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小鼠黑色素移植瘤血管生成拟态CD31、CD34、组织蛋白酶D表达意义

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小鼠黑色素移植瘤血管生成拟态CD31、CD34、组织蛋白酶D表达意义小鼠黑色素移植瘤血管生成拟态CD31、CD34、组织蛋白酶D表达意义 DOC格式论文,方便您的复制修改删减 小鼠黑色素移植瘤血管生成拟态CD31、 CD34、组织蛋白酶D表达意义 (作者:___________单位: ___________邮编: ___________) 【摘要】 目的 动态观察CD31、CD34、组织蛋白酶D在黑色素移植瘤血管生成拟态形成(VM)中的表达。方法 制作小鼠黑色素移植瘤动物模型,成瘤后每天随机抽取1只小鼠处死,12 d共获得肿瘤样本114例;行HE染色、CD31、CD34、组织蛋白酶D免...
小鼠黑色素移植瘤血管生成拟态CD31、CD34、组织蛋白酶D表达意义
小鼠黑色素移植瘤血管生成拟态CD31、CD34、组织蛋白酶D达意义 DOC论文,方便您的复制修改删减 小鼠黑色素移植瘤血管生成拟态CD31、 CD34、组织蛋白酶D表达意义 (作者:___________单位: ___________邮编: ___________) 【摘要】 目的 动态观察CD31、CD34、组织蛋白酶D在黑色素移植瘤血管生成拟态形成(VM)中的表达。方法 制作小鼠黑色素移植瘤动物模型,成瘤后每天随机抽取1只小鼠处死,12 d共获得肿瘤样本114例;行HE染色、CD31、CD34、组织蛋白酶D免疫组化染色。结果 移植瘤早期存在VM,晚期被内皮依赖性血管替代;VM周围肿瘤细胞中CD31、CD34阳性百分率高于远离VM区域的阳性百分率;内皮依赖性血管周围肿瘤细胞CD31阳性百分率与远离内皮依赖性血管区域的阳性百分率之间存在差别;VM周围肿瘤细胞组织蛋白酶D阳性百分率高于内皮依赖性血管周围的阳性百分率;VM密度与VM周围肿瘤细胞CD31、CD34阳性百分率相关;内皮依赖性血管密度只与内皮依赖性血管周围肿瘤细胞中CD31阳性百分率相关。结论 移植瘤中VM是暂时性血液供应方式;组织蛋白酶D、CD31、CD34均与黑色素移植瘤VM形成有关。 【关键词】 血管生成拟态; 肿瘤血管生成; 细胞黏附分子;恶性黑色 DOC格式论文,方便您的复制修改删减 素瘤;组织蛋白酶D 血管生成拟态形态(VM)是肿瘤细胞变形并相互黏附形成的暂时血液供应模式,与内皮血管共存并密切相关,CD31、CD34是血管内皮标记物,均与血管新生有关,而与VM的关系未见报道;组织蛋白酶D是肿瘤细胞浸润间质重要的蛋白酶,与肿瘤细胞外基质重塑相关,本实验通过对肿瘤VM中上述各种指标表达的动态变化的研究,探讨其在VM形成中的作用。 1 材料与方法 1.1 实验动物与方法 C57小鼠购自北京军事医学科学院动物室,6,8周龄,共20只,雌雄各半,体重25,30 g,编号后洁净实验室饲养。B16细胞株复苏,1640细胞培养基培养6 d,0.2%胰酶消化,调整细胞密度达到1×107/ml。75%乙醇消毒小鼠蹊部,每只小鼠皮下注射0.2 ml细胞悬液,多处种植。10 d后成瘤,根据随机数字表每天处死1只小鼠,共12 d。获取所有肿瘤样本114个。10%甲醛固定,常规石蜡包埋。 1.2 免疫组织化学染色 1.2.1 试剂 鼠抗小鼠CD31、CD34、组织蛋白酶D单克隆抗体,购自福建迈新试剂公司,0.1 ml包装,工作浓度1?50;二抗、三抗为SP复合物和山羊抗兔PV6001,购自北京中山试剂公司。 1.2.2 免疫组化主要步骤 二甲苯脱蜡、梯度乙醇至水,3%过氧化氢灭活内源性过氧化酶,PBS缓冲液振洗,抗原微波热修复,山羊血清封闭、一抗4?过夜,二抗、三抗各孵育1 h,DAB显色10, DOC格式论文,方便您的复制修改删减 15 min,复染核脱水透明,中性树胶封固。 1.3 计数方法 1.3.1 区域划分 中央区与外周区的划分,避开肿瘤坏死,将每张切片中肿瘤组织镜下视野均匀分成3等份,内1/3区域为中央区,外1/3为外周区。VM周围与远离VM、内皮依赖性血管周围与远离内皮依赖性血管的划分,以VM、内皮依赖性血管为中心的高倍视野定义为VM、内皮依赖性血管周围;距离上述视野1个高倍视野的肿瘤细胞即为远离VM和内皮依赖性血管。 1.3.2 计数 低倍镜下找到典型区域,在高倍镜下(×400)连续计数10个高倍视野内的VM、内皮依赖性血管,其均值即为VM密度、内皮依赖性血管密度;计数VM周围、内皮依赖性血管周围、远离VM、远离内皮依赖性血管区域肿瘤细胞中阳性细胞数。 1.4 统计学处理 应用SPSS10.0统计软件,两样本之间作MannWhitney非参数检验。微血管、VM周围各指标的表达与VM密度、微血管密度之间作直线回归相关。 2 结 果 2.1 常规形态学观察 肿瘤直径4 mm,1.5 cm,血管丰富,浸润生长,周界不清,部分区域散在出血坏死。镜下可见肿瘤细胞周围形成没有内皮细胞衬覆的不规则腔隙,内可见红细胞,即VM,共26例。中央区VM较多见,外周区VM较少。内皮依赖性血管多位于移植瘤外周区。在移植瘤成瘤的第1,8天可见到典型的VM样结构,至第9,12天被内皮依赖性血管所替代。中央区的VM密度在移植 DOC格式论文,方便您的复制修改删减 瘤形成后的第1,3天呈递增趋势,第4,8天呈递减趋势。肿瘤外周区的VM密度在第1,4天呈现递增趋势,在第5,8天呈现递减趋势。从空间上对比两个区域内的血管生成拟态密度显示,在第1,6天肿瘤中央区的密度高于外周区的密度,在第7,8天肿瘤外周区的密度高于中央区的密度。内皮依赖性血管密度在肿瘤的中央区和外周区均呈现递减趋势。空间上对比两个区域内的内皮依赖性血管密度发现,在第1,7天肿瘤中央区的密度高于外周区密度,在第8,12天肿瘤两个区域内密度差别不明显。 2.2 各种指标在肿瘤不同区域的表达变化规律 2.2.1 CD31在肿瘤不同区域的表达 肿瘤细胞表达CD31抗原,且围成VM的肿瘤细胞不表达或极少表达CD31抗原,VM周围的肿瘤细胞高表达CD31抗原。统计学分析显示,VM周围的肿瘤细胞表达CD31的阳性率高于远离VM肿瘤细胞,内皮依赖性血管周围肿瘤细胞CD31表达的阳性率高于远离内皮依赖性血管肿瘤细胞的表达(表1)。VM密度与其周围肿瘤细胞CD31阳性表达之间存在相关(r=0.786 0,P=0.004)。表1 CD31在肿瘤不同区域的表达(个/高倍视野) 2.2.2 CD34在肿瘤不同区域的阳性表达 VM周围肿瘤细胞CD34表达阳性率高于远离VM的肿瘤细胞CD34表达的阳性率(表2);VM密度与其周围肿瘤细胞CD34的阳性表达率之间存在相关(r=0.869 4,P=0.000)。 表2 CD34在肿瘤不同区域的阳性表达(个/高倍视野) DOC格式论文,方便您的复制修改删减 2.2.3 组织蛋白酶D在肿瘤不同区域的表达 VM周围的肿瘤细胞组织蛋白酶D的表达水平高于内皮依赖性血管周围肿瘤细胞的表达水平。 2.3 内皮依赖性血管密度与周围肿瘤细胞各免疫组化指标之间的相关分析 内皮依赖性血管密度与其周围肿瘤细胞CD31(r=0.783 1,P=0.005)表达水平之间存在相关,与其他指标之间不存在相关。 3 讨 论 VM是近年发现的存在于某些肿瘤内的一种暂时血液供应模式,肿瘤组织通过VM与宿主血管连通,从而使肿瘤获得血液供应。本研究发现VM只在黑色素移植瘤发生早期存在,并与内皮依赖性血管共存,逐渐被内皮依赖性血管取代,因此推测VM的存在与肿瘤发展过程中局部的缺氧密切相关。 形成VM的肿瘤细胞变形,模拟内皮细胞相互黏附连接,并重塑细胞外基质,形成不规则腔隙。CD31即血小板内皮细胞黏附分子1(plateletendothelial cell adhesion molecule,PECAM1),是一种内皮细胞连接分子,参与多种生理过程,并能介导多种配体相互作用〔1,3〕。CD31抗原广泛表达于血管的各种细胞上,免疫组化检测指标可作为机体血管生成的标志。SuyaYang等研究发现CD31在培养的内皮细胞上有表达,主要集中于细胞连接处,利用CD31单克隆抗体可以阻止人脐静脉内皮细胞在体外培养基上形成管腔样结构,并且抑制细胞伸长、迁移和在胶原基质中浸润形成网状结构的能力〔4,6〕,因此CD31对内皮依赖性血管的形成十分重要; DOC格式论文,方便您的复制修改删减 同时Alik等研究发现,人的脐静脉内皮细胞平铺到滴加CD31抗体的培养基上,内皮细胞仍能正常地贴附到培养基上,但却不能形成细胞间的紧密连接和cobblestone外观,但在已经形成紧密连接的内皮细胞培养基中加入该抗体则不能影响细胞间的连接,因此认为CD31对已经形成连接的内皮细胞进一步发展的作用不明显。本实验发现移植瘤细胞也表达CD31抗原,阳性率97%(111/114);同时VM周围的肿瘤细胞较远离VM的肿瘤细胞高表达CD31,提示CD31抗原参与了肿瘤VM;同时发现围成VM的肿瘤细胞低表达CD31抗原,而VM周围的肿瘤细胞高表达CD31,统计学分析显示CD31抗原在VM周围的表达与VM密度之间密切相关。因而推测CD31抗原在VM形成中的作用与内皮依赖性血管相似,对维持已形成的VM结构作用不明显,而对肿瘤细胞形成VM起主要作用;实验中还发现高表达CD31的肿瘤细胞变成梭形,彼此黏附,具有形成管腔的趋势,同时一部分衬覆在PAS阳性物质内壁的肿瘤细胞分泌CD31抗原,作为一个细胞间的连接分子,使肿瘤细胞在变形后能模仿内皮细胞更好地连接在一起,构成血液通道。 CD34分子是高度糖基化的?型跨膜糖蛋白,选择性地表达于人类及其他哺乳动物造血干/祖细胞表面,并随细胞的成熟逐渐消失。目前已有的研究表明CD34分子在介导细胞间黏附中发挥主要作用,可以加速血管前内皮细胞聚集形成血管,而且CD34在新生血管内皮中表达远大于非新生内皮〔7〕;同时CD34可以参与造血干细胞运输、定植,参与炎症反应及淋巴细胞的归巢。此外少数间叶细胞及其相应 DOC格式论文,方便您的复制修改删减 肿瘤中也发现CD34高水平表达〔8,9〕。本研究CD34在肿瘤组织中的阳性表达率为65.7%(75/114),而且VM周围的肿瘤细胞CD34的阳性表达高于内皮依赖性血管周围肿瘤细胞的表达,说明CD34参与VM和内皮依赖性血管的形成;同时还观察到VM周围内皮依赖性血管内皮高表达CD34,说明VM存在严重的区域缺氧,新生血管形成进一步缓解其缺氧状况;同时统计学分析显示VM密度与其周围肿瘤细胞CD34表达之间无相关性,内皮依赖性血管密度与其周围肿瘤细胞CD34表达之间存在相关性,因此认为CD34是影响内皮依赖性血管形成的主要因子,对其形成起主导作用;而在调节VM形成中处于次要地位,对VM形成的作用不如对内皮依赖性血管作用明显。 组织蛋白酶D是一种相对分子量为3.4×104的天门冬氨酸肽链内切酶,广泛存在于不同的组织细胞和肿瘤细胞中,在酸性环境下降解细胞外蛋白质,有利于肿瘤细胞的浸润和转移,与乳腺癌、膀胱癌等的浸润和转移密切相关。研究认为组织蛋白酶D的纤溶酶原的水解片段有抑制血管生成作用,缺氧导致的环氧化酶2的高表达对组织蛋白酶D有明显的抑制作用,使后者的抗血管生成作用受抑制,血管密度增加〔10〕。目前有关它在血管生成拟态中作用的研究未见报道。本实验说明组织蛋白酶D参与了肿瘤细胞与细胞外基质的相互作用,便利肿瘤细胞塑型并相互连接形成VM,这种作用尤其是在VM的早期更加明显;统计学分析的结果不支持组织蛋白酶D与VM之间存在相关,因此有关该蛋白酶在VM中的作用尚不肯定,需要进一步深入研究。 DOC格式论文,方便您的复制修改删减 【参考文献】 1 Folberg R,Arbieva Z,Moses J,et al.Tumor cell plasticity in uveal melanoma,microenvironment directed dampening of the invasive and metastatic genotype and phenotype accompanies the generation of vasculogenic mimicry patterns〔J〕.Am J Pathol,2006;169(4),137689. 2 Sun B,Zhang S,Zhang D,et al.Vasculogenic mimicry is associated with high tumor grade,invasion and metastasis,and short survival in patients with hepatocellular carcinoma〔J〕.Oncol Rep,2006;16(4),6938. 3 Seftor EA,Meltzer PS,Kirschmann DA,et al.The epigenetic reprogramming of poorly aggressive melanoma cells by a metastatic microenvironment〔J〕.J Cell Mol Med,2006;10(1), 17496. 4 Hess AR,Seftor EA,Gruman LM,et al.VEcadherin regulates EphA2 in aggressive melanoma cells through a novel signaling pathway,implications for vasculogenic mimicry 〔J〕.Cancer Biol Ther,2006;5(2),22833. DOC格式论文,方便您的复制修改删减 5 Fujimoto A,Onodera H,Mori A,et al.Tumour plasticity and extravascular circulation in ECV304 human bladder carcinoma cells〔J〕.Anticancer Res,2006;26(1A),5969. 6 Van der Schaft DW,Hillen F,Pauwels P,et al.Tumor cell plasticity in Ewing sarcoma,an alternative circulatory system stimulated by hypoxia〔J〕. Cancer Res,2005;65(24),115208. 7 Zhang S,Guo H,Zhang D,et al.Microcirculation patterns in different stages of melanoma growth〔J〕.Oncol Rep, 2006;15(1),1520. 8 Hess AR,Postovit LM,Margaryan NV,et al.Focal adhesion kinase promotes the aggressive melanoma phenotype〔J〕.Cancer Res,2005;65(21),985160. 9 Marks LS,Mazer NA,Mostaghel E,et al.Effect of testosterone replacement therapy on prostate tissue in men with lateonset hypogonadism,a randomized controlled trial〔J〕.JAMA,2006;296(19),235161. 10 Chiappelli M,Borroni B,Archetti S,et al.VEGF gene DOC格式论文,方便您的复制修改删减 and phenotype relation with Alzheimer′s disease and mild cognitive impairment〔J〕. 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