咪达唑仑

咪达唑仑 10、咪达唑仑理化性质、纯度检验、含量测定等质量研究工作的试验资料及文献资料 10.1品种概况 咪达唑仑是化学药品转正品种，转正标准号为WS-(X-199)-2003Z，属于1 麻醉药品。根据市场需求及公司实际情况，我们对咪达唑仑进行研制开发。 通 用 名:咪达唑仑 英文名称:Midazolam 汉语拼音:Midazuolun 中文化学名:1-甲基-8-氯-6-(2-氟苯基)-4H-咪唑并[1,5-a][1,4] 卄苯并二氮杂 卓 英文化学名:1-methyl-8-chloro-6-(2-fluorophenyl)-4H-imidazo[1,5-a][1,4] benzodiazepine 化学结构式: NCH3 N N ClF CAS.NO: 59467-70-8 化学分子式:CHClFN 18133 分 子 量:325.77 10.2试药和仪器 10.2.1样品与对照品 对照品批号:20071101由浙江九旭药业有限公司研究中心合成部提供，浙江省药品检验所标化; 样品批号:20080301、20080302、20080303由浙江九旭药业有限公司研究 1 中心合成部提供; 精制品批号:20071201由合肥茂林化学科技有限公司合成。 在100ml圆底烧瓶中加入乙酸乙酯50ml，咪达唑仑16g，搅拌升温至溶解，加入2g活性炭脱色，趁热过滤，滤液搅拌，缓慢冷却，析晶，冰浴冷却，抽滤，用少量冰乙酸乙酯洗涤固体，60?真空干燥，得咪达唑仑精制品11.2g(批号20071201)。 10.2.2主要实验设备与仪器 AB135-S分析天平 梅特勒-托利多有限公司 Shimadzu LC-10ATVP液相色谱仪 岛津公司 Shimadzu SPD-10AVP UV-VIS器 岛津公司 200电子天平 上海第二天平仪器厂 TG-328 上海天平仪器厂 AE240分析天平 梅特勒-托利多有限公司 WRS-1数字熔点仪 上海物理光学仪器厂 pHs-3C型精密酸度计 上海雷磁仪器厂 SB2200超声波清洗器 上海Branson公司 751-GW分光光度计 上海分析仪器厂 UV/VIS 7501紫外分光光度计 上海天美科学仪器有限公司 SX2-4-10箱式电炉 江苏宜兴电炉厂 10.3试验部分 10.3.1理化性质考察 1)性状 取本品用目测观察、鼻闻进行试验，结果见1。 表1 咪达唑仑性状试验结果 批 号 性 状 白色结晶性粉末，无臭 20071101 白色结晶性粉末，无臭 20080301 白色结晶性粉末，无臭 20080302 白色结晶性粉末，无臭 20080303 2 参考原咪达唑仑标准(WS-(X-199)-2003Z)以及影响因素试验结果，遇1 光颜色逐渐变黄，故本品性状为白色至微黄色的结晶或结晶性粉末，无臭，遇光渐变黄。 2)溶解性 取咪达唑仑(批号:20071201)，研细，称取细粉适量，置25?2?环境一定容量的溶剂中，每隔5分钟强力振摇30秒钟，观察30分钟内的溶解情况，以在溶液中看不到溶质颗粒时，即认为完全溶解。结果见表2。 表2 咪达唑仑溶解度试验结果 溶 剂 样品量(g) 溶剂量(ml) 现 象 结 论 氯仿 0.9631 0.95 溶解 极易溶解 乙醇 0.2557 1.0 溶解 易溶 冰乙酸 0.2362 1.2 溶解 易溶 水 0.0112 10ml以上 不溶解 不溶 结果表明:本品在氯仿中极易溶解，在冰醋酸或乙醇中易溶，在水中几乎不溶。 3)熔点 取测定熔点用毛细管，将一端熔封，按中国药典2005年版二部附录? C熔点测定法项下规定的方法，取干燥失重项下样品，依法(中国药典2005年版二部附录? C)测定，结果见表3。 表3 咪达唑仑熔点试验结果 批 号 熔 点(?) 20071101 20080301 20080302 20080303 由试验发现，供试品初熔点约为160?，终熔点为164?，故本品的熔点为160~164?。 4)紫外吸收系数 分析方法:参考咪达唑仑转正标准WS-(X-199)-2003Z，取供试品适量，1 精密称定，加0.1mol/L盐酸溶液溶解，并稀释制成每1ml约含12,g的溶液，放置35分钟后，照分光光度法(中国药典2005年版二部附录IV A)，测定吸收度、 1%计算供试液的吸收系数E。 1cm 紫外分光光度计: 3 A、美国艾尔默公司，Lamdba 45型紫外分光光度仪; B、北京瑞利分析仪器公司，UV-9100紫外分光光度仪; C、安捷伦上海分析，6010型紫外分光光度仪; D、岛津公司，UV-265型紫外分光光度计; E、北京通用谱析分析仪器公司，TU1221型紫外分光光度仪。 2、供试品批号:20071201(纯度为99.77%)。 3、供试液制备:取供试品适量，精密称定，约12mg，加0.1mol/L盐酸溶液溶解，并稀释至1000ml，摇匀，制成每1ml约含12,g的溶液，放置35分钟后，照分光光度法(中国药典2005年版二部附录IV A)，测定吸收度、计算供 1%试液的吸收系数E，结果见表4。 1cm 1%表 4 咪达唑仑吸收系数测定结果( E=A/Cb) 1cm 最大波长1%仪器 样品浓度 吸收度(A) 吸收系数(E) 1cm(nm) 363 A 258 11.8 ,g/ml 0.4283 B C D E 平均值?RSD% 1%标准值 258nm, E358-380 1cm 10.3.2鉴别反应 1)紫外鉴别:取本品，精密称定，加0.1mol/L盐酸溶液制成每1ml约含12,g的溶液，放置35分钟后，照分光光度法(中国药典2005年版二部附录IV A)，在258nm的波长处有最大吸收。在240nm的波长处有最小吸收。三批供试品经检验，最大吸收波长分别为:258.5nm、258.5nm、258.5nm，最小吸收波长分别为239nm、239.5nm、239nm，见附图1,附图3。 4 2)红外分光光度法:分别取咪达唑仑供试样品，用溴化钾压片，照红外分光光度法(中国药典2005年版二部附录? C)项下方法，依法操作，三批供试样品红外光吸收谱图应与对照红外图谱一致，见附图4,附图6。 3)有机氟化物鉴别:取咪达唑仑供试样品适量，照氧瓶燃烧法(中国药典2005年版二部附录VII C)，依法操作，三批供试样品有机氟化物反应均为阳性。 10.3.3检查 1、干燥失重 取本品，照中国药典2005年版二部附录? L，置五氧化二磷干燥器中，减压干燥至恒重，结果见表5。 表 5 咪达唑仑干燥失重测定结果 批 号 20071101 20080301 20080302 20080303 空 瓶 (g) 加样量 (g) 恒 重 (g) 减失量 (g) 结 果(%) 结果表明，三批样品和对照品干燥失重均小于0.5%。 2、有关物质检查 2.1用薄层检测有关物质 2.1.1方法与条件:参考咪达唑仑试行标准(WS-77(X-64)-98),转正标准(WS-(X-199)-2003Z)以及咪达唑仑注射液试行标准(WS-77(X-64)-98(2))1 选用薄层进行研究。 2.1.2仪器与试药 咪达唑仑样品(批号:20071201); 50mmx100mm 硅胶GF254薄层板 青岛海洋化工厂分厂; 卄中间体I:7-氯-5-(2-氟苯基)-2-氨甲基-2、3-二氢-1H-1，4苯并二氮杂 ， 卓中间体II:8-氯-3a,4-二氢-6-(2-氟苯基)-1-甲基—3H-咪唑[1，5-a][1,4]苯并二 卄氮杂自制; 卓 醋酸乙酯、甲醇、冰乙酸均为分析纯试剂，重蒸水。 2.1.3方法学研究 供试品溶液制备: 5 (1)称取中间体I适量，加甲醇溶解并制成1.0mg/ml的溶液，作为中间体I供试溶液; (2)称取中间体II适量，加甲醇溶解并制成1.0mg/ml的溶液，作为中间体II供试溶液; (3)称取咪达唑仑适量，加甲醇溶解并制成1.0mg/ml的溶液，作为咪达唑仑供试溶液; (4)分别取中间体I、II和咪达唑仑供试溶液各1ml混合，作为混合供试溶液。 薄层分离效果考察: 参考原咪达唑仑标准，以醋酸乙酯:甲醇:冰乙酸:水=80:20:2:15为展开剂，照中国药典2005年版二部附录VB试验，取上述供试溶液各10μl，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，展开，晾干，置紫外光灯(254nm)下检视，结果见附图7。 试验结果表明:该展开剂条件能够很好的分离中间体I、II和咪达唑仑产物，故尝试用原标准的薄层条件来进行有关物质的检测。 薄层检测限度试验: 取咪达唑仑样品适量，用甲醇稀释制成含咪达唑仑10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml、80μg/ml、120μg/ml、160μg/ml的溶液，照中国药典2005年版二部附录VB试验，取上述溶液各10μl，分别点于硅胶GF254薄层板上，展开，晾干，置紫外光灯(254nm)下检视，结果见附图8、9。 试验结果表明:当溶液浓度为10μg/ml时在薄层板上基本无斑点出现，浓度为20μg/ml、30μg/ml时薄层上的斑点比较模糊，当浓度大于40μg/ml薄层上的斑点明显。故参考原标准用40μg/ml浓度的溶液作为对照溶液，用薄层进行有关物质检测。 有关物质检测: 供试品溶液制备:分别取咪达唑仑适量，加甲醇制成含咪达唑仑5.0mg/ml、10.0mg/ml、20.0mg/ml、40.0mg/ml的溶液，作为供试品溶液;用甲醇稀释制成每1ml含咪达唑仑40μg的溶液，作为对照溶液，照中国药典2005年版二部附录VB试验，取上述溶液各10μl，分别点于硅胶GF254薄层板上，展开，晾干，置紫外光灯(254nm)下检视，结果见附图10、11。 6 试验结果表明:由于20.0mg/ml、40.0mg/ml浓度过大，主斑点有重叠现象，但在5.0mg/ml、10.0mg/ml、20.0mg/ml、40.0mg/ml浓度下，均未发现除主斑点以外的任何杂质斑点。 根据以上所有薄层检测结果表明，该展开剂条件虽然能够很好的分离各步中间体和产物，但可能产物中杂质的量相对较小，对于该产物中的杂质可能薄层检测并不是很灵敏，未检测到杂质斑点，故参考国外药典用液相进行有关物质方法学研究。 2.2用液相方法进行有关物质检测 2.2.1方法与条件:参考咪达唑仑标准(WS-(X-199)-2003Z)及英国药典1 质量标准(英国药典2007版 Ph Eur monograph 0936)方法进行研究。 色谱柱:八烷基硅烷键合硅胶柱150×4.6mm，5μm，检测波长:254nm，进样量:10μl。 2.2.2仪器与试药 仪器: Shimadzu LC-10ATvp液相色谱仪、SPD-10Avp紫外检测器; ODS色谱柱:150×4.6mm，5μm。 咪达唑仑样品(批号:20071201);醋酸铵(分析纯)、40%四丁基氢氧化铵溶液，冰醋酸(分析纯)、甲醇(色谱纯)、重蒸水。 2.2.3方法学研究 ?供试品溶液制备:称取供试品适量，加甲醇溶解并制成1.0mg/ml的溶液，作为供试溶液。 ?系统条件筛选 试验?——紫外检测波长的选择 取咪达唑仑样品适量，分别用甲醇、0.1mol/l盐酸、0.1mol/l氢氧化钠溶液制成约含咪达唑仑10ug/ml溶液，放置35分钟后，在200nm~400nm波长范围内扫描，结果表明，样品在甲醇中218nm、239nm波长处有较大吸收，在盐酸溶液中212nm、258nm波长处有较大吸收，在氢氧化钠溶液中219nm、240nm波长处有较大吸收。见附图12,附图14。参考咪达唑仑(WS-(X-199)-2003Z)标准及英国药典(英国药典2007版 Ph Eur 1 monograph 0936)质量标准，综合考虑杂质等原因，我们选用254nm作为检测波长，用甲醇来稀释样品，进行方法学研究。 试验?——流动相比例变化对分离效果的考察 以纯甲醇、甲醇-水为流动 7 相，甲醇-水配比分别为80:20、60?40，按上述条件，取上述供试液10ul注入液相色谱仪，记录色谱图，结果见表7。结果表明，用甲醇及甲醇-水体系作为流动相，很难将主峰与杂质峰分离，见附图15,附图17。改用以甲醇-醋酸铵缓冲溶液(取醋酸铵7.7g，40%四丁基氢氧化铵溶液10ml，加水稀释制成1000ml，用冰乙酸调pH至5.3)(60:40)为流动相，取上述供试液10ul注入液相色谱仪，记录色谱图，结果见表7。结果表明，色谱图中主峰与杂质峰的分离效果较好，主峰保留时间分别为13.265分钟，见附图18，但由于样品是用甲醇稀释，考虑到甲醇对色谱图的影响，取甲醇10ul注入液相色谱仪，记录色谱图，进行对比，见附图19。除去溶剂对色谱图的影响，该流动相分离效果好，主峰保留时间分别为13.343分钟，主峰理论板数大于2000、拖尾因子小于2.0、与杂质峰的分离度均大于1.5，各项指标都能达到药典要求，见附图20。 表 7 不同流动相及比例对分离效果的影响 流动相 主峰时间min 分离效果 2.148 纯甲醇 出峰时间太短，拖尾，达不到分离效果 3.815 甲醇-水 80:20 出峰时间太短，拖尾，达不到分离效果 24.665 甲醇-水 60:40 出峰时间较长，严重拖尾，无法分离 13.343 甲醇-缓冲液 60:40 出峰时间较为合适，能够达到分离要求 根据以上试验结果选用甲醇-醋酸铵缓冲溶液(取醋酸铵7.7g，40%四丁基氢氧化铵溶液10ml，加水稀释制成1000ml，用冰乙酸调pH至5.3)(60:40)为流动相，254nm为检测波长进行研究。 试验?——流速变化对分离效果的考察 以甲醇-醋酸铵缓冲溶液(取醋酸铵7.7g，40%四丁基氢氧化铵溶液10ml，加水稀释制成1000ml，用冰乙酸调pH至5.3)(60:40)为流动相，调节流速分别为0.8ml/min、1.0ml/min、1.2ml/min，按上述条件，取上述供试液10ul注入液相色谱仪，记录色谱图，并考察各色谱图中主峰与杂质峰的分离度与拖尾因子。结果表明，各色谱图中主峰保留时间分别为17.058分钟、13.628分钟、11.183分钟，主峰理论板数均大于2000、拖尾因子均在小于1.5、与杂质峰的分离度均大于1.5，见附图21、附图22、附图23。 试验?——柱温变化对分离效果的考察 以甲醇-醋酸铵缓冲溶液(取醋酸铵7.7g，40%四丁基氢氧化铵溶液10ml，加水稀释制成1000ml，用冰乙酸调pH 8 至5.3)(60:40)为流动相，调节柱温分别为35?、45?，按上述条件，取上述供试液10ul注入液相色谱仪，记录色谱图，并考察各色谱图中主峰与杂质峰的分离度与拖尾因子。结果表明，各色谱图中主峰保留时间分别为13.513分钟、12.908分钟，主峰理论板数均大于2000、拖尾因子均在小于1.5、与杂质峰的分离度均大于1.5，见附图24、附图25。 以上试验结果表明，该色谱条件适合于本品的杂质分离。 ?方法专属性考察(咪达唑仑与降解产物的分离情况) 降解前供试品色谱图 取供试品，按上述条件制备溶液，依法测定，结果见附图26，主峰保留时间为13.038分钟，纯度为99.77,(面积归一化法)，主峰理论板数8147、拖尾因子1.107、与杂质峰的分离度3.825。 酸降解试验 取本品约10mg，置10ml量瓶中，加0.5mol/L盐酸溶液0.5ml，80?水浴30min，取出中和，加甲醇稀释至刻度，摇匀，取10μl注入液相色谱仪，记录色谱图(附图27)，由图可知，咪达唑仑的保留时间为12.917分钟，在酸性破坏条件下，3.518min有明显降解杂质峰(74.13%)出现。结果表明，咪达唑仑在强酸破坏环境下不稳定，但产生的杂质峰与主峰分离良好，与其结构中含有酸不稳定基团(亚胺)相符合。 碱降解试验 取本品约10mg，置10ml量瓶中，加0.5mol/L氢氧化钠溶液0.5ml，在80?水浴30min，取出中和，加甲醇稀释至刻度，摇匀，取10μl注入液相色谱仪，记录色谱图(附图28)，由图可知，主峰保留时间为12.958分钟，3.625分钟有新杂质生成(0.04%)，5.593分钟和15.992分钟的杂质峰基本没有变化。结果表明，咪达唑仑在强碱破坏环境下相对稳定些，但也有降解产物产生。 氧化降解试验 取本品约10mg，置10ml量瓶中，加30,HO溶液5滴，22室温放置5h，加甲醇稀释至刻度，取10μl注入液相色谱仪，记录色谱图(附图29)。由色谱图可知，主峰保留时间为12.972分钟，5.665分钟的杂质峰有所增加(由原来的0.09%增加至0.12%)，其它无明显变化，本品在强氧化剂条件下有轻微的降解现象。 高温破坏试验 取本品约10mg，置10ml量瓶中，置120?烘箱中放置1小时，取出，加甲醇溶解并稀释至刻度，取10μl注入液相色谱仪，记录色谱图(附图30)，由色谱图可知，主峰保留时间为12.808分钟，其他无明显变化，表 9 明本品在短时间高温条件下无明显降解现象。 光照破坏试验 取本品适量，置日光下，放置5小时(未见色泽变化)，取样，加甲醇溶解并稀释制成1.0mg/ml溶液，取10μl注入液相色谱仪，记录色谱图(附图31)，由图可知，主峰保留时间为13.132分钟，其他无明显变化，表明本品在短时间强光条件下相对比较稳定，且未见有降解杂质峰生产。 ?咪达唑仑各中间体的分离情况及杂质归属 本品合成工艺最后两步中间体名称及结构式如下: 卄中间体I:7-氯-5-(2-氟苯基)-2-氨甲基-2、3-二氢-1H-1，4苯并二氮杂 卓中间体II:8-氯-3a,4-二氢-6-(2-氟苯基)-1-甲基—3H-咪唑[1，5-a][1,4]苯并二 NNH 卄2HC3氮杂 卓 HNN NN ClClFF 中间体I 中间体II 取上述中间体适量，分别加甲醇制成约1mg/ml溶液，取10ul注入液相色谱仪，记录色谱图。考察各中间体的峰位归属，结果见表8。 表8 咪达唑仑与中间体的分离情况 品名 浓度mg/ml 色谱图 主峰Rt(min) 中间体I 1.03 附图32 5.832 中间体II 1.07 附图33 3.388 ?液相色谱图终点时间的确定 综合上述试验结果，供试品试验图谱及其降解试验图谱显示，最后一个杂质峰的保留时间均小于主峰保留时间的2.5倍，并参考国外药典标准，记录色谱图 时间定为主峰保留时间的2.5倍。 2.2.4最低检测限试验 取样品约10mg，精密称定，加甲醇溶解并分步逐级稀释成0.1ug/ml(万分之一浓度)。精密量取该溶液适量，注入液相色谱仪，照上述方法，依法测定。 10 结果表明，当进样量为2μl时，主成分响应值(峰高)为噪音高度的3倍(见附图34、附图35)。本品最低检测限为0.2ng(0.1ug/ml×2μl)。 2.2.5最低定量限试验 取上述供试液，进样量为5μl时，主峰峰高为噪音峰高的10倍，为最低定量限，见附图36。 照上述方法，配制0.1μg/ml溶液6份，同法测定，结果见表9，平均值为611.8，RSD%为2.01%。 表9 咪达唑仑最低定量限试验结果 — No. S1 S2 S3 S4 S5 S6 RSD% X峰面积 605.3 628.8 593.2 608.4 618.5 616.8 611.8 2.01 2.2.6溶液日内稳定性试验 取样品溶液(约1.0mg/ml)，照上述方法，取10μl进样，并记录色谱图，每隔2h重复进样1次，结果见附图37~附图42及表10。未检出降解新杂质，由于杂质含量均很低，导致相对标准偏差RSD偏大，但10小时结果与0小时基本一致，无明显变化趋势。主峰含量的相对标准偏差RSD为0.002,，结果表明，供试品溶液在10小时内稳定性良好。 表10 咪达唑仑溶液日内稳定性试验结果 杂质经时变化趋势数据(归一化含量) 杂质 平均值 RSD% 0小时 2小时 4小时 6小时 8小时 10小时 降解杂质 无 无 无 无 无 无 / / 杂质I 0.0961 0.0948 0.0952 0.0952 0.0951 0.0957 0.0954 0.49 出峰时间 5.745 5.738 5.735 5.708 5.702 5.698 主峰含量 99.763 99.764 99.763 99.765 99.766 99.766 99.764 0.002 出峰时间 13.192 13.168 13.145 13.067 13.052 13.033 杂质II 0.119 0.122 0.122 0.113 0.118 0.120 0.119 2.81 出峰时间 16.637 16.608 16.585 16.477 16.440 16.423 总杂质 0.237 0.236 0.237 0.235 0.234 0.234 结论，本品的甲醇溶液中在10小时内基本稳定，总杂质无明显变化(RSD为0.83%)。 11 2.2.7日间稳定性试验 取上述供试品溶液，分别于24小时、48小时……，依法试验，考察溶液杂质量的变化。结果见附图43~附图47及表11。由于杂质含量均很低，导致相对标准偏差RSD偏大，但120小时(5天)结果与0小时比较，基本一致，无明显变化趋势。主峰含量的相对标准偏差RSD为0.006,，结果表明，供试品溶液日间稳定性较好，基本上无变化。 表11 咪达唑仑溶液日间稳定性试验结果 杂质经时变化趋势数据(归一化含量) 杂质 平均值 RSD% 0小时 24小时 48小时 72小时 96小时 120小时 降解杂质 无 无 无 无 无 无 / / 5.745 5.698 5.462 5.698 5.858 5.728 杂质? 0.0961 0.0951 0.0949 0.0955 0.0952 0.0948 0.0953 0.50 13.192 13.052 12.518 13.028 13.565 13.228 主峰 99.763 99.760 99.774 99.760 99.770 99.765 99.765 0.006 16.637 16.412 15.772 16.442 17.138 16.722 杂质? 0.119 0.124 0.110 0.126 0.114 0.121 0.119 5.1 2.2.8咪达唑仑纯度(有关物质)检查 本品采用自身稀释对照法检测有关物质含量。取本品适量，加甲醇溶解并稀释制成每1ml中约含咪达唑仑1.0mg的溶液，作为供试品溶液;精密量取适量，加甲醇制成每1ml中含5.0,g的溶液，作为对照溶液。。取供试品溶液和对照溶液各10,l，照高效液相色谱法(中国药典2005年版二部附录V D)，依法检测。供试品溶液色谱图中如有杂质峰，各杂质峰面积的和不得大于对照溶液的主峰面积(0.5%)。 据上述试验结果对三批咪达唑仑供试样品和对照品进行检验，并记录色谱图(分别见附图48至附图57)，结果见表12。 表12 三批供试样品和对照品有关物质测定结果 批号 20071101 20071201 20080301 20080302 20080303 杂质峰面积和 30518 85.4 117.3 100.8 0.5%对照主峰面积 61278 112.7 126.9 120.7 12 有关物质(%) 0.249 0.379 0.462 0.417 由表中可知，供试样品有关物质可控制在0.50%以内。 3、炽灼残渣 标准规定:取供试品1.0g，依法检查(中国药典2005年版二部附录V?N)， 遗留残渣不得过0.1,。 取供试品1.0g，按中国药典2005年版二部附录V? N炽灼残渣检查法，依 法操作，温度为500~600?，结果见表13。 表13 咪达唑仑三批样品和对照品炽灼残渣测定结果 批 号 20071101 20080301 20080302 20080303 空 瓶 35.1891 35.2570 35.1890 35.2571 35.2571 35.1891 加样量 1.2348 1.1154 1.2181 1.2315 1.2158 1.1376 恒 重 35.1895 35.2576 35.1898 35.2581 35.2576 35.1895 残渣重量 0.0004 0.0006 0.0008 0.0010 0.0005 0.0004 结 果 0.03% 0.05% 0.07% 0.08% 0.04% 0.04% 平均值 0.04% 0.08% 0.04% 结果表明，三批样品及对照品经检查，炽灼残渣不大于0.10%。 4、重金属检查 标准规定:取炽灼残渣项下遗留的残渣，依法检查(中国药典2005年版二 部附录? H第二法)，含重金属不得过20ppm。 取供试品约1.0g，照中国药典2005年版部附录V?H第二法，依法操作， 分别与标准铅溶液比较，结果见表14。 表14 咪达唑仑三批供试样品和对照品重金属测定结果 样品批号 测定结果 20071101 <20ppm 20080301 <20ppm 20080302 <20ppm 20080303 <20ppm 结果表明，三批样品和对照品重金属含量均小于百万分之二十。 5、硫酸盐 取本品0.5g，加水40ml，振摇，加稀盐酸2ml，充分振摇溶解， 13 照中国药典2005年版二部附录V? B方法，与标准硫酸钾溶液1.0ml制成的对照液比较，结果均小于0.02,，见表15。 表15 咪达唑仑三批供试样品硫酸盐检查结果 样品批号 结果 结论 20071101 供试液几乎无色 小于0.02, 20080301 供试液几乎无色 小于0.02, 20080302 供试液几乎无色 小于0.02, 20080303 供试液几乎无色 小于0.02, 6、残留溶剂检查 咪达唑仑在生产过程中使用的有机溶剂为乙醇、二氯甲烷、乙酸乙酯、甲苯， 本法用以检查其在生产过程中引入的有害有机溶剂残留量。采用顶空进样法，检测器用氢火焰离子化检测器。 由于二氯甲烷电负性大，如采用ECD检测器响应值会提高，但为了用FID检测器能同时测定这四种溶剂，必须用合适的溶剂和最佳的色谱系统来提高灵敏度，本法研究资料如下: 6.1仪器:岛津GC-2010气相色谱仪、氢火焰离子化检测器、色谱柱HP-1(30m×0.25mm×0.25μm)和HP-5(30m×0.53mm×5μm)(美国Agilent公司生产)、METTLER AB204-S电子天平 6.2 试剂 : 无水乙醇:光学纯，天津市大茂化学试剂厂 二氯甲烷:色谱纯，天津市四友生物医学技术有限公司 乙酸乙酯:分析纯，上海化学试剂采购供应五联化工厂 甲苯:分析纯，杭州市北大桥化工区 二甲基亚砜:色谱纯，美国Tieda公司 6.3 对照品溶液的制备 限度规定:按照2005年版中国药典二部残留溶剂限度规定，本品中含残留溶剂限量分别为:乙醇0.5%, 二氯甲烷0.06%，乙酸乙酯0.5%，甲苯0.089%。根据限度规定拟定下述对照品的取样量与配制方法。 对照品溶液的制备:精密称取乙醇、二氯甲烷、乙酸乙酯、甲苯各2.5050g、 14 0.3142g、2.5142g、0.4436g，分置100ml量瓶中，加二甲基亚砜稀释至刻度，摇匀，得对照品储备液。 分别量取对照品储备液各2ml，置同一100ml量瓶中，加二甲基亚砜稀释至刻度，摇匀，得对照品溶液，即对照品混合溶液。精密量取5ml，置10ml顶空进样瓶中，压盖，作为对照品溶液。 6.4 供试品溶液的制备 溶剂选择:本品在二甲基亚砜中溶解度好，且与对照品溶液所用溶剂相同，可以消除基质效应.所以选择二甲基亚砜作为样品溶剂。 供试品溶液的制备:根据有机残留限度规定，确定本品的取样量为0.5g,置10ml顶空进样瓶中，以5ml溶剂溶解，压盖，作为供试品溶液。 6.5 色谱条件选择 色谱柱选择:所测定的有机溶剂为弱极性和非极性(乙醇除外)，根据相似相容原则，选择非极性毛细管色谱柱以满足分离。用HP-1和HP-5色谱柱进行试验，以HP-5弱极性色谱柱更为理想，结果见附图58、59。 色谱条件选择:进样温度250?，分流进样，以高纯氮气作为载气，柱流速2ml/min。检测温度250?。初始温度60?，保持13min，以30?/min的速率升至130?，保持6min，再以60?/min的速率升至200?，保持5min,使色谱柱中的溶剂完全出峰，整个程序运行27.5分钟。 顶空进样条件选择: 平衡温度: 固定顶空平衡时间为20min，传输管温度115?，进样环温度120?。选择平衡温度分别为90?，100?，110?，见附图60、61和62。结果显示，110?对照品峰面积最大，但从100?开始溶剂即二甲基亚砜峰面积百分比急剧增加，说明溶剂已经蒸发开始增大，影响测定。故选择90?作为平衡温度。 平衡时间: 固定顶空平衡温度为90?，选择平衡时间分别为30min，40min(平衡温度90?，时间20min在平衡温度选择时已有)，见附图63、64。结果显示,平衡温度升高对结果影响不大,说明20分钟时气相和液相之间已经分配平衡，气相的浓度能反映瓶中液体的浓度。 15 系统适用性试验:取顶空平衡时间为20min，平衡温度为90?进样的图谱作为系统适用性试验图谱。测得乙醇、二氯甲烷、乙酸乙酯、甲苯理论板数分别为26688, 24951, 21246和143998，分离度均大于1.5，符合药典规定。 6.6 方法学研究 专属性试验:精密吸取二甲基亚砜溶剂、乙醇、二氯甲烷、乙酸乙酯、甲苯储备液和混合对照品5ml，照正文测定，结果显示，溶剂无干扰，见附图65-70。 重复性试验:精密吸取对照品溶液6份，分别置顶空瓶中，照系统适用性试验方法，进样测定，记录色谱图，见附图71，结果见表16，试验结果表明方法重现性符合规定。 表 16 有机残留重复性试验结果 溶剂名称 1 2 3 4 5 6 RSD% 630864.2 639441.1 628168.6 640092.6 617942.4 639814.0 1.40 乙醇 71175.2 71902.6 70879.4 71298.4 70398.0 71557.6 0.74 二氯甲烷 2307581 2337707 2310273 2315934 2296619 2321760 0.60 乙酸乙酯 519423.7 524471.7 518903.5 523144.2 516294.8 524525.2 0.65 甲苯 检测限测定:通过不断稀释逐级降低浓度，按上述色谱条件进样测定，当信噪比为3:1时，稀释浓度分别为乙醇0.0501μg/ml、乙酸乙酯0.02514μg/ml、三氯甲烷0.3142μg/ml、甲苯为0.02726μg/ml，故最小检测浓度乙醇0.0501 、乙酸乙酯0.02514μg/ml、三氯甲烷0.3142μg/ml、甲苯为0.02726μμg/ml g/ml，见附图72-75。 线性关系:分别量取乙醇、二氯甲烷、乙酸乙酯、甲苯对照品储备液1.0ml，1.6ml，2.0ml，2.4ml，3.0ml分置5个100ml量瓶中，制成对照品溶液浓度的50%，80%，100%，120%，150%的溶液，按上述色谱条件进样，见附图76-80。结果见表17，试验结果表明方法线性关系符合规定。 表17 有机残留中各溶剂的线性关系试验结果 名称 1 2 3 4 5 斜率 截距 相关系数 570175.7 894777.4 1167584 1360444 1740997 1169903 -31685.2 0.9992 乙醇 58082.2 82463.8 121349.2 143296.2 182416.6 123948.2 -5671.75 0.9998 二氯甲烷 2012391 2845998 4209592 4916968 6250819 4225356 -208639 0.9996 乙酸乙酯 442944.1 634183.6 938823.5 1102883 1408194 960966.9 -56678.6 0.9999 甲苯 16 有机残留的含量测定: 对照品溶液:精密量取对照品混合液5ml置10ml顶空瓶中，压盖，作为对照品溶液。 供试品溶液:精密称取咪达唑仑约0.5g,分置10ml顶空瓶中，加二甲基亚砜5ml，压盖，作为供试品溶液。 测定法:分别取对照品溶液和供试品溶液，按上述色谱条件进样，见附图81、82。结果见表18。 表 18 样品(批号20071101)有机残留测定结果 溶剂 样品质量(g) 样品峰面积 对照品峰面积 对照品浓度(mg/ml) 含量(%) 0.5002 2053.7 1162725 乙醇 0.501 0.00017 0.5025 1919 1148539 0.5002 1072.9 121808.2 二氯甲烷 0.06284 0.00013 0.5025 1391.1 121259.9 0.5002 91616.2 4281706 乙酸乙酯 0.50284 0.00013 0.5025 97017.2 4247422 0.5002 363 933081.9 甲苯 0.08872 7.9E-06 0.5025 471.8 929302.1 计算:含量=样品峰面积,对照品浓度/(对照品峰面积,样品质量),100% 回收率测定 对照储备溶液:精密称取二氯甲烷0.3142g、甲苯0.4105g、乙醇2.5050g、乙酸乙酯2.5142g，分别置于100ml量瓶中，加二甲基亚砜稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液。分别精密量取二氯甲烷、甲苯、乙醇、乙酸乙酯对照品储备液1.6ml，2.0ml，2.4ml，分置100ml量瓶中，加二甲基亚砜至刻度，摇匀，即得80%，100%，120%的对照储备溶液。 对照品溶液:精密量取对照品混合液5ml置10ml顶空瓶中，压盖，作为对照品溶液。 供试品溶液:精密称取9份约0.5g的咪达唑仑分置9个10ml顶空瓶中，取三份80%，100%，120%的对照储备溶液各5ml，分别加样品顶空瓶中，压盖，作为供试品溶液。 17 测定法:对照品溶液和9份供试品进样，记录峰色谱图，见附图83-88,计 算回收率，结果见表19-22。 表 19 有机残留二氯甲烷回收率测定结果 样品取 样品中二甲二氯甲烷加二氯甲烷测回收率% 平均回 RSD% 样量g 烷含量(ug) 入量(ug) 得量(ug) 收率% 0.0642 0.5055 251.4 239.3 95.21 0.0644 251.4 243.2 0.5067 96.76 0.0639 251.4 242.7 0.5020 96.56 0.5013 0.0637 314.2 308.8 98.30 0.0642 314.2 313.6 98.18 2.0 0.5056 99.83 0.0635 314.2 318.6 0.5001 101.42 0.5014 0.0637 377.0 368.2 97.68 0.0638 377.0 368.0 0.5025 97.63 0.0638 377.0 377.9 0.5018 100.26 表 20 有机残留乙醇回收率测定结果 样品取 样品中乙醇乙醇加入量乙醇测得量平均回收率% RSD% 回收率% 样量g 含量(ug) (ug) (ug) 0.0868 0.5055 2004 2003.6 104.51 0.0870 2004 0.5067 1996.7 104.16 0.0862 2004 0.5020 1975.9 103.03 0.5013 0.0861 2505 2543.2 105.14 0.0868 2505 104.58 1.0 0.5056 2557.4 105.76 0.0859 2505 0.5001 2560.3 105.84 0.5014 0.0861 3006 3046.2 104.33 0.0863 3006 0.5025 3010.8 103.12 0.0862 3006 0.5018 3076.5 105.37 18 表 21 有机残留乙酸乙酯回收率测定结果 样品取 样品中乙酸乙酸乙酯加乙酸乙酯测回收率% 平均回 RSD% 样量g 乙酯含量入量(ug) 得量(ug) 收率% (ug) 0.0642 0.5055 2011.2 2013 100.10 0.0644 2011.2 0.5067 2028.8 100.88 0.0638 2011.2 0.5020 2006.1 99.75 0.5013 0.0637 2514 2524.8 100.43 0.0642 2514 100.23 1.8 0.5056 2563.8 101.98 0.0635 2514 0.5001 2596.3 103.28 0.5014 0.0637 3016.8 2958.3 98.06 0.0638 3016.8 0.5025 2944.8 97.62 0.0638 3016.8 0.5018 3017.4 100.02 表 22 有机残留甲苯回收率测定结果 样品取 样品中甲苯甲苯加入量甲苯测得量回收率% 平均回收率% RSD% 样量g 含量(ug) (ug) (ug) 0.00112 0.5055 328.4 321.84 98.00 0.00112 328.4 319.60 0.5067 97.32 0.00111 328.4 317.38 0.5020 96.64 0.5013 0.00111 410.5 416.51 101.46 0.00112 410.5 415.37 99.59 2.0 0.5056 101.19 0.00111 410.5 418.87 0.5001 102.04 0.5014 0.00111 492.6 495.25 100.54 0.00112 492.6 484.41 0.5025 98.34 0.00111 492.6 496.63 0.5018 100.82 19 结果显示，乙醇、二氯甲烷、乙酸乙酯、甲苯回收率均符合规定。 三批样品中有机残留的含量测定: 对照品溶液:精密量取对照品混合液5ml置10ml顶空瓶中，压盖，作为对照品溶液。 供试品溶液:精密称取咪达唑仑约0.5g,分置10ml顶空瓶中，加二甲基亚砜5ml，压盖，作为供试品溶液。 测定法:分别取对照品溶液和供试品溶液，按上述色谱条件进样，见附图92。结果见表22-25。 89- 表 23 样品(批号20080301)有机残留测定结果 溶剂 样品质量(g) 样品峰面积 对照品峰面积 对照品浓度(mg/ml) 含量(%) 乙醇 二氯甲烷 乙酸乙酯 甲苯 计算公式:含量=样品峰面积,对照品浓度/(对照品峰面积,样品质量),100% 表 24 样品(批号20080302)有机残留测定结果 溶剂 样品质量(g) 样品峰面积 对照品峰面积 对照品浓度(mg/ml) 含量(%) 乙醇 二氯甲烷 乙酸乙酯 甲苯 20 计算公式:含量=样品峰面积,对照品浓度/(对照品峰面积,样品质量),100% 表 25 样品(批号20080303)有机残留测定结果 溶剂 样品质量(g) 样品峰面积 对照品峰面积 对照品浓度(mg/ml) 含量(%) 乙醇 二氯甲烷 乙酸乙酯 甲苯 计算公式:含量=样品峰面积,对照品浓度/(对照品峰面积,样品质量),100% 根据以上试验测定结果:咪达唑仑三批样品(20080301、20080301、20080301)和对照品(20071101)中的乙醇、二氯甲烷、乙酸乙酯、甲苯残留量均符合规定。 10.3.4含量测定 参考咪达唑仑的中华人民共和国新药转正标准WS-(X-199)-2003Z，我们1 仍选用容量法对本品的含量进行测定。 1、咪达唑仑供试样品(批号:20071201、20080301、20080302、20080303);咪达唑仑对照品(批号:20071101)。 2、测定法 取本品约0.12g，精密称定，加冰醋酸30ml溶解后，加醋酐20ml，照电位滴定法(中国药典2005年版二部附录VIII A)，用高氯酸滴定液(0.1mol/L)滴定,并将滴定的结果用空白试验校正。每1ml高氯酸滴定液(0.1mol/L)相当于16.29mg的CHClFN。 18133 3、精密度试验 取供试品一批(批号:20071201)，6份，依法测定，考察 21 测定值精密度，结果见表26。 表26 一批咪达唑仑的含量测定结果 — No. S1 S2 S3 S4 S5 S6 RSD% X含量(%) 99.41 100.44 100.13 99.24 99.48 100.28 99.83 0.51 4、含量测定 取供试品三批和对照品，依法测定其含量，结果见表27。 表27 三批咪达唑仑的含量测定结果 样品批号 20071101 20080301 20080302 20080303 I(%) 99.85 99.74 99.88 II(%) 99.86 99.70 99.82 平均值(%) 99.86 99.72 99.85 根据表中实测结果，同时考虑到滴定测定的误差，将含量测定限度定为98.5-101.5%。 参考文献 1(中国药典2005年版二部 2(新药(西药)临床前研究指导原则 22