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电刺激小脑顶核对大鼠局灶脑缺血再灌注后脑内成体神经干细胞增殖分化的影响及其作用机制研究(可编辑)

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电刺激小脑顶核对大鼠局灶脑缺血再灌注后脑内成体神经干细胞增殖分化的影响及其作用机制研究(可编辑)电刺激小脑顶核对大鼠局灶脑缺血再灌注后脑内成体神经干细胞增殖分化的影响及其作用机制研究(可编辑) 电刺激小脑顶核对大鼠局灶脑缺血再灌注后脑内成体 神经干细胞增殖分化的影响及其作用机制研究 重庆医科大学 博士学位论文 再灌注后脑内成体神经干细 电刺激小脑顶核对大鼠局灶脑缺血/ 胞增殖分化的影响及其作用机制的研究 姓名:王咏龙 申请学位级别:博士 专业:神经病学 指导教师:罗勇 20090501重庆医科大学博士研究生学位论文 电刺激小脑顶核对大鼠局灶脑缺血/再灌注后脑内成体 神经干细胞增殖分化的影响及其作用机...
电刺激小脑顶核对大鼠局灶脑缺血再灌注后脑内成体神经干细胞增殖分化的影响及其作用机制研究(可编辑)
电刺激小脑顶核对大鼠局灶脑缺血再灌注后脑内成体神经干细胞增殖分化的影响及其作用机制研究(可编辑) 电刺激小脑顶核对大鼠局灶脑缺血再灌注后脑内成体 神经干细胞增殖分化的影响及其作用机制研究 重庆医科大学 博士学位论文 再灌注后脑内成体神经干细 电刺激小脑顶核对大鼠局灶脑缺血/ 胞增殖分化的影响及其作用机制的研究 姓名:王咏龙 申请学位级别:博士 专业:神经病学 指导教师:罗勇 20090501重庆医科大学博士研究生学位论文 电刺激小脑顶核对大鼠局灶脑缺血/再灌注后脑内成体 神经干细胞增殖分化的影响及其作用机制的研究 摘要 背景 缺血性脑卒中是神经系统的常见病和多发病,在脑卒中约占%。 大多数患者中遗留有瘫痪、失语等严重后遗症,给患者带来极大的痛 苦,同时也给社会和家庭带来沉重的负担。脑缺血/再灌注损伤使脑组 织的功能障碍和结构损伤更加严重,使治疗效果大大降低。因此如何 采取合理的措施预防和治疗缺血性脑血管病,恢复受损神经细胞功能, 降低致残率和病死率,近年来已成为医学界关注的热点课题。脑缺血/ 再灌注损伤是一复杂的病理生理过程,神经元结构破坏和缺失可能是 引起功能障碍的病理关键。目前还没有理想的治疗脑缺血/再灌注损伤 的方法。研究发现电刺激小脑顶核对神经系统疾病有神经保护作用, 可以抗炎症、抑制细胞凋亡、促进神经组织的结构重建等作用。目前, 采用仿生物电,模拟实验性小脑顶核电刺激而研制的小脑电刺激仪已 广泛应用于许多神经系统疾病的临床治疗,对多种中枢神经系统疾病 都产生了比较肯定的临床效果。是控制细胞命运的信号传导途 径。当被激活后,神经干细胞进行增殖,而当活性被 抑制时,干细胞则进入分化程序。基因转录调控因子包括 和是指由一个碱性螺旋.环一螺旋结构及其上游富含碱性氨基酸 重庆医科大学博士研究生学位论文 序列的核酸顺序组成的一类基因,可以调控许多基因的转录。研究表 ,信号通路能抑制神经干细胞向神经元方向分化,促进神经干 明 细胞增殖。的高表达可促进干细胞的分化,相反低表达则抑制 干细胞的分化,使干细胞处于持续的增殖状态。核转录因子一对神经 干细胞增殖分化作用机制十分复杂,通过对众多涉及炎症和免疫反应 等方面的基因调控来影响神经干细胞增殖分化。基于以往实验研究与 临床的成果,本实验从电刺激小脑顶核干预局灶脑缺血/再灌注损伤内 源性神经干细胞的研究入手,进一步探讨电刺激小脑顶核对大鼠局灶 脑缺血/再灌注损伤脑组织神经干细胞的增殖分化的影响及其作用机 制,为缺血性脑血管病的治疗提供实验基础。 目的 .观察电刺激小脑顶核对大鼠局灶脑缺血/再灌注神经行为学、神 经功能缺损的影响以及脑组织的含水量、脑梗死体积的变化。 .观察局灶脑缺血/再灌注各时间点大鼠成体神经干细胞的增殖 分化及电刺激小脑顶核对局灶脑缺血/再灌注大鼠成体神经干细胞的增 殖分化的影响,探讨电刺激小脑顶对局灶脑缺血/再灌注后神经重建的 作用。 .观察电刺激小脑顶核对大鼠局灶脑缺血/再灌注大鼠大脑缺血 侧皮质、、和? 和蛋白表达的变化, 进一步探讨电刺激小脑顶核对大鼠局灶脑缺血/再灌注后脑内成体神经 干细胞增殖分化影响的作用机制。 重庆医科大学博士研究生学位论文 方法 .改良线栓法制备大鼠大脑中动脉局灶脑缺血.再灌注模型。 假手术组组,缺血 成年大鼠随机分为正常对照组组, /再灌注组/组,缺血/再灌注后小脑顶核假刺激组组,缺 /再灌注后小脑顶核刺激组。根据再灌注时间的不同又分为、 血 、 个亚组。对大鼠进行神经功能缺损评分以及测量脑组织的含 水量、脑梗死体积的变化。 .制备大脑中动脉局灶脑缺血.再灌注模型。成年大鼠随 机分为正常对照组组,假手术组组,缺血/再灌注组/ 组,缺血/再灌注后小脑顶核刺激组。根据再灌注时间的不同又 分为、、、 个亚组,每个亚组动物数只。免疫荧 光单标和双标法检测研究局灶脑缺血/再灌注及电刺激小脑项核对缺血 /再灌注大鼠神经干细胞的增殖的动态变化和分化的结果。 .改良线栓法制备大脑中动脉局灶脑缺血.再灌注模型。成年 大鼠随机分为假手术组组,缺血/再灌注组/组,缺血 /再灌注后小脑顶核刺激组。根据再灌注时间的不同又分为、 个亚组,每个亚组动物数只。采用和 检测局灶脑缺血/再灌注及电刺激小脑顶核对大鼠局灶脑缺血/再灌注 后、和 及蛋白的表达,采用和免疫 组化技术检测? 及蛋白的表达。 结果 .电刺激小脑项核能提高局灶脑缺血/再灌注大鼠的神经功能缺损 重庆医科大学博士研究生学位论文 评分,降低缺血侧脑组织中脑含水量,缩小脑梗死体积。 .正常对照组和假手术组侧脑室区和缺血周围皮质只存在少量 阳性细胞,局灶脑缺血/再灌注脑损伤后大鼠侧脑室下区 时增加达到顶锋.,和 阳性细胞显著增加., 时后阳性细胞仍增加.;局灶脑缺血/再灌注脑损伤 时 后大鼠缺血周围皮质阳性细胞也显著增加., 增加达到顶峰.,和时后阳性细胞仍显著增加 .;电刺激小脑顶核后大鼠侧脑室下区和缺血周围皮质 阳性细胞增加更明显,与缺血/再灌注组比较,在、、和 四个时间点阳性细胞增加更多,均有显著性差异.。免疫 荧光双标法显示在正常组、假手术组仅见极少量/和/ 双阳性细胞,缺血/再灌注组可见少量/和/双 阳性细胞,小脑项核刺激组可见大量/和/双阳性 细胞,/和/双阳性细胞明显增多,主要分化为神 经元和神经胶质细胞。 .与假手术组比较,脑缺血/再灌注组和脑缺血/再灌注后小脑顶 核刺激组、、 和蛋白的表达量均增.; 与脑缺血/再灌注组比较,小脑项核刺激组、、 和蛋白的表达量增加更明显.。与假手术组比较,脑缺/再灌注 组和脑缺血/再灌注后小脑顶核刺激组. 和蛋白的表达 量均增.;与脑缺血/再灌注组比较,小脑顶核刺激组? 和蛋白的表达量明显降低.。 重庆医科大学博士研究生学位论文 结论 .成功建立改良线栓法大鼠局灶脑缺血/再灌注模型。电刺激小脑 顶核可以降低脑缺血/再灌注损伤后急性期死亡率,促进肢体功能恢复。 电刺激小脑顶核能提高大脑中动脉局灶脑缺血/再灌注模型大鼠的神经 ,降低缺血侧脑组织中脑含水量,缩小脑梗死体积,从 功能缺损评分 而达到脑保护作用 .脑缺血后自身的神经干细胞也存在增殖。在正常对照组和假手 术组大鼠和缺血侧皮质有少量神经干细胞,未见神经干细胞增殖。 内源性神经干细胞增殖在脑缺血再灌注后逐渐升高,在脑梗死后达 到高峰,以后增殖逐渐下降,神经干细胞仍有增殖。电刺激小脑顶 核后神经干细胞增殖更明显,在达到高峰,后在和缺血周围 皮质神经干细胞均还有明显增殖。电刺激小脑项核能促进脑缺血后大 鼠内源性神经干细胞的增殖。在正常组、假手术组仅见极少量神经干 细胞分化,缺血/再灌注组可见少量神经干细胞分化,小脑顶核刺激组 可见大量神经干细胞分化,分化明显增多,分化为神经胶质细胞和神 经元。电刺激小脑顶核促进神经干细胞分化为神经胶质样细胞和神经 元样细胞。电刺激小脑顶核通过促进内源性神经干细胞增殖和分化发 挥脑组织神经重建作用。 .正常成年大鼠脑组织、、和. 表达 较少。局灶脑缺血/再灌注后,大鼠缺血侧脑皮质、、 和? 及蛋白表达明显增强,电刺激小脑顶核后、 和 及蛋白表达增强更明显,? 及蛋 重庆医科大学博士研究生学位论文 白表达增强则减弱。电刺激小脑顶核通过促进、和 及蛋白表达来影?向神经干 及蛋白表达和抑制. 细胞增殖和分化。 电刺激小脑顶核,神经干细胞,增 :局灶脑缺血/再灌注, 关键词 殖,分化,,,, 重庆医科大学博士研究生学位论文 /, ,. %. . , ,,,, . / ,. / . /.重庆医科大学博士研究生学位论文 . , / . , . ?,. . . . ?? .. . ?重庆医科大学博士研究生学位论文 .?,., . , .:/. ,? , . : 重庆医科大学博士研究生学位论文. : ,? , / / / / ,/?/ . , .,..: , ? ,/ /. ,,. ./ ./. : ? ,/ / / . 重庆医科大学博士研究生学位论文 . . , ? ? ? . .? . ? /, ./. , /. . ? /, . /. , . . 重庆医科大学博士研究生学位论文 , , / ?, ,/ /? .. /? /? /. / / . /?. . ,? ,, / / . / , . ,/ .. /.重庆医科大学博士研究生学位论文 / .,. . / ? / . ., / . / ,. /? /. ?. /?/? / . /? . / . .重庆医科大学博士研究生学位论文 .,,? ?/ ,,/ . /, ,? / . , ? ./ ,, : ,, , ,,, ? 重庆医科大学博士研究生学位论文 英汉缩略语名词对照 英文缩写 英文全称 中文全称 ? 脑源性神经营养因子 碱性成纤维生长因子碱性螺旋一环一螺旋转录调控因子 .. 骨形成蛋白一溴脱氧尿嘧啶核苷 颈总动脉互补脱氧核糖核酸脑缺血/再灌注 / 中枢神经系统微管相关蛋白齿状回 颈外动脉溴化乙锭 小脑顶核刺激 胶质纤维酸性蛋白 苏木精一伊红染色多毛和增强子断裂 缺血性脑血管病 侧脑室 .无刚毛鳞甲复合体同源物样蛋白 大脑中动脉 大脑中动脉阻塞 信使核糖核酸 重庆医科大学博士研究生学位论文神经上皮干细胞样蛋白神经生长因子 核转录因子. ? 同源物 神经干细胞 光密度寡核苷酸 磷酸盐缓冲液 ? 多聚甲醛翼腭动脉 核糖核酸酶 . 逆转录一多聚酶链反应 ? 脑室下区 /乙酸电泳缓冲液 //,,一三苯基氯化四唑 ,,一 重庆医科大学 研究生学位论文独创性声明 本人申明所呈交的论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。据我所知,除了文中特别加以标注和致谢的地方外,论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果,也不包含为获得重庆医科大学或其他教育机构 的学位或证而使用过的材料,与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已 在论文中作了明确的说明并表示谢意。 本人承担一切相关责任。 申请学位论文与资料若有不实之处, 学位论文作者签名: 学位论文版权使用授权书 本人完全了解重庆医科大学有关保护知识产权的,即:研究生在攻读学 位期间论文工作的知识产权单位属重庆医科大学。本人保证毕业离校后,发表论 文或使用论文工作成果时署名单位为重庆医科大学。学校有权保留并向国家有关 部门或机构送交论文的复印件和磁盘,允许论文被查阅和借阅。学校可以公布学 位论文的全部或部分保密内容除外,可以采用影印、缩印或其他手段保 存论文。 论文作者签名: 一 警 指导教师签名: 日重庆医科大学博士研究生学位论文 电刺激小脑顶核对大鼠局灶脑缺血/再灌注后脑内成体 神经干细胞增殖分化的影响及其作用机制的研究 前 言 脑血管病是严重危害人类健康的常见病和多发病,近年来,脑血管病尤其是 脑梗死发病率呈逐年上升趋势,在全世界己成为第一致残和第三致死的疾病,而 缺血性脑血管病的发病率几乎占脑血管病的%。缺血性脑损伤后的神经功能障 同时带来不可忽视的社会和经济问题。一般在碍严重影响患者的生存质量, 临床 上处理脑缺血性疾病的是尽早恢复脑血液再灌注,使缺血脑组织及时得到血 氧的供应,提供脑组织代谢所必要的营养物质并清除代谢废物。脑缺血后再灌注 可挽救缺血缺氧濒临死亡的细胞,又可导致缺血细胞的损伤加重,严重的甚至导 致细胞的死亡。如果能及时有效地恢复血液再灌注将可减轻脑缺血损伤,则使一 些可逆性损伤获得功能上的恢复。 脑缺血/再灌注损伤病理生理过程十分复杂,许多证据显示,脑缺血/再灌注损 伤发生过程涉及多种因素,如钙超载、氧自由基增加、兴奋性氨基酸毒性作用、 细胞炎性反应因子、线粒体功能障碍、花生四烯酸代谢失衡、白细胞浸润等。临 床上处理脑缺血/再灌注损伤虽然有溶栓、降纤、抗凝等一些有效治疗措施,但都 有其相应的适应证,不少病人都会留下了不同程度的神经功能缺损症状,严重的 影响生存质量。如何减少脑缺血/再灌注损伤遗留的后遗症,至今仍然是一个问题。 目前,治疗缺血性脑损伤还没有切实有效的方法。 越来越多的证据表明,在哺乳动物中枢神经系统的许多部位都存在神经干细 ?首先观察到成年大鼠海马齿状回具有产生新神经元的能力,即存 胞。等 在着神经干细胞。现已发现哺乳动物胎脑的广泛部位,人胚胎大脑的皮质、脑干、 间脑、端脑和肾上腺髓质等部位都存在神经干细胞。研究还发现神经干细胞存在 于成熟侧脑室下区、海马齿状回的颗粒细胞下层和脊髓的室管膜下,在成熟中枢 神经系统的许多区域存在着神经干细胞。 近几年研究显示,脑梗死后脑组织内自身的神经干细胞也可增殖和分化【弓】, 说明神经干细胞参与了脑缺血损伤的病理生理过程,这与脑缺血后神经功能恢复 重庆医科大学博士研究生学位论文 有一定关系。神经干细胞是一种能自我增殖和分化的细胞。正常情况下,它们以 静止不增殖状态存在,神经干细胞的增殖和分化受内在基因、生长因子、神经递 质周围细胞等因素调控。当脑组织发生病变、微环境改变时,神经干细胞被激活 发挥代偿和修复神经作用。神经干细胞的这种具有自我增殖和分化的潜能,可以 在脑缺血缺氧后通过内源性神经干细胞的神经再生,达到脑的自我修复。研究还 显示,哺乳动物包括成年人脑存在神经干细胞,脑缺血缺氧等疾病可诱导其增殖、 迁移并分化为神经元和胶质细胞【。 近几年,人们在增殖分化的调节因素、调控机制及应用方面进行了大量 研究,神经干细胞分化及调控机制的研究已成为国内外学者关注的热点。神经干 细胞的增殖分化可能受许多因素的影响,包括细胞自身基因调控和外来信号调控 两种机制。神经干细胞增殖分化首先是基因选择性地表达各自特有的专一性蛋白 质,最终导致神经干细胞形态、结构与功能的差异。外来信号则先要与细胞表面 的受体相结合,从而将信号传至细胞内,导致一些与增殖分化相关的基因转录和 蛋白表达。研究证明,神经干细胞基因受种多转录因子的调控,转录因子在特定 时间通过某一途径启动,决定下游基因的表达,最终决定神经干细胞的分化 结果。 神经干细胞增殖分化的基因调控机制可能相当复杂,目前仍不十分清楚其具体的 分子机制。成年神经干细胞可分化形成神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞, 这对治疗神经缺血性和神经系统退行性疾病有着广泛的应用前景。 基因是参与神经干细胞发育全过程的基因【】。激活 基因能促进 神经干细胞的增殖,抑制时则诱导神经干细胞进行分化。研究证明【培】, 增加星形胶质细胞的分化。 激活可减少神经元和少突胶质细胞的产生, 能促进神经胶质纤维酸性蛋白促进子发生突变,诱导转录的发生。研究发 ,神经干细胞的增殖分化受具有基因序列的转录调控因子控制。属 现 于转录调控因子,主要表达在神经干细胞中,在抑制神经干细胞向神经元 方向分化、维持神经干细胞保持无分化增殖的状态,起重要的作用。 在 中枢和外周神经系统都有表达,在神经元分化及特定神经元亚型选择性分化中发 挥中,调控作用。研究显示【,激活可促进神经干细胞向神经元分化, 抑制则抑制神经干细胞的分化,使神经干细胞处于持续的增殖状态。研究 认为.在神经发育及神经再生等方面都有较重要的作用,对促进神经干细胞 重庆医科大学博士研究生学位论文 . 增殖和分化均有着一定关系】。 小脑总体积占全脑体积的%左右,但其含有的神经元数量却几乎超过整个 是小脑中最古老的核,形状 脑神经元总数的%。小脑顶核 呈卵圆样,在第四脑室项内。小脑顶核细胞密集于内侧部,包含大、中、小三 类 细胞,其外侧部有许多白质纤维束穿过。小脑项核发出的纤维主要经小脑下脚的 内侧止于前庭神经核和网状结构,同时接受古、旧小脑皮质发出的纤维。小脑还 与下丘脑存在着直接的和双向纤维连接,包括下丘脑小脑和小脑下丘脑投射,共 同构成两者之间的神经环路【。 ,电刺激小脑项核对中枢神经有广泛的保护作用,能抑制神经细胞 研究证明 , ,同时促进神经再生,促进神经结构和功能重建等作用【。研究证明【 凋亡 小脑项核由肾上腺素能的固有神经元及过路神经纤维所构成,刺激小脑顶核使其 固有神经元所激发,导致其发挥脑保护作用,激发过路纤维引起的血压升高、血 管反射性扩张及脑血流增加。刺激小脑项核还可以影响下丘脑室旁核中压力感受 性反射敏感神经元的活动,说明小脑.下丘脑通路可调节心血管活动。越来越多研 究表明,小脑项核是影响胃肠活动、呼吸及心血管的重要结构,其中含有迷走神 经的参与。研究显示,小脑项核发纤维至网状结构,网状结构再发纤维到达迷走 神经背核和脊髓胸腰段交感神经低级中枢,通过迷走神经和交感神经而发挥作用, 说明小脑项核影响心血管和内脏活动的途径是间接的、多突触联系。实验还发现‘ 。 电刺激小脑顶核能够促进神经干细胞增殖 采用仿生物电,模拟实验性小脑项核电刺激而研制的小脑电刺激仪目前广泛 应用于临床。电刺激小脑项核治疗缺血性疾病如脑梗死可通过改善大脑循环、抑 制凋亡,抗炎症反应、减少氧自由基的生成及降低病灶周围组织细胞兴奋性等起 到脑保护作用。本课题将着重研究局灶脑缺血/再灌注后及电刺激小脑项核干预下 对侧脑室室下带、缺血周围皮质神经干细胞的增殖分化的影响及作用机制,初步 探讨电刺激小脑顶核在脑组织重建中中利用内源性神经干细胞进行治疗的分子机 制。 重庆医科大学博士研究生学位论文 参考文献 .【】【】. ,,:?. , , 【】 .: 【】.. ,,: ,【】 , , . 】. ,,:?. , 【】 , ., ?【. ,,:?. .【】 . 【】. ,, : .【】 , , ,. . ,,: . 【】 ,? . , ,:. , , . 】 ,【】.,, :. .,】 ,. ,,:?. .【 , , ? . ,,:?. . 【 】 , , , ? . . ,, : .【 ,, : 重庆医科大学博士研究生学位论文 . ,,:.. 【 , .:?. ,,:.. . 【 , , : , . ,,:.. . 【 :.,, :. . ,【 , , ? . .,, : .? ,【 , :? . ,, . 【】董为伟.电刺激小脑顶核与中枢神经源性保护【】.中国工程科学,, :. .【 , / ? . . ,,: 重庆医科大学博士研究生学位论文 第一部分电刺激小脑顶核对大鼠局灶脑缺血/再灌注 的保护作用 材料与方法 .材料 实验动物 .. 健康成年大鼠,雌雄不拘,体质量.,由重庆医科大学实验动物中 渝.,清洁级。每天给予足够食物和饮水, 心提供。合格证号: 室温维持在 左右。所有动物实验操作程序严格按照实验动物管理和保护的 条 款执行【】 ..主要试剂 多聚甲醛 天津市光复化工研究所 水合氯醛 中国医药集团上海化学试剂公司 .%氯化钠注射液 太极集团西南药业 广东庆发药业有限公司 聚维酮碘溶液 二甲苯 成都科龙化工试剂厂 苏木素 北京中杉金桥生物技术有限公司 盐酸 成都科龙化工试剂厂 乙醇 成都科龙化工试剂厂 甲醇 重庆东方试剂厂 . 缓冲液试剂 武汉博士德公司 ..主要试剂的配制 . 溶液 . ‘ . 重庆医科大学博士研究生学位论文 。 稀释至 加 %多聚甲醛 . ‘ . ’多聚甲醛 加 稀释至。 .%水合氯醛 水合氯醛.,充分溶解于的双蒸水中,新鲜配制。 %氯化三苯基四氮唑染色液 至 氯化三苯基四氮唑.,溶于少量生理盐水,加. .。临用前配制,避光。 ..实验仪器 电子分析天平 上海天平仪器厂 电热保温干燥箱 宁波自动化仪表研究所 。 家用冰箱 中国海尔公司 低温、超低温冰箱 日本公司 上海精科实业有限公司 电动恒流泵 电热恒温水浴箱 北京长源试验设备厂 上海亚荣生化仪器厂 自动双重纯水蒸馏器 上海公司 生物研究显微镜 .光学显微镜 日本公司 北京航空航天大学 生物医学图像分析系统 显微照相机 日本公司 立体定位仪 日本成茂公司 .微推进仪 日本光电公司 重庆医科大学博士研究生学位论文 , .型双线示波器 日本光电公司 .三通道电子刺激器 日本光电公司 .二道生理记录仪 日本光电公司 .实验方法 ..动物分组 大鼠随机分为组根据缺血/再灌注日的不同又分为、 体质量? 、 个亚组。 ?正常对照组组: ?假手术组组:分离颈外动脉,线栓插入颈内动脉约,不栓塞大 脑中动脉; ?缺血/再灌注组/组; /再灌注后小脑项核假刺激组组:大鼠脑缺血/再灌注后插入电 ?缺血 极但不刺激; /再灌注后小脑顶核电刺激组。 ?缺血 ..建立大鼠局灶脑缺血/再灌注动物模型 栓线制备:用长为、直径约.的鱼线,头端涂清漆,倒置晾 干后使头端变圆变钝,直径约...,距头端、处标记, 无菌保存备用。 根据、罗勇等【峙艮道的方法,制备右侧大脑中动脉局灶脑缺血/ 再灌注模型: 大鼠禁食后,天平称取动物体重; / ?.%水合氯醛腹腔注射 体质量麻醉动物; ?动物麻醉后仰卧位固定于手术台上: ?备皮,消毒颈部皮肤; ?经颈部正中切开皮肤,切门长.,锐钝结合分离颈部筋膜,朝外牵引胸 锁乳突肌,打开颈动脉鞘,小心暴露右侧颈总动脉 ,, 不要损伤迷走神经;从颈总动脉分叉处向上游离,电凝颈外动脉 ,所有分支并结扎切断颈外动脉:分离颈内动脉 , 重庆医科大学博士研究生学位论文 至颅底,用蛙心夹夹闭翼腭动脉:然后用蛙心夹暂时夹闭颈总动脉和颈内动 脉,在颈外动脉残端斜向剪开,插入栓线预先蘸少许肝素钠溶液抗凝,缚紧 颈外动脉残端丝,移去颈内动脉蛙心夹,将栓线缓慢朝入颅方向推进约.?. 时稍感阻力后停止,完成一侧大脑中动脉的阻塞;松开颈总动脉蛙心夹,清理 术 野,关闭切口; ?.后打开手术切口,将栓线头轻轻退回至颈总动脉分叉处,稍感阻力时 ,实现再灌注。清理术野,缝合切口。 停止 术后动物分组分笼饲养,予充足饮食,室温控制在。左右。 动物模型制备成功的判断标准 ?左侧肢体疼痛回缩反应迟钝或消失; ?提尾倒悬时左上肢向胸前屈曲; ?行走时左侧倾倒或向左转圈; ?右侧出现霍纳’氏征。 神经症状学评分标准 参照 分制评分标准,大鼠清醒后评分。 分无神经功能缺失症状; 分轻度局灶性神经功能缺失不能完全伸展左侧前肢; . 分中度局灶性神经功能缺失向左侧转圈; 分中重度局灶性神经功能缺失向左侧倾倒; 分不能自发行走,意识水平降低。 排除及纳入标准 造模后大鼠虽然有脑缺血症状,但伴下列情形之一者不纳入本研究: ?神经学症状评分低于分者; ?取脑时发现蛛网膜下腔出血者; ?脑组织石蜡切片染色无缺血病理改变者; ?未到观察时相点死亡者。 注:如因上述因素排除导致各实验组动物数不足预定数量,可通过随机抽样 原则补齐并重新制备模型。 , ..干预处理:电刺激小脑顶核 重庆医科大学博士研究生学位论文 参照等【】的方法,具体如下: ?将大鼠固定在立体定位仪上,根据大鼠脑立体定向图谱结合鼠的大小, 确定小脑项核的适当位置,一般坐标为:以前囟后缘为零点,正中线向后 ...,旁开...,深...; ?颅骨上钻个孔将同心圆电极插入病灶对侧小脑项核左侧; ?刺激参数:电流强度为.、频率为.、时程为.的直角方 波脉冲; ?再灌注后立即给予电刺激,持续时间; ?刺激过程中动物均处于浅麻醉状态; 。 ?假刺激组操作同组,电极插入小脑项核但不通电流刺激,只留针 ..神经功能缺损综合评价 术后大鼠清醒后观察各组大鼠神经行为表现,在术后、和三个时间 点按神经功能综合评价进行神经功能评分,客观地评价大鼠神经功能损害的 严重 程度。神经功能缺损综合评价包括自发运动、轻瘫实验、前肢运动功能、攀 登运 动、痛觉、深感觉六方面见表。满分为分,评分越高,神经损害程度越轻, 得分越低,说明神经损害程度越重。实验由不了解本实验分组的人评分。 表神经功能综合评分 一 .功能测试 评分 自发活动 不活动 不探索笼壁 饲养笼内缓慢活动, 活动少而迟疑、缓慢,但至少探索一面笼壁 四周活动,至少探索三面笼壁 轻瘫实验 提尾,左前肢不动 重庆医科大学博士研究生学位论文 提尾,左侧肢体活动明显减少 提尾,左侧肢体伸展较右侧差 提尾,四肢对称伸展 前肢运动功能 左前肢不运动 左前肢很少运动 左前肢伸展较右前肢差,左前肢行走功能受损 前肢对称性伸展,前肢行走对称 攀登运动 能攀登,或趋向左侧打转 左侧抓握力较右侧差,攀登功能受损 紧抓铁丝网,攀登迅速 痛觉 左侧疼痛刺激无反应 左侧疼痛刺激较右侧差 疼痛刺激两侧对称 深感觉 左侧无回抽反应 将大鼠双上肢或双下肢移到桌子边缘时, 左侧回抽反应较右侧差 两侧回抽反应灵敏 满分 ..脑组织含水量的测定 方法:用干湿法测定脑组织含水量。动物在各时间点经神经功能缺损评分后 处死,取出全脑,清除表面脑膜和血块,用滤纸吸干脑表面的水份,纵切分成 左 右两半球,放在两个已称重的箔纸上,立即称取右侧脑重量,置 的烤箱中烘 烤约,干燥后称重量。脑含水量按下列公式计算:脑组织含水量%湿 重庆医科大学博士研究生学位论文 %。 重一干重/湿重× .。脑缺血梗死体积的测定 ,沿视 每组大鼠在各时间点麻醉后迅速断头取脑,放置.?冰箱中约 交叉冠状切片片厚约,连续作个切片,在%的,,.氧化三苯基甲 氮唑溶液中浸泡?水浴,用. 溶液冲洗次,在%多 聚甲醛浸泡约后观察脑组织颜色变化,正常脑组织呈均匀红色,缺血组织呈白 色梗死。用生物医学图像分析系统检测脑梗死面积,根据脑切片梗死面积及切片 和为每一 间距离计算脑梗死体积。计算公式:梗死体积?【/×】 切片上下两面病灶面积,为梗死层面厚度。 统计学分析 . 实验数据以均数?标准差士表示,采用.软件包进行统计学处 ,组间比较采用检验,同组不同时相点比较采用单因素方差分析,.即认 理 为差异有显著性。 结果 .电刺激小脑顶核对术后大鼠生存状况的影响 实验大鼠于术后约.后苏醒,单纯缺血/再灌注组、缺血/再灌注后假 刺激组和缺血/再灌注后小脑项核刺激组均出现左侧偏瘫。术后,单纯缺血/再灌 注组、缺血/再灌注后假刺激组和缺血/再灌注后小脑顶核刺激组大鼠大多精神 萎靡,严重的睁眼困难,甚至出现死亡,但单纯脑缺血/再灌注组和假刺激组 大鼠症状明显较小脑项核刺激组重。术后,小脑项核刺激组大鼠大多症状开始 减轻,仅有少数加重,而单纯缺血/再灌注组和缺血/再灌注后假刺激组大鼠无 明显症状改善。术后至为大鼠死亡高峰期,单纯缺血/再灌注组和缺血/再灌 注后假刺激组症状严重的大鼠大多发展到死亡,小脑项核刺激组大鼠大多数 则症状好转。术后内,正常组大鼠无死亡,假手术组、缺血/再灌注组、假刺 激 组、小脑项核刺激组大鼠死亡率明显升高。死亡率从假手术组.%升到缺血/ 再 灌注组、缺血/再灌注后假刺激组和缺血/再灌注后小脑项核刺激组死亡率 为. 重庆医科大学博士研究生学位论文 %,.%,.%;与假手术组比较,缺血/再灌注组、缺血/再灌注后假刺激 组和缺血/再灌注后小脑项核刺激组死亡率明显增高.。缺血/再灌注组与 与缺血/再灌注组与假刺激组比较,小脑项核 假刺激组比较无显著差异., 刺激组死亡率显著减低.,小脑项核刺激能明显降低缺血/再灌注后大鼠死 亡率见表,图。 表各组大鼠死亡率统计% . 卯 卯 瓜 如 加 加 秒 大鼠死亡率 . /,。.. 图各组大鼠死亡率统计%. % .神经功能综合评分 正常对照组和假手术组大鼠活动正常,无任何神经功能缺损。缺血/再灌注组、 假刺激组和小脑项核刺激组大鼠缺血再灌注后,均出现左侧肢体偏瘫,提尾倒悬 时,左侧前肢紧贴胸壁,行走时向左侧旋转或倾倒;严重的不能自发行走,意识 重庆医科大学博士研究生学位论文 不清,左侧肢体瘫痪进行性加重,甚至出现死亡。各时间点,正常对照和假手术 组神经功能综合评分均为满分,无显著差异.,缺血/再灌注组、假刺激组 和小脑项核刺激组神经功能缺损评分均低于正常对照和假手术组,差异有显著性 .。术后、和,缺血/再灌注组和缺血/再灌注后假刺激组比较神 经功能缺损评分无显著差异.;与缺血/再灌注组和缺血/再灌注后假刺激组 比较,缺血再灌注后小脑项核刺激组神经功能缺损评分明显升高,差异有显著性 .,电刺激小脑项核脑能明显提高缺血/再灌注大鼠神经功能缺损综合评分 见表,图。 表各组大鼠神经功能综合评分 . 打 侣 ? 豳 圈/ 住 团 口 ../ , 图各组大鼠神经功能综合评分 .重庆医科大学博士研究生学位论文 . ..脑组织含水量 两者比较无显著差异 正常对照组和假手术组病灶侧半球脑组织含水量均低,.;术后至,缺血/再灌注组、假刺激组和小脑顶核刺激组脑组织含 水量明显升高,与正常对照和假手术组比较均有统计学差异.;缺血/再灌 注组和假刺激组脑组织含水量无明显差异.;术后、和,与缺血/ 再灌注组和假刺激组比较,小脑项核刺激组脑组织含水量明显下降,差异均 有显 著性.见表,图。 表各组大鼠不同时间点脑组织含水量% .% ? 圈 圈/ 圈 团 ./ ,。. 图各组大鼠不同时问点脑组织含水量% . %重庆医科大学博士研究生学位论文 .脑梗死体积 正常对照组和假手术组脑组织呈均匀红色,未见白色梗死区;缺血再灌注组、 假刺激组和小脑顶核刺激组缺血侧脑组织均可见整个大脑中动脉供血区呈 白色梗 死灶,左侧脑组织未见白色梗死区,呈均匀红色。缺血/再灌注组和假刺激组 梗死 体积比较无显著差异.,二组与小脑项核刺激组比较均有显著差异 .,小脑项核刺激组能明显减少脑梗死体积见表,图。 表各组大鼠不同时间点脑梗死体积 . ? 囡 豳/ 团 团. / /,。. 图各组大鼠不同时间点脑梗死体积.重庆医科大学博士研究生学位论文 讨论 .动物模型的选择 为了解缺血再灌注损伤的病理生理过程和临床治疗效果,制作类似人类脑缺 血/再灌注的动物模型已成为人们关注的热点。脑缺血再灌注模型主要分为 局灶脑 缺血/再灌注模型和全脑缺血/再灌注模型。研究显示,大脑中动脉区是人类 最常发 生脑梗死的部位,因此大脑中动脉梗塞模型是研究局灶脑缺血的理想动物模型。 与其它动物相比,大鼠脑血管解剖特点与人类最为接近,都是由颈动脉和椎.基底 动脉在脑底吻合成脑底动脉环来完成大脑供血,因此大鼠大脑中动脉梗塞模型也 被广泛应用来研究局灶脑缺血疾病研究。大脑中动脉梗塞模型重复度高,中动脉 梗塞部位较稳定;大鼠常规指标检测方便,脑体积小,易进行病理组织学观察及 脑组织免疫染色;同种大鼠近亲交配,品种纯;大鼠费用低、体重小、耐受性好、 易存活、饲养管理方便;生理功能和人类有许多相似方面。大脑中动脉梗塞模型 与临床脑梗死的病理生理过程较接近,已成为研究脑梗死病理生理变化和临床治 疗效果等的重要手段之一,得到了较大的发展。本实验实施者具有大脑中动脉线 栓法制作局灶脑缺血/再灌注模型技术,能在.内完成手术操作,而且手术过程 中出血量少,不损伤迷走神经及其它神经;制作的大脑中动脉缺血/再灌注模型缺 一血区范围稳定,出现相应神经精神症状和体征,术后大鼠易存活,为实验提供了 可靠的模型。 .小脑顶核刺激对局灶脑缺血/再灌注大鼠的保护作用 大鼠脑缺血/再灌注后进行神经功能缺损评分检查测定是评价脑缺血损伤轻重 的常用指标之一。大脑中动脉供血区涉及调控肢体运动的区域,动物术后清醒时 出现左侧肢体瘫痪、行走向左旋转等神经功能缺损。缺血/再灌注组、缺血/再灌注 后假刺激组和缺血/再灌注后小脑顶核刺激组三组的大鼠神经功能综合评分较正常 对照组和假手术组均有降低;缺血/再灌注组、假刺激组神经功能综合评分下降最 明显,而小脑顶核刺激组神经功能综合评分明显高于缺血/再灌注组和假刺激组, 差异均有统计学意义,显示电刺激小脑顶核可提高脑缺血/再灌注大鼠神经功能综 合评分,小脑顶核刺激可改善局灶性脑缺血/再灌注损伤大鼠的神经功能障碍。结 合本实验组?和国内外研究表明,电刺激小脑项核可能通过下列机制达到脑神经 重庆医科大学博士研究生学位论文 保护作用:?降低血清一氧化氮合酶及其产物白细胞介素和细胞粘附因子的含 量达到抗炎症作用。?促进血清抗凋亡蛋白一的表达及抗凋亡蛋白 ?/含量抑制细胞凋亡【。?升高超氧化物歧化酶活性及总抗氧化能力, 同时减少氧自由基的生成,降低脂质过氧化物丙二醛含量。?增加缺血区的局 部脑血流,改善微循环,并在刺激期间维持较高的水平,防止缺血半暗区神 经元的迟发性和继发性损害,不增加局部代谢,改善脑损害】。?降低缺血灶 周围组织细胞兴奋性,延长通道开放时间,升高神经元细胞膜静息电位, 使大脑皮质神经元兴奋性下降,抑制缺血灶周围电活动,起到脑保护作用。 ?电刺激促进小脑项核乙酰胆碱能神经递质释放,减少缺血半影区神经元死亡数 目而保护神经元等。?本研究也显示,电刺激小脑项核能改善神经功能缺损,降 低缺血侧脑组织中脑含水量,缩小脑梗死体积。 脑水肿是脑缺血/再灌注后继发性损伤的重要因素,是缺血性脑血管病患者急 性期死亡的一个重要因素。脑水肿分为血管源性、细胞性、渗透压性及脑积水性 脑水肿四类。脑水肿主要由于神经细胞钙超载、脑血管微循环障碍、血.脑屏障受 损、自由基生成、脑细胞代谢不良、颅内静脉压过高等引起。大脑中动脉缺血性 损伤脑水肿最早期为细胞毒性水肿,脑缺血引起神经细胞内钙过剩,自由基的大 量产生,线粒体等细胞器损伤,神经细胞能量供应不足,大量水份从细胞外渗透 到细胞内,导致细胞毒性脑水肿。缺血及缺氧数分钟后,缺血周围毛细血管内皮 细胞及其周围的神经胶质细胞开始肿胀,导致血脑屏障障碍、毛细血管通透性增 加,出现血管源性脑水肿。研究证明,缺血性脑水肿是大鼠脑缺血/再灌注的重要 病理环节,脑组织含水量是评价脑缺血损伤损伤的主要指标之一【。本实验显 示,缺血/再灌注组、缺血//再灌注后假刺激组和小脑顶核刺激组脑组织含水量均高 于正常对照组和假手术组,差异有显著性。术后、和,缺血再灌注组、假 刺激组和小脑顶核刺激组脑组织含水量均增加;但与缺血/再灌注组和假刺激组比 较,小脑顶核刺激组脑组织含水量明显下降。我们推测脑缺血/再灌注后可致血脑 屏障的损害,使血脑屏障通透性增加导致脑含水量高,给予小脑顶核刺激后可降 低脑含水量,表明小脑顶核刺激可有效降低脑缺血/再灌注后脑含水量,达到部分 改善局灶脑缺血/再灌注损伤的作用。其作用机理可能与脑血管的自动调节有关。 脑内存在一条从小脑顶核到大脑皮质的固有神经通路,主要通过脑干网状结构和重庆医科大学博士研究生学位论文 纹状体到大脑的血管舒张中枢,刺激小脑项核后,脑血管扩张,脑血流量增加。. 电小脑顶核刺激降低局部活性,使白细胞浸润减轻,从而减轻脑损害,部分 恢复脑血管的自动调节。电刺激后促进乙酰胆碱能神经递质释放增加,减少 半影 区神经元死亡数目,通过改善缺血半影区,尤其是早期再灌注血流量而保护神经 元结构,促进其功能恢复。 测量脑梗死体积也是评价脑缺血/再灌注脑损害程度常用的指标之一【”】。本实 验染色效果好,缺血区范围恒定。染色结果显示,正常对照组和假手术 组脑组织呈均匀红色,未见白色梗塞区;缺血/再灌注组、缺血/再灌注后假刺激组 和小脑项核刺激组右侧脑组织均可见大面积大脑中动脉供血区白色梗死区,左侧 脑组织未见白色梗死区,呈均匀红色。与缺血/再灌注组和假刺激组梗死体积比较, 小脑项核刺激治疗后梗死体积明显下降。结果与等【】报道电刺激小脑项核后 可缩小脑梗死体积一致,表明小脑项核刺激可缩小脑缺血/再灌脑梗塞体积,从而 达到改善局灶脑缺血/再灌注损伤的作用。本研究证明,电刺激小脑项核可以缩小 脑缺血/再灌注脑梗塞体积。我们推测电刺激小脑项核能使脑内固有的神经通路受 刺激,从而通过脑循环和脑血管自动调节机制相互的作用增加半影区的脑血流。 梗死灶周围区域的稳定增加,使缺血半影区得以再灌流,减少梗死体积。 .电刺激小脑顶核临床应用前景及展望 目前,利用该原理研制的小脑电刺激仪采用仿生物电流,在枕后乳突进行电 刺激,通过对小脑顶核的刺激作用,发挥中枢神经保护作用【】。通过电刺激小脑 顶核治疗可改善局部脑血管微循环,减轻神经毒性损伤,保护脑组织结构,促进 神经功能恢复,部分改善缺血/再灌注损害。本研究也观察到,电刺激小脑顶核可 改善局灶脑缺血/再灌注损伤大鼠的神经功能障碍,降低脑缺血/再灌注后脑含水 量,缩小脑梗塞体积,表明电刺激小脑项核对脑缺血/再灌注损伤有确切神经保护 作用。随着对电刺激小脑顶核的神经保护作用机制的认识逐渐深化,目前,该治 疗仪己开始广泛应用于临床,并已显出很好的治疗效果【碰】。推广电刺激小脑顶 核治疗脑缺血损伤,具有十分广阔的前景,同时为改善中枢神经系统的其它损伤 性疾病后神经功能的恢复开辟了新的前景。 参考文献 ?卫生部令第号.医学实验动物管理实施细则【】.中国卫生法制,, :?. , 】 , . . ., ,:. 【】 . , , . ,。 :一. 【】罗勇,董为伟.大鼠插线法局灶性脑缺血/再灌注模型的实验研究】. 重庆医科大学学报,,:.. , 【 , ., : 】. , ,:.. . 】罗勇,董为伟.扩布性阻抑与脑缺血【】.生理科学进展,,:? 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