇多糖。30g菌丝体经该工艺提取，可得480mg香菇多糖，收率为1.6%。 方法2:香菇发酵液经离心(3000r/min，10~15min钟)，弃上清夜得菌丝体。取菌丝体2Kg(湿重)，用沸水(90~100?)浸提3次，合并3次的热水提取液，加入3倍体积的96%酒精，充分混合，置于4?下静置沉淀，弃上清夜，沉淀晾干后为棕色无定形粉末，即KS-2粗品。 实验器材与试剂: 器材:烘箱、烧杯、粉碎机、40目筛、托盘天平、恒温水浴锅、布氏漏斗、抽滤机、滤纸、离心机、离心管、量筒、分液漏斗、玻璃棒; 试剂:市售香菇、无水乙醇、蒸馏水、氯仿、正丁醇。 以香菇为原料，经105?恒温烘箱烘干, 用粉碎机粉碎, 能过40目筛, 称取0.5Kg 香菇粗粉。用热水浸提(料水比1:15，100?，1h), 趁热抽滤。滤液用离心管装入定量的多糖抽提物, 并加人无水无醇(调解乙醇浓度), 放置离心3000r/min 15分钟过滤、沉淀、烘干、称量, 得到粗多糖;粗多糖中蛋白质采用萃取法分离(V样品:V氯仿:V正丁醇=5:4:1)。 8 项目三 提取方法:近年来关于香菇多糖的提取研究很多，可分为水浸提法提取、酸法提取、碱法提取、酶法提取及超声法微波法提取等，由于香菇多糖的提取应避免在强酸碱溶液中进行，否则极易造成糖苷键断裂及构象变化，不仅要考虑到粗多糖的得率，还要保证不破坏多糖的结构，由于酸对多糖的糖苷键有破坏作用，故一般采用热水和稀碱作为浸提剂，热水浸提的温度一般为90?-100?，浸提时间 1 h-3 h，浸提次数为 2 次 3 次，合并浸提液，离心，收集上清液，减压浓缩到适当体积，加入一定量的乙醇静置过夜，离心，收集沉淀物，干燥得粗多糖，碱浸提通常采用 NaOH 作为浸提液，浓度为0 1 mol/L-1 mol/L 为了提高香菇多糖的提取率，减少能源消耗，缩短提取时间，研究者们尝试了一些其它的提取方法。 香菇多糖提取采用热水抽提法，分离采用萃取法，结果: pH=7 0， 95?左右，浸提3 5 min，原料水(体积比) =1 20，醇析浓度为 70 % 乙醇 香菇多糖分离(除去蛋白质) 采用萃取法:样品-氯仿+正丁醇(体积比)为 1 1;氯仿-正丁醇(体积比)为 4 1，萃取时间 30 min。 第四章 香菇多糖的检测 简介 苯酚-硫酸法是利用多糖在硫酸的作用下先水解成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后与苯酚生成橙黄色化合物。再以比色法测定。 原理 多糖在硫酸的作用下先水解成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后与苯酚生成橙黄色 化合物。再以比色法测定。 试剂 1( 浓硫酸:纯，95.5% 2( 80%苯酚:80克苯酚(分析纯重蒸馏试剂)加20克水使之溶解，可置冰箱中避光长期储存。 3( 6%苯酚:临用前以80%苯酚配制。(每次测定均需现配) 4( 标准葡聚糖(Dextran,瑞典Pharmacia),或分析纯葡萄糖。 5( 15%三氯乙酸(15%TCA):15克TCA加85克水使之溶解，可置冰箱中长期储存。 9 项目三 6( 5%三氯乙酸(5%TCA):25克TCA加475克水使之溶解，可置冰箱中长期储存。 7( 6mol/L 氢氧化钠:120克分析纯氢氧化钠溶于500ml水。 8( 6mol/L 盐酸 操作 1(制作标准曲线:准确称取标准葡聚糖(或葡萄糖)20mg于500ml容量瓶中，加水至刻度，分别吸取0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6及1.8ml,各以蒸馏水补至2.0ml，然后加入6%苯酚1.0ml及浓硫酸5.0ml,摇匀冷却，室温放置20分钟以后于490nm测光密度，以2.0ml水按同样显色操作为空白，横坐标为多糖微克数，纵坐标为光密度值，得标准曲线。 2(样品含量测定: ?取样品1克(湿样)加1ml 15%TCA溶液研磨，再加少许5,TCA溶液研磨，倒上清液于10毫升离心管中，再加少许5,TCA溶液研磨，倒上清液，重复3次。最后一次将残渣一起到入离心管。注意:总的溶液不要超出10毫升。(既不要超出离心管的容量)。 ?离心，转速3000转/分钟，共三次。第一次15分钟，取上清液。后两次各5分钟取上清液到25毫升锥形比色管中。最后滤液保持18毫升左右。(测肝胰腺样品时，每次取上清液时应过滤。因为其脂肪含量大容易夹带残渣。) ?水浴，在向比色管中加入2毫升6mol/L 盐酸之后摇匀，在96?水浴锅中水浴2小时。 ?定容取样。水浴后，用流水冷却后加入2毫升6mol/L 氢氧化钠摇匀。定容至25毫升的容量瓶中。吸取0.2 ml的样品液，以蒸馏补至2.0ml，然后加入6%苯酚1.0ml及浓硫酸5.0ml,摇匀冷却室温放置20分钟以后于490nm测光密度。每次测定取双样对照。以标准曲线计算多糖含量。 注意 (1)此法简单、快速、灵敏、重复性好，对每种糖仅制作一条标准曲线，颜色持久。 (2)制作标准线宜用相应的标准多糖，如用葡萄糖，应以校正系数0.9校正μg数。 (3)对杂多糖，分析结果可根据各单糖的组成比及主要组分单糖的标准曲线的校正系数加以校正计算。 (4)测定时根据光密度值确定取样的量。光密度值最好在0.1——0.3之间。比如:小于0.1之下可以考虑取样品时取2克，仍取0.2ml样品液，如大于0.3可以减半取0.1ml的样品液测定。 10 项目三 第五章 香菇多糖的应用和市场前景 11 项目三 香菇多糖胶囊( 国药准字Z20080579)主要成份为葡聚糖、甘露糖肽等多糖以及多种氨基酸，具有抗肿 香菇多糖胶囊产品外包装 瘤、治肝保肝、增强机体免疫力等作用。 香菇多糖胶囊具有激活细胞免疫、调节多种体液免疫因子、诱导α-干扰素生成，调节机体免疫应答反应，诱导白细胞对肿瘤浸润，导致肿瘤部位血管扩张、出血、坏死，阻止病毒与宿主细胞的结合，提高SOD活性，抑制MDA生成，抗脂质氧化，降低胆固醇，调节糖代谢、改善糖耐量、扩张胃肠道产生饱腹感而减轻食欲，降低血糖等作用。 12