硫酸软骨素提取及质量分析.doc

硫酸软骨素提取及质量分析.doc 人工养殖鲟鱼头软骨提取硫酸软骨素质量分析 目 录 摘要 ................................................................................................................................................I Abstract ........................................................................................................................................ II 1文献综述 .................................................................................................................................... 1 1.1硫酸软骨素的来源及分布 .................................................................................................... 1 1.2硫酸软骨素的理化性质 ........................................................................................................ 2 1.2.1物理性质 ............................................................................................................................ 2 1.2.2化学性质 ............................................................................................................................ 2 1.3硫酸软骨素的功能及应用 .................................................................................................... 4 1.4 分离提纯原理及 ....................................................................................................... 7 1.4.1制备原理 ............................................................................................................................ 7 1.4.2提取方法 ............................................................................................................................ 7 1.5.测量各项指标方法 ............................................................................................................... 8 1.6. 本文行业背景和研究内容 ................................................................................................. 9 1.6.1行业背景 ............................................................................................................................ 9 1.6.2研究内容 .......................................................................................................................... 10 引言 ............................................................................................................................................. 11 2实验方法 .................................................................................................................................. 12 2.1实验试剂及仪器 .................................................................................................................. 12 2.1.1实验 .......................................................................................................................... 12 2.1.2实验材料及试剂 .............................................................................................................. 12 2.1.3实验仪器与设备 .............................................................................................................. 13 2.2硫酸软骨素提取方法 .......................................................................................................... 13 2.3 硫酸软骨素各项指标测定方法 ......................................................................................... 14 2.3.1葡萄糖醛酸含量测定方法 .............................................................................................. 14 2.3.2样品纯度测定方法 .......................................................................................................... 14 2.3.3蛋白质的标定方法 .......................................................................................................... 14 2.3.3 脂肪含量测定方法 ......................................................................................................... 15 2.3.4 水分含量测定方法 ......................................................................................................... 15 2.3.5 pH测定方法 .................................................................................................................... 15 3结果与讨论 .............................................................................................................................. 16 3.1 硫酸软骨素中葡萄糖醛酸含量分析 ............................................................................... 16 3.2硫酸软骨素纯度分析 .......................................................................................................... 17 3.3硫酸软骨素中蛋白质含量分析 .......................................................................................... 18 3.4脂肪含量测定结果及分析 .................................................................................................. 19 3.5水分含量、pH值的测定结果及分析 ................................................................................. 20 3.6硫酸软骨素提取率测结果和外观性状分析 ...................................................................... 21 3.7硫酸软骨素光谱分析 .......................................................................................................... 22 4结论与展望 .............................................................................................................................. 24 4.1结论 ...................................................................................................................................... 24 4.2展望 ...................................................................................................................................... 25 参考文献 ..................................................................................................................................... 26 致 谢 ........................................................................................................................................... 28 III 人工养殖鲟鱼头软骨提取硫酸软骨素质量分析 摘要 硫酸软骨素作为动物蛋白聚糖的代表物质，主要存在于动物的喉骨鼻软骨气管等结缔组织中。硫酸软骨素在医药上应用广泛。硫酸软骨素临床上主要用于治疗神经痛、关节炎、冠心病以及促进溃疡愈合和防止高血脂症等。随着生理功能及生化性质的深入研究，发现硫酸软骨素还可与某些物质调制成化妆品用于保护皮肤的健美，作为膳食添加剂用于辅助治疗。因此硫酸软骨素具有很高的经济价值。 硫酸软骨素的原料大多来自鲨鱼软骨或牛羊鸡鸭等畜禽动物软骨，鲨鱼软骨随着捕捞过度难以取得，畜禽动物软骨在原料中处理复杂从而增加成本。我国鲟鱼养殖技术日益成熟，鲟鱼养殖规模大，而鲟鱼头骨中富含硫酸软骨素，且鲟鱼头是鲟鱼加工中下脚料，成本低，是提取硫酸软骨素最佳原料。 本文主要对酶法提取鲟鱼头软骨中硫酸软骨素的纯度、葡萄糖醛酸含量、蛋白含量、脂肪含量、水分含量、pH值、提取率进行分析讨论，为工业成产提供依据。 关键词:鲟鱼软骨 硫酸软骨素 质量分析 葡萄糖醛酸 纯度 蛋白质 I 人工养殖鲟鱼头软骨提取硫酸软骨素质量分析 Abstract Chondroitin sulfate as a representative of animal material proteoglycan , exist in animals nasal cartilage and other connective tissue in the trachea. Chondroitin sulfate is widely used in medicine. CS for the treatment of clinical neuralgia、 arthritis、coronary heart disease and the promotion of ulcer healing and prevent hyperlipidemia. With the physiological functions and biochemical properties were studied deeply, and found chondroitin sulfate has made some material used to protect skin tone of cosmetics, as dietary supplements for adjuvant therapy. Therefore chondroitin sulfate with high economic value. CS raw materials mostly from shark cartilage or sheep poultry and other livestock animal cartilage, shark cartilage is difficult to get along with overfishing, livestock animal cartilage complex in order to increase raw material costs. Chinese sturgeon fish culture techniques become more sophisticated, large-scale breeding of sturgeon, the sturgeon fish skull rich in chondroitin sulfate, and the head is the sturgeon fish sturgeon scrap processing, low cost, is the best extraction of chondroitin sulfate raw materials. In this paper, the head of the enzymatic extraction of sturgeon cartilage in the purity of chondroitin sulfate and glucuronic acid content, protein content, fat content, moisture content, pH, extraction rates are discussed, provide the basis for the industry into production. Keywords: Sturgeon cartilage Chondroitin sulfate Quality Analysis Glucuronic acid Purity of chondroitin sulfate Protein II 人工养殖鲟鱼头骨中硫酸软骨素的指标分析 1文献综述 1.1硫酸软骨素的来源及分布 硫酸软骨素是来自动物软骨组织的一类天然的酸性粘多糖---糖胺聚糖。 糖胺聚糖(glycosamino glycan)GAG ，蛋白聚糖分子中重复双糖链是相应蛋白聚糖整体分子结构中的含糖片段。除了通过共价键与蛋白聚糖的核心蛋白连接外，糖胺聚糖还通过静电作用或立体化学效应与其他蛋白质发生专一性程度不 同的结合。 因为糖胺聚糖具有粘稠性，所以蛋白聚糖也被称为粘蛋白。粘多糖蛋白质复合物和软骨中粘蛋白等糖胺聚糖多由两种氨基已糖(氨基葡萄糖和氨基半乳糖)之一和两种己糖醛酸(葡萄糖醛酸和艾杜糖醛酸)之一以各种糖苷键连接而成。 除透明质酸外，糖胺聚糖分子中的氨基已糖上均含有硫酸基，该硫酸基与己糖醛酸上的羧酸都会导致整个蛋白聚糖分子显酸性，所以糖胺聚糖又被称为酸性粘多糖。 糖胺聚糖主要存在于动物软骨等结缔组织中，构成机体组织间质。这些多糖均具有生物活性或生理功能。有些是人体固有或在结构上与人体物质非常相近，能够参与影响和调控人体代谢和生理功能。 表1-1 各种硫酸软骨素来源表 Table1-1 The sources of CS table 名称 来源 透明质酸 关节液 ，软骨结缔组织，皮肤，体液，角膜，雄鸡冠 硫酸软骨素 A 骨 ，软骨，角膜，皮肤血管 硫酸软骨素 B 皮肤 ，心瓣膜，猪胃黏膜，脐带，韧带，动脉 硫酸软骨素 C 皮肤 ，心瓣膜，猪胃黏膜，动脉 硫酸角质素 角膜 ，主动脉，软骨，髓核 肝素 肝 ，肺脾，肌肉，动脉壁，肝细胞 硫酸肝素 血管和细胞表面 1 人工养殖鲟鱼头骨中硫酸软骨素的指标分析 硫酸软骨素作为动物蛋白聚糖的代表物质，主要存在于动物的喉骨鼻软骨气管骨韧带等结缔组织中。从动物软骨中提取的，主要是CSA、CSC及各种硫酸软骨素的混合物。不同动物体内所存在的硫酸软骨素类型不同，猪、牛、羊的喉骨、鼻骨和关节骨中主要含有硫酸软骨素A，鲨鱼、乌贼等海洋动物的软骨中主要含有硫酸软骨素C。 目前国内生产的硫酸软骨素主要原料为鲨鱼软骨，也有厂家以牛羊鸡鸭等畜禽动物软骨为提取原料。近年来由于过度捕捞鲨鱼资源已日趋枯竭;同时，口蹄疫禽流感等畜禽类动物疾病的频繁发生，使人们对其提取物多有心理障碍。因此寻求新的硫酸软骨素生产的原料来源已迫在眉睫。 活化石之称的鲟鱼类是一群大中型经济鱼类，广泛分布于北回归线以北的水域中。鲟鱼是一种软骨硬鳞鱼，除软骨本身之外，鲟鱼头骨中富含软骨。对人工养殖鲟鱼加工来说，鱼头是一种下脚料，价格便宜。鲟鱼与鲨鱼软骨中硫酸软骨素含量近似，鲟鱼头价格远远低于鲨鱼，基于此，本实验对人工养殖鲟鱼头骨硫酸软骨素提取最佳工艺进行研究。 1.2硫酸软骨素的理化性质 1.2.1物理性质 硫酸软骨素(Chondroitin sulfate)简称CS， 分子式:(CHNOS)142114n 硫酸软骨素由哺乳动物气管，鱼类软骨等提取后而得的酸性粘多糖。成品外观呈白色粉末状，无臭，无味，易吸湿，易溶于水，不溶于乙醇和丙酮，冰醋酸等有机溶剂，遇水后迅速膨胀，对热不稳定。需避光密封保存。因其分子中含有大量硫酸基和羧基，故呈酸性反应。可与钠钾钙离子结合成盐,其盐类对热稳定。游离硫酸软骨素水溶液遇较高温不稳定，主要是乙酰基被水解，从其结构上脱落下来。在高温、碱性、酸性环境溶液中易水解成单糖或小分子量多糖，因而溶液粘 〔1〕度下降。 1.2.2化学性质 硫酸软骨素是来自动物软骨组织的一类天然的酸性粘多糖---糖胺聚糖。硫酸软骨素是氨基己糖和葡萄糖醛酸交替连接而成的直链分子，作为动物糖胺聚糖中的代表物质，硫酸软骨素由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰-D-氨基半乳糖以1，3 糖苷键连接形成双糖，双糖单位之间以1,4 糖苷键连接。一般硫酸软骨素约含有50-70 2 人工养殖鲟鱼头骨中硫酸软骨素的指标分析 个双糖单位，动物组织中的硫酸软骨素平均分子量约为260000。 因制备方法不 〔2〕同，多数硫酸软骨素产品分子量为10000-50000。 在分子结构上硫酸软骨素氨基己糖环的4 位或6 位可硫酸化。 图1 硫酸软骨素结构 Fig.1 Structure of chondroitin sulfate 硫酸软骨素常见化学反应有降解反应，硫酸软骨素不仅在高温强酸条件下易发生降解反应，使其分子量降低，同时在硫酸软骨素裂解酶等的作用下也可发生降解。水解反应硫酸软骨素可被浓硫酸降解成小分子组分，并被硫酸化，降解的程度和硫酸化的程度随着温度的升高而增加，在30,50?温度下，2 h可使平均分子量降至3000,4000。硫酸软骨素也可以在稀盐酸溶液中水解而成为小分子产物，温度越高水解速率越快。 CS 分子结构和理化性质与其提取工艺的难易程度密切相关。按其化学组成和结构不同，可分为CSA、C、D、E、F、H等多种同分异构体。不同化学结构的硫酸软骨素旋光度不同，见表1-2 -2不通硫酸软骨素的旋光度 表1 Table1-2 The rotation of CS table 种类 A C D E F 20旋光度〔ɑ〕-28~-32 -55~-63 -6~-22 -16 -36 D 硫酸软骨素是一种聚阴离子的高分子化合物，多数含有—S0H和—COOH等基3 ++2+2+团，易与Na、K、Ca、Mg等阳离子结合。故其都以金属盐成分制成药品。 根据糖胺聚糖双糖中单糖分子类型、羧基和硫酸基位置的不同，可将其分为透明 3 人工养殖鲟鱼头骨中硫酸软骨素的指标分析 质酸(Hyaluronic acid,HA)、硫酸软骨素A(Chondroitin sulfate A,CSA)、 硫酸软骨素C(Chondroitin sulfate C,CSC) 、硫酸软骨B(Chondroitin sulfate CSB) 、硫酸角质素(Keratan sulfate KS) 、肝素(Heparin HP)及硫酸肝素(Heparan Sulfate HS) 等几类。 表1-3各种硫酸软骨素英文缩写、别名、组成单糖表 Table1-3 The name ,abbreviation and constitute of CS table 名称 英文缩写 别名 组成单糖 透明质酸 HA 玻璃酸 D-葡萄糖醛酸 N-乙酰氨基葡萄糖 硫酸软骨素 A CSA 软骨素-4-硫酸 D-葡萄糖醛酸 康得灵 N-乙酰-D-半乳糖-4-硫酸 硫酸软骨素 B CSB 硫酸皮肤素 L-艾杜糖醛酸 N-乙酰-D-半乳糖-4-硫酸 硫酸软骨素 C CSC 软骨素-6-硫酸 D-葡萄糖醛酸 N-乙酰-D-半乳糖-6-硫酸 硫酸角质素 KS ------- D-半乳糖 N-乙酰-D-葡萄糖胺-6-硫酸 肝素 HP N-硫酸氨基葡萄糖-6-硫酸 -------- D-葡萄糖醛酸 L-艾杜糖 醛酸-2-硫酸 硫酸肝素 HS 类肝素氨基葡萄N-乙酰氨基葡萄糖 糖 葡萄糖醛酸 艾杜糖醛酸 由表2 可见透明质酸为糖胺聚糖中唯一的非硫酸化多糖，其他糖胺聚糖的硫酸化位置和数量与其生理功能密切相关，如肝素和类肝素具有的抗凝活性和调节血脂功能与其硫酸化程度关系很大。 1.3硫酸软骨素的功能及应用 硫酸软骨素是动物软骨中特有的糖胺聚糖，具有增强免疫、抗关节炎、调节血管生成、调血脂、抗凝血、调节动物体内水分、帮助骨骼形成、抗肿瘤、抗病 4 人工养殖鲟鱼头骨中硫酸软骨素的指标分析 〔3〕毒、抗炎症和调节粘附等多种生理功能。 增强免疫作用:硫酸软骨素可通过Th1型细胞因子分泌进而阻止产生抗原免疫球蛋白E，因此可将硫酸软骨素用于防止免疫球蛋白E参与的过敏反应。 〔4〕抗氧化和抗肝纤维化作用:文献指出包括透明质酸(HA)和CSA在内均能与2+2+Cu、Fe等金属离子螯合，减少氧化猝发(oxidative burst)，抑制脂类过氧化反应，从而起到抗氧化作用。指出CS和HA共同使用时限制胶原蛋白在肝组织上的沉积，从而限制肝损伤特别是肝纤维化。 〔5〕软骨保护作用:研究证明硫酸软骨素可通过刺激软骨细胞合成胶原蛋白、蛋白多糖和HA控制新软骨组织的形成(另外，硫酸软骨素也能抑制蛋白水解酶和溶酶体酶，如弹性酶、N-乙酰胺基葡萄糖苷酶等，这些酶的活性均会损坏关节软骨。 预防动脉粥样硬化:硫酸软骨素可减缓动脉粥样硬化过程，其原理为硫酸软骨素能与血浆脂蛋白结合形成复合物，从而降低血管壁的通透性，阻止或限制大分子脂蛋白的渗入。 降低血脂:硫酸软骨素具有降低血胆固醇和甘油三酯的作用，其机理为硫酸软骨素能增强毛细血管内皮某些脂酶的活性并促进该酶的释放，使甘油三酯降解为脂肪酸。 抗关节炎作用:大多数关节损伤的主要特征是软骨基质的降解所以软骨蛋白聚糖的降解是骨关节病关节损伤的首发因素。利用硫酸软骨素钠盐与D-葡萄糖胺及D-半乳糖联合治疗关节炎可减轻症状其机制为硫酸软骨素可除去大量吸收滑 +〔6〕膜中的Na 促进骨质增长，使被破坏的软骨恢复正常。 抗癌:在癌细胞需要新生血管时，结缔组织中硫酸软骨素的含量如果充分，就能阻止血管新生而切断往癌细胞输送营养的通道，从而有效地防止癌细胞的发展。 调节动物体内水分:动物结缔组织中的硫酸软骨素等蛋白多糖具有储水作用可保持动物体内水分含量相对稳定。硫酸软骨素中含有的以多聚阴离子的形式存在的羧基和硫酸基可吸附带正电荷的水分子。硫酸软骨素可吸附相当于自身重量的数百倍的水分，具有高度的保水性所以在细胞和细胞之间能储存充分的水量。 促进骨骼形成:骨钙的摄取与沉积有利于增加人体骨骼强度，而补钙的关 5 人工养殖鲟鱼头骨中硫酸软骨素的指标分析 〔7〕键是钙的吸收与沉积。硫酸软骨素在钙的沉积过程中起着积极的作用。硫酸软骨素可帮助人体有效地吸收钙而形成结实的骨骼。骨的形成是在胶原蛋白等有机物形成的纤维上沉积钙磷等无机盐而形成的。通常骨中的钙是边溶出边沉积的:即钙一边从骨中溶解出来，一边吸收血液中的钙并沉积而形成新骨，使骨始终处于一种动态平衡过程中。 防治动脉硬化和血栓:硫酸软骨素A可用于治疗高血脂症，其机理为硫酸软骨素可防止由脂蛋白酶活性引起的脂质沉着及血栓的形成。硫酸软骨素A还可通过降低血清胆固醇来治疗心绞痛等疾病。 抗病毒:硫酸肝素可选择抑制HIV-I病毒体，外实验对宿主细胞无毒性直接免疫营养法测定显示:可完全抑制病毒抗原的表达。 保存角膜:度为2, (w,v)的硫酸软骨素保存液能保持角膜内皮活性达14天，而不含硫酸软骨素的保存液只能保持7天。硫酸软骨素的存在可维持角膜的渗透性，使其形状保持不变。此外，硫酸软骨素可抑制角膜内皮的脂类物质发生 〔8〕过氧化反应，使角膜得到更好的修复和促进细胞的分裂，维持细胞内皮的活性。 食品方面，添加于食品中的硫酸软骨素具有增强肉制品的持水性、保持肉的柔嫩性、掩盖异味、防止褐变、改善其风味、口感及光泽等作用。硫酸软骨素与 〔9〕其它物质(如苯丙氨酸、维生素、v等)调配可制成止痛膳食。 B6 化妆品方面，添加硫酸软骨素的化妆品具有强化结缔组织、扩张末端血管、 〔10〕促进营养吸收和废物排除、改善皮肤细胞代谢和保持皮肤水分等作用。 药品方面，2002年国家卫生部颁布了硫酸软骨素原料以及其注射液、滴眼液、硫酸软骨素A钠原料及其胶囊的国家药品。硫酸软骨素注射液用于神经性头疼、神经痛、关节痛、动脉硬化等疾病的辅助治疗;硫酸软骨素滴眼液用于治疗角膜炎、角膜溃疡、角膜损伤;硫酸软骨素A钠胶囊作为调节血脂药物用于 〔11〕治疗动脉粥样硬化疾病，主要用于调节血脂。透明质酸水溶液具有很强的粘弹性润滑性和亲水性，应用于骨科注射剂，滴眼液和手术后防粘的钠盐制剂。将 〔12〕硫酸软骨素制成膜剂，还可有效洽疗口腔黏膜溃疡。 〔13〕美国药典版收载了硫酸软骨素原料及氨基葡糖与硫酸软骨的复合片剂。在国外上市的以硫酸软骨素或氨基葡糖和硫酸软骨素为主要成分的制剂很多，如作为膳食补充剂用于保护关节。 6 人工养殖鲟鱼头骨中硫酸软骨素的指标分析 1.4 分离提纯原理及方法 原理 1.4.1制备 硫酸软骨素属于酸性粘多糖，目前酸性粘多糖的提取方法主要有降解法和非降解法。非降解法仅用于非蛋白多糖的粘多糖— — 透明质酸。降解法适用于包括透明质酸在内的所有酸性粘多糖 。降解法提取硫酸软骨素的方法—— 碱盐法、碱提取法、酶提取法、超声波法等。 碱盐法是利用碱性条件下，连接硫酸软骨素和蛋白质的糖肽键发生断裂，使硫酸软骨素以游离态释放，并且通过控制一定的离子强度，使软骨中的某些蛋白质沉淀析出，便于滤除。一定范围内，提取物中硫酸软骨素的含量和得率是随着碱液浓度的增加而提高。 碱法提取硫酸软骨索的原理是基于硫酸软骨素与蛋白质结合的ɑ-糖苷键可在碱作用下发生消去反应，使糖肽键断裂，硫酸软骨素从蛋白多糖中释放出来，但在强碱作用下硫酸软骨素也易发生降解。 超声辅助法是利用超声波的空化作用，使物料周围形成空穴，从而有利于硫酸软骨素提取的方法。原理是在碱性条件下蛋白质易离解和超声波的热学机制可促进蛋白质快速解离而达到去杂蛋白的目的，升温(85,90?)均可使解离的蛋白质变性吸附到白陶土上，从而使硫酸软骨素与蛋白质分离，提高产品质量。采用超声辅助的碱提酶解法提取硫酸软骨索，其提取物中硫酸软骨素的含量和得率并 〔14〕无明显提高，但可大大缩短提取时间。 酶法。软骨中的胶原蛋白和粘蛋白等在中性或弱酸性条件下是可溶的，不易被分离除去。酶法是利用不同蛋白酶水解蛋白质的特异性，使蛋白质水解成氨基酸，再利用硫酸软骨素与氨基酸的溶解性不同将其提取出来的方法。酶法条件温和，不易引起硫酸软骨素的降解。常用的酶制剂有胰酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和链霉菌蛋白酶等。提取物含氮量越低，表明提取物中的杂质蛋白含量越少。 1.4.2提取方法 溶剂法:溶剂法是利用软骨中不同化学成分的溶解性差异，而将硫酸软骨素与其它杂质相互分离_的纯化方法。硫酸软骨素含有的硫酸基、羧基和羟基等亲水性基团，使其易溶于水，不溶于乙醇、甲醇、丙醇和丙酮等有机溶剂。 7 人工养殖鲟鱼头骨中硫酸软骨素的指标分析 超滤膜法:超滤膜法是利用滤膜孔径的不同使硫酸软骨素与其它非多糖类 〔15〕杂质分离，而得到分子量范围较窄且纯度较高的硫酸软骨素的方法。 季铵盐沉淀法:硫酸软骨索在溶液中以聚阴离子形式存在，与季铵盐类化合物(如溴化十六烷基三甲铵或氯化十六烷基吡啶等)形成水溶性很小的季铵盐络合物。这些络合物在低离子强度的水溶液中不溶解，但当其增大到临界离子强度时，可发生解离并溶解，利用该性质可使硫酸软骨素得到分离纯化。 1.5.测量各项指标方法 提取硫酸软骨素后，需要对其各项质量指标进行测定，从而确定其质量纯度。如表1-4为产品质量指标测定结果WS1-C3-0030-2000标准要求 表1-4 产品质量指标测定结果WS1-C3-0030-2000标准要求 Table1-6 The standards in determination results of product quality indicators table 项目 标准指标 性状 白色粉末 氨基己糖含量(以干品计) ?24.0 % 干燥失重 ?10 % 澄清度 ?0.05 pH值 5.5,7.5 脂肪 ?0.5 % 性状肉眼观察即可。 氨基己糖含量可采用咔唑比色法、液相色谱法等。咔唑法的原理是葡萄糖醛酸在强酸中与咔唑试剂发生缩合反应，生成紫红色化合物，其呈色强度与醛酸含量成正比，可比色定量;液相色谱法是经适当的前处理后，将其水溶液注入反相化学键合相色谱体系，用乙腈和水作为流动相，分子按其相对分子质量由小到大顺序流出，经示差折光检测器检测，与标定相比较定量，得出葡萄糖醛酸糖含量。综上所述，结合本实验操作条件，氨基己糖含量可采用咔唑比色法测定。 纯度测定是产品重要指标，本品采用咔唑比色法和红外光谱法测样品纯度。 蛋白质含量测定通常采用凯氏定氮法和考马斯亮蓝法。凯氏定氮法将样品与浓硫酸加热消化，使蛋白质分解，样品中有机氮转化为硫酸铵，蒸出氨用硼酸吸收滴定;考马斯亮蓝是一种蛋白质染料，与蛋白质通过范德华引力结合使其染 8 人工养殖鲟鱼头骨中硫酸软骨素的指标分析 色，在595 nm处有最大吸收值，可用于蛋白质定量测定。根据耗时和操作的便利，本实验选择考马斯亮蓝法测定蛋白质含量。 干燥失重通常可采用干燥法、蒸馏法、卡尔-费修(Karl-Fiscer)法来测定水分含量。干燥法是在一定的温度和压力下，通过加热的方式将样品中的水分蒸发完全并根据样品加热前后的质量差来计算水分含量的方法，操作简单，应用范围大;蒸馏法采用与水互不相溶的高沸点有机溶剂与样品中的水分共沸蒸馏，收集馏分与接收管内，从所得的水分容量求出样品中的水分含量，特别适用于香料水分测定;卡尔-费修(Karl-Fiscer)法属于碘量法，测定水分原理基于水分存在时碘和二氧化硫的氧化还原反应，适用砂糖、可可粉、茶叶等食品中水分测定。综上所述，结合本实验实际条件和成本，干燥失重采用直接干燥法测定。 澄清度可采用活性炭作为澄清剂。 pH值测定通常采用pH计法(电位法)和比色法。pH计法时利用电极在不同溶液中所产生的电位变化来测定溶液的pH值，适用范围广泛，测定值可准确到0.01pH单位;比色法是利用不同酸碱指示剂来显示pH，因为各种酸碱指示剂在不同pH范围内显示不同颜色，常见操作如用pH试纸测pH值，但精确度不大。综上所述，结合质量指标要求的精确度，采用pH计法测定pH值。 脂肪含量测定采用索氏提取法。原理是将经前处理的样品用无水乙醚或石油醚回流提取，使样品中的脂肪进入溶剂中，蒸去溶剂后所得到得残留物即为脂肪。 1.6. 本文行业背景和研究内容 1.6.1行业背景 目前，只有美国、西班牙、阿根廷等少数几个国家掌握了硫酸软骨素的生产技术，普遍采用碱解-酶解法生产。从90年代中期，我国开始了硫酸软骨素的开发和生产，目前国际市场所需的硫酸软骨素大部分由中国进口。 国内硫酸软骨素生产厂家的工艺相似，大部分厂家生产规模小生产周期冗长，提取成品率和质量波动较大，生产成本居高不下，经济效益低下。有的厂家利用浓碱等反应条件剧烈的工艺提取硫酸软骨素，在生产的同时对环境造成了无可挽回的破坏。 就国际市场需求看，硫酸软骨素钙自2000 年出口销售以来销量逐月递增且 9 人工养殖鲟鱼头骨中硫酸软骨素的指标分析 供不应求。国外的许多厂商将这些原料进行纯化加工又大量返销国内市场，对国内产品冲击很大。目前国内有许多工厂因技术粗糙时常发生外贸退货，经济效益低下或甚至亏本;另一方面相当一部分外贸出口公司却无法得到合格产品。因此研究寻找较优的提纯工艺使产品质量稳定和成品率提高十分有必要。 硫酸软骨素在药品和保健食品方面有广阔的应用和研究价值。近年来，硫酸软骨素大量出口美国或欧洲，已成为出口量最大的生化医药产品之一，年出口量约2000吨。今后我国应不断开拓国际市场，扩大其应用范围，发挥其在心脑血管方面缓和、无副作用的特点，以及在骨关节疾病方面的潜力，扩大国内用量。同时，不断改进生产工艺和分析检验方法，适应国内外对原料和制剂的要求，提高出口产品的质量和价格。 1.6.2研究内容 本文采用酶提取法对人工养殖鲟鱼头软骨中硫酸软骨素进行提取，分析粗提产品分别采用直接干燥法、索氏抽提法和考马斯亮蓝法进行水分含量、脂肪含量与蛋白质含量的定量分析;并按国标对硫酸软骨素提取率、纯度、葡萄糖醛酸含量等进行分析，为建立工业生产硫酸软骨素的质量标准打下基础。 10 人工养殖鲟鱼头骨中硫酸软骨素的指标分析 引言 硫酸软骨素原料来源广泛，但普遍原料成本较高，人工养殖鲟鱼头骨富含硫酸软骨素，成本较低。随着我国鲟鱼养殖的技术的成熟，从人工养殖鲟鱼头骨提取硫酸软骨素成为鲟鱼价值增值的最佳方法，也使硫酸软骨素资源的合理有效利用。 我国有为数不少的厂家在生产硫酸软骨素，其中多数是粗制品，少数精制品出口到国外。从经济效益上看，生产精制品比粗制品的效益高，特别是出口产品效益更高。硫酸软骨素精提取迫在眉睫，但传统的碱法提取硫酸软骨素对环境有很大的污染。而酶法条件温和，专一性强，效率高，是最佳提取方法首选。 硫酸软骨素为酸性粘多糖，在软骨组织中以蛋白多糖形式存在，蛋白多糖中硫酸软骨素多糖链与核心蛋白通过共价键连接(糖肽键)，而蛋白多糖的聚集体则通过次级键(氢键和盐键)形成。可见，从软骨组织中提取硫酸软骨素仅依靠破坏次级键的方法是不够的，而必须以降解蛋白质的方法，破坏多糖链与蛋白的共价结合方能达到提取硫酸软骨素的目的。 酶提取法对人工养殖鲟鱼头软骨中硫酸软骨素进行提取，重点分析粗提产品。分别采用直接干燥法、索氏抽提法和考马斯亮蓝法进行水分含量、脂肪含量与蛋白质含量的定量分析;并按国标对硫酸软骨素提取率、纯度、葡萄糖醛酸含量等进行分析，为酶法工业生产硫酸软骨素打下理论基础。 11 人工养殖鲟鱼头骨中硫酸软骨素的指标分析 2实验方法 2.1实验试剂及仪器 2.1.1实验流程 鲟鱼头骨? 软骨粉 ?加入锥形瓶? 放入摇床恒温反应 ? 中间 胰蛋白酶、木瓜蛋白酶?溶液 时刻调pH加胃蛋白酶 ? 反应完全后灭活 ? 调pH值为中性 ? 离心取清 夜 ? 乙醇沉淀 ? 静置过夜 ? 离心取沉淀 ? 干燥 ? 称重 ? 得 蛋白质含量分析 葡萄糖醛酸含量分析 粗品 ? 质量分析 ? 提取率分析 脂肪、水分、pH值测定 样品光谱分析 2.1.2实验材料及试剂 鲟鱼头:由天峡鲟业有限公司提供 实验使用的主要试剂如表2-1 表2-1主要实验试剂 Table 2-1 Major reagent 试剂 生产地 试剂 生产地 胃蛋白酶 北京经欣生物科技公司 盐酸 天津科密欧化学试剂公司 胰蛋白酶 武汉华顺生物 氢氧化钠 天津科密欧化学试剂公司 木瓜蛋白酶 技术有限公司 浓硫酸 天津科密欧化学试剂公司 牛血清白蛋白 本实验室自备 95%乙醇 天津博迪化学试剂公司 12 人工养殖鲟鱼头骨中硫酸软骨素的指标分析 考马斯亮蓝 湘中地址实验所 咔唑 中国医药集团上海化学试 剂公司 2.1.3实验仪器与设备 主要实验仪器与设备如表2-2。 表2-2 主要实验仪器与设备 Table 2-2 Major Instruments and equipments 实验仪器名称 生产商 离心机 美国Sigma 摇床 国华电器 紫外可见分光光度计 上海精宏实验设备公司 2.2硫酸软骨素提取方法 从鲟鱼头中取出软骨，洗净，切成小块，置于大烧杯中100?水浴加热12 h。中途换水两次以除去表层油脂。冷却后漂洗，沥干水后送入60?干燥箱干燥约5 h 。干燥完全后粉碎得软骨粉。 称取一定量软骨粉，根据一定的固液比加蒸馏水溶解酶(已称取)。放入摇床恒温反应，反应时间中间时刻调加入胃蛋白酶直至反应完全。反应液水浴加热进行酶灭活处理，冷却后调至中性。离心，取清夜，加入清夜体积两倍乙醇进行沉淀，边加入乙醇边搅拌。放入冰箱静置24 h。离心取沉淀，沉淀送入50?干燥箱干燥约3 h，得硫酸软骨素粗品。 酶反应温度过高会引起酶失活，温度过低酶活性不高。木瓜蛋白酶最适温度50?,60?，胃蛋白酶不耐低温，胰蛋白酶最适温度为45?。本实验综合三种酶最适温度，设定反应温度为38?，故温度不作为单因素考虑。 酶浓度因素。酶浓度不同，其它因素相同，按2.1.1实验流程操作，得粗品。随着酶浓度的提高，粗品提取率随之升高，但酶浓度升高到一定值(15 mg/g)，提取率不再增大。 时间因素。反应时间不同，其它因素相同，按2.1.1实验流程操作，得粗品 13 人工养殖鲟鱼头骨中硫酸软骨素的指标分析 即可。随着反应时间的增长，粗品提取率随之升高，但反应时间超过50 h ，提取率虽然有所增长，但增长空间不大。 固液比因素。固液比不同，其它因素相同，按2.1.1实验流程操作，得粗品。随着固液比的提高，粗品提取率随之升高，但固液比升高到一定值(1:12)，提取率不再增大。 根据上述单因素的影响，本次试验确定三因素三水平，了正交试验，正交表如表2-3 。 表2-3正交设计表 Table2-3The level of factors table 水平 因素 A酶量 B时间 C固液比 1 5 36 1:8 2 10 48 1:10 3 15 60 1:12 2.3 硫酸软骨素各项指标测定方法 2.3.1葡萄糖醛酸含量测定方法 采用咔唑比色法，绘制葡萄糖醛酸标准曲线。 样品标液反应完全后溶液呈紫红色，冷却后测其523 nm处吸光度A。 523由标准曲线计算在不同条件下提取的硫酸软骨素中葡萄糖醛酸含量Gric % 。 2.3.2样品纯度测定方法 采用咔唑比色法，绘制硫酸软骨素标准曲线。 按2.3.1操作，测样品标液523 nm处吸光度A由标准曲线计算在不同条，523 件下提取的硫酸软骨素纯度Pr % 。 2.3.3蛋白质的标定方法 取不同浓度牛血清白蛋白，采用考马斯亮蓝法，测其595 nm 处吸光度A，595绘制标准曲线。 样品标液同上步骤与考马斯亮蓝反应，测其595 nm处吸光度A。 595 由标准曲线计算在不同条件下提取的硫酸软骨素中蛋白含量Pr % ， 14 人工养殖鲟鱼头骨中硫酸软骨素的指标分析 ,6稀释倍数，10，, 公式(1) Pr%,，100%w 公式中(1)ω为标准曲线计算出的硫酸软骨素中蛋白质的含量，(mg/L) w为硫酸软骨素的质量,g 2.3.3 脂肪含量测定方法 依据GB50009.6—85，索氏抽提法测硫酸软骨素中脂肪含量。 脂肪含量见公式(2): m,m21 公式(2) 脂肪含量,，100%m mm公式(2)中为接收瓶和脂肪质量，g ;为接收瓶质量，g ;为样品质量，m21 g 2.3.4 水分含量测定方法 采用称取硫酸软骨素样品1 g，称取10 g清洁干燥海砂，搅拌均匀。先设定55?干燥0.5 h，再设定105?干燥约2 h。取出称重。 样品水分含量x见公式(3): m,m32 公式(3) x,，100%m1 mmm公式(3)中为硫酸软骨素样品质量;为海砂质量; 为干燥后总质量 123 2.3.5 pH测定方法 称取1 g样品，加无CO蒸馏水10 mL，摇匀。待pH计校正后，蒸馏水淋2 洗电极，滤纸吸干，插入待测液，稳定后读数，记录pH。清洗电极。 15 人工养殖鲟鱼头骨中硫酸软骨素的指标分析 3结果与讨论 3.1 硫酸软骨素中葡萄糖醛酸含量分析 [16]按2.3.1操作，参考文献得葡萄糖醛酸标准方程y=0.00275x+0.01883 2(r=0.984)。计算结果如表3-1 3-1硫酸软骨素中葡萄糖醛酸含量 Table3-1 Result analysis of glucose rate of Chs Gric% 因素 A B C 1 1 1 1 40.08 2 1 2 2 47.36 3 1 3 3 48.84 4 2 1 2 43.76 5 2 2 3 34.84 6 2 3 1 79.64 7 3 1 3 35.14 8 3 2 1 64.86 9 3 3 2 24.52 K45.43 39.66 61.52 1 K52.75 49.02 38.55 2 K41.51 51.00 39.61 3 11.24 11.34 22.97 极差 极差越大说明该因子的水平波动时，该因子对实验的结果影响就越大。按照极差的大小来决定提取葡萄糖醛酸因子的影响顺序为:固液比,提取时间,酶浓度。反应体系容积增大，在醇沉工序时，大量消耗乙醇，所以从经济和生产来说，固液比保持在1:10比较合适。 从表3-1中可知最佳工艺组合为A酶浓度10 mg/g、B反应时间为60 h、23 C固液比1:8 。 1 按照此工艺组合条件再次实验，得样品。按2.3.1操作，取样品测三次，取 16 人工养殖鲟鱼头骨中硫酸软骨素的指标分析 平均值，代入公式，计算硫酸软骨素中葡萄糖醛酸含量为 79.23% 。结果略高于正交试验最佳结果。若要求硫酸软骨素中葡萄糖醛酸含量高，该工艺条件可取。 3.2硫酸软骨素纯度分析 [17]按2.3.2操作，参考文献得硫酸软骨素标准方程y=0.00394x,0.01014 2(r=0.980)。计算结果如表3-2 3-2 硫酸软骨素纯度分析 Table3-2 Result analysis of purity of Chs 因素 纯度% A B C 1 1 1 1 91.80 2 1 2 2 93.17 3 1 3 3 93.53 4 2 1 2 92.76 5 2 2 3 91.47 6 2 3 1 95.36 7 3 1 3 91.64 8 3 2 1 94.94 9 3 3 2 90.12 K92.83 92.07 94.01 1 K93.20 93.19 92.02 2 K92.23 93.00 92.21 3 0.97 1.12 1.80 极差 极差越大说明该因子的水平波动时，该因子对实验的结果影响就越大。按照极差的大小来决定提取纯度因子的影响顺序为:固液比,提取时间,酶浓度 由表3-2中可知最佳工艺组合为A酶浓度10 mg/g、B反应时间为48 h、C221固液比1:8 。 按照此工艺组合条件再次实验，得样品。按2.3.2操作，取样品测三次，取平均值，代入公式，计算硫酸软骨素纯度为 95.41% 。结果略高于正交试验最佳结 17 人工养殖鲟鱼头骨中硫酸软骨素的指标分析 果。若要求硫酸软骨素纯度高，该工艺条件可取。 3.3硫酸软骨素中蛋白质含量分析 按2.3.3操作，做蛋白质标准曲线如图5，得线性方程为y=0.0272x+0.0271 0.6 y = 0.0272x + 0.02710.52R = 0.9759 0.4 0.3 吸光度A 0.2 0.1 0 05101520 浓度ug/ml 图2蛋白质标准吸收曲线 Fig.2 The standard curve of BSA 由标准曲线计算在不同条件下提取的硫酸软骨素中蛋白含量?， 运算结果如表3-3 3-3硫酸软骨素中蛋白含量 Table3-3 Result analysis on protein rate of Chs Pr% 因素 A B C 1 1 1 1 1.80 2 1 2 2 1.72 3 1 3 3 1.91 4 2 1 2 1.72 5 2 2 3 1.04 6 2 3 1 1.41 7 3 1 3 1.27 8 3 2 1 1.65 18 人工养殖鲟鱼头骨中硫酸软骨素的指标分析 9 3 3 2 1.13 K1.81 1.60 1.62 1 K1.39 1.47 1.52 2 K1.35 1.48 1.41 3 0.46 0.13 0.21 极差 极差越大说明该因子的水平波动时，该因子对实验结果影响就越大，按照极差的大小来决定提取蛋白质含量因子的影响顺序为:酶浓度,固液比,提取时间。 由表3-3中可知最佳工艺组合A酶浓度15 mg/g、B反应时间为48 h、C323固液比1:12 。 按照此工艺组合条件再次实验，得样品。按2.3.3操作，取样品测三次，取平均值，代入公式，计算硫酸软骨素蛋白质含量为 1.00 % 。结果略低于正交试验最佳结果。若要求硫酸软骨素杂质少，该工艺条件可取。 3.4脂肪含量测定结果及分析 按2.3.4操作，采用索氏抽提法测硫酸软骨素的粗脂肪含量如表3-3 表3-4 脂肪含量表 Table3-4 Fat content rate of Chs 因素 脂肪% A B C 1 1 1 1 0.143 2 1 2 2 0.136 3 1 3 3 0.141 4 2 1 2 0.134 5 2 2 3 0.113 6 2 3 1 0.127 7 3 1 3 0.121 19 人工养殖鲟鱼头骨中硫酸软骨素的指标分析 8 3 2 1 0.132 9 3 3 2 0.117 K0.140 0.133 0.134 1 K0.125 0.127 0.129 2 K0.123 0.128 0.125 3 0.017 0.006 0.009 极差 极差越大说明该因子的水平波动时，该因子对实验结果影响就越大，按照极差的大小来决定提取蛋白质含量因子的影响顺序为:酶浓度,固液比,提取时间。 由表3-4中可知最佳工艺组合A酶浓度15 mg/g、B反应时间为48 h、C323固液比1:12 。从表3-4可知，各组样品脂肪含量差别不大，说明原料预处理加热水浴软骨已经较好分离出粗脂肪。该方法除粗脂肪是可行的。 按照此工艺组合条件再次实验，得样品。按2.3.4操作，取样品测三次，取平均值，代入公式，计算硫酸软骨素蛋白质含量为 0.106 % 。结果略低于正交试验最佳结果。若要求硫酸软骨素脂肪含量少，该工艺条件可取。 3.5水分含量、pH值的测定结果及分析 按2.3.5操作，采用直接干燥法测硫酸软骨素水分含量如表3-5。按2.3.5操作，采用pH计法测硫酸软骨素pH值如表3-5 表3-5硫酸软骨素pH值和水分含量表 Table3-5 Result pH and water content rate of Chs 因素 水分% pH值 A B C 1 1 1 1 4.61 6.54 2 1 2 2 4.53 6.37 3 1 3 3 4.44 6.34 4 2 1 2 4.30 6.19 20 人工养殖鲟鱼头骨中硫酸软骨素的指标分析 5 2 2 3 4.34 6.24 6 2 3 1 4.26 6.05 7 3 1 3 3.82 5.77 8 3 2 1 4.19 6.09 9 3 3 2 3.95 5.80 K4.53 4.24 4.35 1 K4.30 4.35 4.26 2 K3.99 4.22 4.20 3 0.54 0.13 0.15 极差 硫酸软骨素分子是酸性粘多糖，溶于水后呈酸性。 从表3-5可知，各组样品水分含量差别不大，但纯度高的样品水分含量稍高。 极差越大说明该因子的水平波动时，该因子对实验结果影响就越大，按照极差的大小来决定水分含量因子的影响顺序为:酶浓度,固液比,提取时间。硫酸软骨素分子具有很高的吸湿性，粗品在称量时也可能会吸取空气中水分，导致水分含量稍高。 由表3-5中可知最佳工艺组合A酶浓度15 mg/g、B反应时间为60 h、C333固液比1:12 。从表3-5可知，各组样品水分含量差别不大，但纯度高的样品水分含量稍高。 按照此工艺组合条件再次实验，得样品。按2.3.5操作，取样品测三次，取平均值，代入公式，计算硫酸软骨素蛋白质含量为 3.78 % 。结果略低于正交试验最佳结果。若要求硫酸软骨素水分含量少，该工艺条件可取。 3.6硫酸软骨素提取率测结果和外观性状分析 3-6硫酸软骨素提取率结果分析表 Table3-6 Result analysis on extraction rate of Chs 因素 提取率 产品外观性状 A B C 1 1 1 1 29.43 浅黄色固体 21 人工养殖鲟鱼头骨中硫酸软骨素的指标分析 2 1 2 2 39.74 白色固体 3 1 3 3 49.16 淡黄色固体 4 2 1 2 47.48 白色固体 5 2 2 3 50.00 淡黄色固体 6 2 3 1 34.59 淡白色疏松固体 7 3 1 3 52.89 白色疏松固体 8 3 2 1 38.01 白色疏松固体 9 3 3 2 47.23 类白色疏松固体 K39.44 43.27 34.01 1 K44.02 42.58 44.82 2 K46.04 43.66 50.68 3 6.6 1.08 16.67 极差 从表3-6可知，伴随副反应发生或提取时间过长会使产品颜色加深。 极差越大说明该因子的水平波动时，该因子对实验结果影响就越大，因而按照极差的大小来决定提取率因子的影响顺序为:固液比,酶浓度,提取时间。 鲟鱼软骨粉有很强的吸湿性，因为其中的硫酸软骨素分子是以多聚阴离子的形式存在的羧基和硫酸基可吸附带正电荷的水分子，吸附相当于自身重量的数百倍的水分。在反应体系中，大部分水分子和硫酸软骨素因静电作用结合，并非游离态，因此反应溶液的粘度大，结合酶动力学说，底物分子与酶分子的碰撞概率减小，反应速率降低。故高固液比提高提取率。 由表3-6中可知最佳工艺组合A酶浓度15 mg/g、B反应时间为60 h、C333固液比1:12 。 按照此工艺组合条件再次实验，得样品。取样品测三次，取平均值，计算硫酸软骨素提取率为 53.31 % , 产品颜色为类白色固体。结果略高于正交试验最高结果。若要求硫酸软骨素提取率高，外观好，该工艺条件可取。 3.7硫酸软骨素光谱分析 -1-1采用KBr压片法，对最佳工艺条件样品硫酸软骨素在400 cm , 4000 cm进行扫描，得到硫酸软骨素的红外吸收光谱，见图3 。 22 人工养殖鲟鱼头骨中硫酸软骨素的指标分析 图3 硫酸软骨素的红外光谱 Figure 3 The IR absorption curve of Chs 在200 nm , 400 nm进行扫描，得到硫酸软骨素的紫外吸收光谱，见图4 。 图4 硫酸软骨素的紫外光谱 Figure 4 The UV absorption curve of Chs -1由图4 可知:在3470 cm附近有一宽的强吸收峰，为糖环上羟基的伸缩振 -1-1动所引起的，在2926 cm附近有糖分子中C-H伸缩振动的特征峰，在1658 cm 23 人工养殖鲟鱼头骨中硫酸软骨素的指标分析 -1-1附近有乙酰氨基的N-H伸缩振动，在113 1cm和1072 cm附近有C-O伸缩振 -1-1动，在1259 cm和827 cm附近有硫酸基团的振动，说明样品中含有硫酸软骨素所有的乙酰氨基、羧基、硫酸基和糖环等官能团。 由图3.2可知，样品在268 nm , 280 nm之间无核酸和蛋白质的吸收峰，而在220 nm附近有糖的吸收，且峰型尖锐，说明硫酸软骨素样品中核酸和蛋白质杂质含量较少。 4结论与展望 4.1结论 1)首次对人工养殖鲟鱼头软骨酶法提取硫酸软骨素质量进行分析研究，为进一步确定工艺提供依据 2)对各项指标分析结果来看: 葡萄糖醛酸含量高最佳工艺组合为酶浓度10 mg/g、反应时间为60 h、固液比1:8 。 硫酸软骨素纯度高最佳工艺组合为酶浓度10 mg/g、反应时间为60 h、固液比1:8 。 蛋白杂质含量少最佳工艺组合酶浓度15 mg/g、反应时间为48 h、固液比1:12 。 脂肪含量少最佳工艺组合为酶浓度15 mg/g、反应时间为48 h、固液比1:12 。 水分含量少最佳工艺组合酶浓度15 mg/g、反应时间为60 h、固液比1:12 。 3)最佳工艺条件下的各项指标均符合WS1-C3-0030-2000 (硫酸软骨素口服片)标准要求。 4)提取时间过长，得到产品颜色加深。提取时间应以软骨全部溶解为准。 5)硫酸软骨素的光谱分析表明，提取的硫酸软骨素样品中核酸和蛋白含量少。按优化工艺提取的鲟鱼硫酸软骨素质量符合WS1-C3-0030-2000 (硫酸软骨素口服片)标准要求，其红外光谱图也与标准品相似。 24 人工养殖鲟鱼头骨中硫酸软骨素的指标分析 4.2展望 (1)本试验原料采用鲟鱼软骨，这部分原料中除含有蛋白多糖外，还含有大量的蛋白质、无机盐、脂肪、结缔组织及残留的肌肉(在进行试验时，为了提高硫酸软骨素的纯度，首先应尽量去除软骨上的肌肉、脂肪、结缔组织;其次，应将软骨尽量粉碎，以提高提取率和降低浸提时间。另外，硫酸软骨素的提取率和纯度高低与所采用的原料部位有关。 (2)酶法反应条件温和，操作简单，不会引起硫酸软骨素的降解(固液比越高，得率越高，最后达到平衡。但快速有效反应也可能使反应体系升温，引起蛋白质和粘多糖的分解并产生副反应，产品颜色加深，不符合质量要求，因此注意放入恒温箱反应。同时提取时间过长也会使产品颜色加深，应以软骨全部溶解为准。乙醇量选择为清夜体积2倍量，溶剂量少提取不完全，在进行除杂质等的处理时因浓度高造成较大损失，溶剂量大使成本增加。 今后需进一步研究的课 在制备硫酸软骨素时，由于是粗提工艺，得到的是硫酸软骨素同分异构体的混合物，如果想得到高纯度的各个组分，需要进一步分离制备，并进行分子结构的定性检验。 25 人工养殖鲟鱼头骨中硫酸软骨素的指标分析 参考文献 [1]李鑫.硫酸软骨素提取和纯化方法的研究[硕士学位论文].四川大学, 2005 [2] Nicola Volpi(Adsorption of glycosaminoglycans onto coral a new possible implant biomaterials for regeneration therapy[J](Biomaterials，1999，20:1395-1363( [3]罗曼,蒋立科(硫酸软骨素快速提取法研究[J](动物学杂志，2000，35(5):37-40( [4] Takashi Hamano，Tukimasa Mitsuhashi(High—performance liquid chromatography assay of chondroitin sulfate in food productsp(Analyst，1989，114(8):891-893( [5]陈守平. 鲟鱼硫酸软骨素制备工艺的研究 [硕士学位论文].福建农林大学,20070401. 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