【doc】免疫金银染色法检测抗弓形虫抗体

【doc】免疫金银染色法检测抗弓形虫抗体 免疫金银染色法检测抗弓形虫抗体 受(上海免疫学杂志)1996年第16卷第1期 侧瓶为磷 免疫金银染色法检测抗弓形虫抗体 唑 解放军第175医院漳州363000名z 弓形虫病是一种广泛流行的人畜共患疾病,多 数为隐性感染及临床症状的非典型性,使得其病原 学诊断不易成功.目前常用的方法有ELISA, IFAT,IHA等"q】,但都存在一定的局限性.给基层 医院推广应用带来一定的困难此,我们建立了一 种检测抗弓形虫抗体的免疫金银染色法.现介绍如 下. l材料和方法 1.1抗原片制备取RH株弓形虫(福建省卫生防 疫站提供)的速殖子接种昆明小鼠腹腔,3d后用生 理盐水洗出,经G3号滤器除宿主细胞和组织碎屑, 滤液离心弃上清.沉淀的弓形虫用0.01mo1]LpH 7.4PBS洗3次,制成一定浓度,涂片后固定,低温 球箱保存备用. l_2葡萄球菌A蛋白交联的金溶胶(SPA.G)由南 京军区福州总医院实验科赠送. 1.3银染色液20.0g]L明胶6ml,pH3.5柠檬酸 缓冲液lm1.57.Og/L对苯二酚3ml和25.Og[L硝酸 银溶液02ml,临用前分别配制.按比例混合即成. 1.4血清标本4份弓形虫阳性血清(经病理切片 找到弓形虫或培养出弓形虫速殖子),分别由福建省 防疫站和江苏省农科院提供:不育症息者的血清 147份:健康体检者50人份. 1.5金银染色法待测血清用Tris.HCI缓冲液 (TBS)I:10稀释后滴加于弓形虫抗原片上,37?30 rain;自来水冲洗后用TBS浸洗3次,每次5rain. 加10%小牛血清37?割闭15rain.甩去小牛血清, 干后加SPA-G,37?30min:按上法洗涤,用电吹风 畋干,滴加新鲜配制的银染液,窒沮暗处染色10rain 左右洗后晾干,高倍镜或油镜观察结果. 1.6间接荧光抗体试验(IFAT)按文献[2]进行. 2结果 2.1结果判断镜下阳性弓形虫有明显黑色金属 银着染,明性仅可见淡的虫体轮廓. 2.2方法考核 2.2.1重复性1份阳性标本在同一批试验中重复 检测10次.均呈阳性结果;1份阳性标本分5次进 行测定.结果均为阳性. 2.22特异性将阳性血清请于抗原片上.温育后 加弓形虫膜抗原(将虫体悬液冷冻过夜.迅速置37? 融化.反复3次.1000Of/rain.4"C离心60mln,上清 液即为膜抗原)进行阻断,再银染后镜检,结果均为 阴性反应,直接将SPA.G加于抗原片上沮育.银染 后镜下观察,全片背景清晰.未见银染颗粒非特异性 吸附. 2.2.3教感性4份抗弓形虫抗体阳性血清作不同 滴度稀释后,分别用金银染色法和IFAT进行检测, 结果请度依次分别为1:160,1:80,1:320,1:640和 1:160,1:80,1:160,1:640.结果表明两法的敏感性 基本一致. 2.3金锟染色法的初步应用用金银染色法和 IFAT两种方法对147份不育症患者血清,健康体 检者50人进行弓形虫抗体的检测,其阳性率分别为 143%(211147),4%(2150)和149%(221147),6% (3/50).经一致性试验检查两法结果高度一致(= 273.8.P<005). 3讨论 免疫金银染色法是由电镜示踪技术发展而建立 的一种极为敏感特异的细胞化学和免疫组化技术. 我们用此法检测弓形虫抗体获满意效果,且与 IFAT比较两法结果高度一致(P<0.os).由于 IFAT需用荧光显镦镜,使在基层单位推广应用受 到一定限制,而金银染色法的优点在于利用生物显 镦镜即可观察结果,染色图像清晰,结果一目了然. 实验结果表明.金银染色法重复性好,特异性高,敏 感性与IFAT相似,操作简便,无需特殊仪器设备,. 一 般均可采用.. 参考文献 1.赵伸堂.郝凤荣.古铁民,等.中国人兽共患病杂, 志1989;5:27- 2.刘俊英.赵树譬.郝风兰,等.北京医科大学学. 报1986;18:3~ 3赵树譬.中华内科杂志1988;27:444 (1995年3月25日收稿.1995年7月7日修回)