林蛙油的雌激素样作用研究

林蛙油的雌激素样作用研究 现代食品科技 Modern Food Science and Technology 2015, Vol.31, No.8 林蛙油的雌激素样作用研究 康岚，李娜，姜大成 (长春中医药大学,吉林长春 130117) 摘要:本文探讨了林蛙油对生长、激素水平及性腺激素受体表达的影响。采用雌性昆明小鼠24只，随机分为高剂量组、低剂量组和空白组。给药组灌胃林蛙油，空白组灌胃生理盐水。给药结束后，取各组小鼠的卵巢、子宫及肾上腺称湿重，并对其组织切片进行了病理形态学观察，取血清测激素水平。利用Western BlotTβR?及TβR?的表达。林蛙油对雌性小鼠体重、子宫湿重、卵巢湿重及肾上腺湿重均无显 1 著影响，血清内E2及P)，FSH的含量显著增加(p关键词: 林蛙油;激素水平;FSHR;TβR?;TβR? 文章篇号:1673-9078(2015)8-25-30 (Changchun University of Traditional Abstract:administration of oviductus ranae, and the control received intragastric wet weight of the ovaries, uterus, and adrenal glands were measured and for Hormone levels in the serum were measured by chemiluminescent immunoassay (CLIA), of hormone receptor (FSHR), Type ? Transform growth factor β receptor TβRI), and TβR2 and P (p Type I Transform growth factor β receptor (TβR I); TβR II KANG David)林蛙油中含有甾体类激素，王春林等[1][2]报道， 林蛙油中含雌二醇52.3?5.89()，孕酮187.9?19.4(pg/100 mg)。雌激素在极低的浓度下就可起作用，它对肌体的代谢、 收稿日期:2014-10-11 基金项目:吉林省教育厅“十二五”科学技术研究项目(吉 教科合字2013第81号) 作者简介:康岚(1989-)，女，硕士研究生，研究方向: 中药质量控制与标准化研究 通讯作者:姜大成(1959-)，男，教授，研究方向:中药 2 资源与鉴定 生长、发育、繁殖、性欲和性活动等起重要的调节作 用[3]。研究表明，雌激素水平低下是更年期综合征的始发原因。性激素六项检查是妇女在临床检查中的常规基础检查，即通过测定卵泡生成激素(FSH)黄体生成激素(LH)、雌二醇(E2)、孕酮(P)、睾酮(T)、催乳激素(PRL)六项指标来了解女性内分泌功能和诊断与内分泌失调等相关疾病。本实验采用最大给药剂量对正常雌性小鼠生长、性器官、性激素水平及FSHR、TβR?及TβR?蛋白表达变化进行考察，进而探讨林蛙油的雌激素样作用。很多文献研究表明植物性激素如黄豆、葛根等，对机体没有致肿瘤的作用，非植物性激 25 现代食品科技 Modern Food Science and Technology 2015, Vol.31, No.8 素对人体致肿瘤作用机制研究尚不明确，现代医学治疗主要采用雌激素替代疗法(HRT)，虽然临床疗效受到肯定，但易导致子宫内膜癌、乳腺癌等潜在的危险。FSHR(Follicle-stimulating hormone receptor)为卵泡刺激素受体，在女性体内，FSHR可影响卵巢颗粒细胞生长并产生雌激素，调节性腺生长和分泌，促使选择优势的卵泡及退还非优势的卵泡。FSHR突变可使女性腺体封闭，影响卵巢的发育，造成内分泌功能的紊乱[5]。TβR?(Type ? Transform 3 growth factor β receptor)为转化生长因子TGF-β?的受体，TβR?(Type ? Transform growth factor β receptor)为转化生长因子TGF-β?的受体，其可存在于子宫内膜细胞组织中。本实验通过对小鼠子宫、卵巢及肾上腺蛋白组织FSHR、TβR?和TβR?蛋白表达水平的变化，进而了解林蛙油对机体的致肿瘤作用，可为临床研究提供重要的理论意义。 [4] 1.2 实验方法 1.2.1 林蛙油灌胃溶液的制备 将林蛙油研磨粉碎后过10目筛，由于林蛙油的膨胀度大于55，为保证灌胃溶液的稀释程度，因此精密称取林蛙油粉末0.32 g，分别加入288 mL和72 mL蒸馏水，在35 ?烘箱内温水泡发3 h，制备成混悬液，给药剂量分别为0.05 g(生药)/kg和0.20 g(生药)/kg，置于4 ?保存，备用。 1.2.2 动物分组及给药 取昆明小鼠24由摄食和饮水，体重为(22?。机分为3(和0.20 g(生药)为20 mL/(kg?d)给药37 d 1 与方法 1.1 实验材料 1.1.1 动物 昆明小鼠24只，雌性，6~7周龄未孕，体重为(22?2)g格证为:SCXK(吉)2003-0004。 次，。 4 h后，采用断颈法处死小鼠，立即 脏器指数 脏器重量(mg)/体重量(g)。 1.1.2 试药与仪器 司;兔抗人FSHRβ-acting抗体，美国BD美国BD?抗体，美国BD有markerkD)，上海江 型西门子全自动化学发光免疫XTZ03型生JJ300型电子天平，常熟市双杰测试仪器厂;HH-4数显恒温水浴锅，江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司;全自动雪花制冰机，上海比朗仪器有限公司;RM-220实验室专用超纯水机，四川沃尔特科技发展有限公司;TS-8水平摇床，海门市其林贝尔仪器有限公司;GZX-9140MBE数显鼓风干燥箱，上海博迅事业有限公司。 26 性激素水平的检测 于末次灌胃2 h后摘除眼球取血1.5 mL，至离心机中3500 r/min离心15 min，取上层血清用雌二醇、孕酮、催乳素、卵泡刺激素、睾酮及促黄体生成素测定试剂盒(直接化学发光法)，按试剂盒说明书操作，通过Advia Centaur/XP型西门子全自动化学发光免疫分析仪测定雌二醇、孕酮、催乳素、卵泡刺激素、睾酮及促黄体生成素的含量。 1.2.6 肾上腺、卵巢和子宫组织切片的病理形态学观察 取小鼠新鲜的肾上腺、卵巢和子宫组织制作冷冻切片，做 5 HE染色，生物显微镜10×10下进行大体形态学观察。 1.2.7 子宫、卵巢及肾上腺组织FSHR、TβR?和TβR?的蛋白表达 采用Western Blot方法检测到高剂量组和空白组小鼠子宫、卵巢及肾上腺蛋白组织中FSHR、TβR?及TβR?蛋白表达水平，经过凝胶成像，在TDF-2000数字医学图像分析系统半定量比较平均灰度值，与空白组小鼠蛋白组织比较。 现代食品科技 Modern Food Science and Technology 2015, Vol.31, No.8 1.2.8 数据统计学处理 所有数据用SPSS数据分析系统进行处理，结果用(x?s)表示，采用t检验比较组间差异。 由图1可知，林蛙油给药组和空白组小鼠体重在一个月中均呈现增加的趋势，林蛙油给药组小鼠的体重在前两周增重明显，后期给药组和空白组小鼠体重 的增加不明显。表1表明长时间大量给药林蛙油对正常雌性小鼠体重没有显著影响。 表1 各组小鼠体重的比较(x?s,n=8) Table 1 Changes in body weight of mice in different groups 组别 给药剂量(g/kg) 2 结果与讨论 2.1 体重的变化趋势 6 ?s 。性小鼠血清内T的含量显著性增加(p人体内具有雌性激素活性的物质有多种，一般认 为E2是卵巢的卵泡分泌的真正激素，主要功能是促使子宫内膜转变为增殖期和促进女性第二性征的发育，血清E2测定对评价各种月经异常是非常重要的指标，如女孩青春期提前或延迟，原发性或继发性闭经、卵巢早衰等[7]。FSH和LH是由垂体前叶嗜碱性细胞分泌的一种糖蛋白激素，其中FSH的主要功能是促进卵 2.4 肾上腺、卵巢和子宫组织病理形态学观察 27 现代食品科技 Modern Food Science and Technology 2015, Vol.31, No.8 常，这就很可能导致卵巢功能不全，因此FSHR是卵巢早衰的候选基因，在很大程度上可能导致卵巢的早衰，从而影响生殖功能。转化生子因子β作为一类重要的生长抑制因子，可以调节细胞分化、生长的功能，在国内外肿瘤发病机制的研究中引起很大的重视[15]。其中TβR?被认为是一种新的抑癌基因，可以抑制肿瘤细胞逃逸TGF-β?的生长，减弱恶性肿瘤的增殖能力[16]。相关报道表明，TGF-β?与TβR?的阳组织均有TGF-β?与TβR高，呈现一致性，且TGF-β[17]TβR进展成负相关，TβR晚期[18]。3及图4所示， 7 FSHR的FSHR表达的灰度值p [13~14] 图2 小鼠的子宫、卵巢及肾上腺组织病理切片观察(HE，10 ×10) Fig.2 Uterus, ovary and adrenal tissue in mice (HE, 10×10) 如图2所示，林蛙油高剂量给药组小鼠的子宫壁较空白组和低剂量组的子宫壁厚。林蛙油给药组小鼠卵巢组织和空白组卵巢中卵泡数目均较多，但高剂量给药组小鼠卵巢组织中闭锁卵泡的数目大于空白组及低剂量组。高剂量给药组小鼠肾上腺组织的中间髓区较空白组及低剂量组的肾上腺髓区明显缩小，且高剂量给药组小鼠肾上腺组织中网状带比例明显大于空白组及低剂量组。因此长时间大剂量给药林蛙油可能会。肾及雄激素等 2.5 、TβR?和TβR?的蛋白表达 在欧洲很多国家，如比利时、希腊等，都报道了FSHR基因的异常使得促性腺激素水平的变化[12]，FSHR的缺陷会导致受体结合FSH以及信号传导的异 28 8 的蛋白表达 图3 小鼠子宫、卵巢及肾上腺组织中FSHR、TβR?和TβR? Fig.3 Uterus, ovary, and adrenal tissue levels of FSHR, TβRI and TβRII protein expression in mice 注:1:高剂量组子宫蛋白组织;2:空白组子宫蛋白组织;3:高剂量组卵巢蛋白组织;4空白组卵巢蛋白组织;5:高剂量组肾上腺蛋白组织;6:空白组肾上腺蛋白组织。 现代食品科技 Modern Food Science and Technology 2015, Vol.31, No.8 对小鼠体重及性器官湿重影响不显著，可在一定程度上提高机体内的E2、T、FSH和P激素水平，改善下丘脑-垂体-性腺轴激素水平，提高机体的生殖能力。一个健康的成年女性，自身都有分泌雌激素的功能，并保持着微妙的平衡。雌激素的安全性，一直是备受争议的话题。很多科学家发现，雌激素可以增加妇科肿瘤的发病率，但是也有一些科学家认为长期服用雌激素，不能引发妇科肿瘤。但是美国政府的FDA公 告称[22]20%蛋白R?及R?蛋白 9 参考文献 ,中药通报,1985,10(2):44 WANG Li-lan, JIANG Yan-gong. effects of steroid hormone in oviductus ranae [J]. Chinese Traditional [2] 林 纪娴,于中泽,廖静华,等.中国林蛙与中华大蟾蜍输卵 管几种脂溶性维生素的比较分析[J].中药材,1991,14(12): 11-12 LIN Ji-xian, YU Zhong-ze, LIAO Jing-hua, et al. Rana and bufo gargarizans tubal comparison and analysis of several kinds of fat soluble vitamins [J]. Chinese Herbal Medicine, 1991, 14(12): 11-12 [3] Yusuf S, Anand S. Hormone replacement therapy:a time for paus [J]. Can. Med. Assoc. J., 2002, 167(4): 329 [4] Dimitris Loutradis, EP Vassilis Minas, et al. FSH receptor genepolymorphisms have a role for different ovarian response tostimulation in patients entering IVF/ICSI-ET programs [J]. Journal of Assisted Reproduction and Genetics, 2006, 23(4): 177-184 [5] Victoria Sundblad, VAC Maria Eugenia Escobar, et al. Screening of FSH receptor gene in argentine women with 10 premature ovarian failure (POF) [J]. Molecular and Cellular Endocrinology, 2004, 222: 53-59 [6] 周立花,李汶,卢光琇.FSHR、LHR基因突变与多态对女 性生殖的影响[J].现代生物医学进展,2010,10(1): 186- 187 29 图4 、TβR?及RFig.4 Uterus, ovaryTβ注:1:空白组子 宫蛋白组织;345:高剂 3 结论其中包括基因素等等，相对比西方发达国家，我国 妇科肿瘤的发病率还是比较低的，但是近年来发病率有增高 的趋势 [19] 。国外大量试验表明，植物性雌激素不存在引起妇科生殖 肿瘤的潜在风险，而动物性雌激素对妇科肿瘤的致病风险尚 不明确[20~21]。本试验试在探究长时间大剂量给药林蛙油对 对小鼠激素体重、性器官湿重及激素水平的影响，结果表明 长时间大剂量服用林蛙油， 现代食品科技 Modern Food Science and Technology 2015, Vol.31, No.8 ZHOU Li-hua, LI Wen, LU Guang-xiu. FSHR, LHR gene mutation and polymorphism on female reproductive effects [J]. Progress in Modern Biomedicine, 2010, 10(1): 186-187 [7] 林守清,林萍,姜玉新,等.绝经后卵巢和子宫萎缩及血雌 11 二醇降低的观察[J].中华妇产科杂质,1997,32(9): 524- 527 LIN Shou-qing, LIN Ping, JIANG Yu-xin, et al. Observation of ovarian and uterine atrophy and blood estradiol decreased after menopause [J]. The Department of Obstetrics and Gynecology impurities, 1997, 32(9): 524-527 [8] 蔡德培,张炜.补肾中药对下丘脑GnRH、垂体FSH、 LH 及成骨细胞BGP基因表达的调节作用[J].中医杂质, 2002, 43(3):221-223 CAI De-pei, ZHANG Wei. Kidney tonifying herbs on hypothalamic pituitary GnRH, FSH, LH and expression of BGP gene of bone cells [J]. Chinese Medicine Impurity, 2002, 43(3): 221-223 [9] 余晓星,吴群英,黄俊,等.电针对老年雌性大鼠血清睾 酮、雌二醇和孕酮浓度的影响[J].上海针灸杂质,2005, 24(9):37-39 of Electroacupuncture on aged [10] 尤劲松,胡随 瑜.[J].(YOU Jing-song, and 487-490 [11] ,,.[J].中国中西医结合杂GUI WEI Mei-juan, et al. Experimental pituitary adrenal androgen effect on [J]. The Combination of Traditional Chinese and Western Medicine China Impurities, 1997, 17(12): 735-738 [12] Kenji 12 Takakura KT, Hua-Qin Wang, et al. Follicle-stimulating hormone receptor gene mutations are rare in Japanese women with premature ovarian failure and polycystic ovary syndrome [J]. Fertility and Sterility, 2001, 75(1): 207-209 30 [13] Maria Beatriz da Fonte Kohek MCB, Alan J Russell, et al. No evidence of the inactivating mutation (C566T) in the follicle-stimulating hormone receptor gene in Brazilian women with premature ovarian failure [J]. Fertility and Sterility, 1998, 70(3): 565-567 [14] Piestrzeniew icz-Ulanska D, Brys M, Semczuk A, et al. TGF-beta signaling is disrupted in endometrioid-type endometrial carcinomas[J]. Gynecol Oncol, 2004, 95(1): 173-180 [15] Parekh T Vgrowth factor beta signaling human endometrial of growth [J]. 13 62(10): 2778-2790 [16] 刘贵鹏,,,等和[J].中国现代医学杂志LIU Shu-lan, SHU Hong, et al. The of beta of trβii in endometrial precancerous lesion and its clinical ,,王惠兰,等.转化生长因 子β1及其受体与子 [J].现代妇产科进展,2001,10(2):111-113 ZHAO Xin, MA Shu-fen, WANG Hui-lan, et al. To investigate the occurrence and clinical pathological parameters between transforming growth factor β1 and its receptor in endometrial carcinoma [J]. Advances in Modern Obstetrics and Gynecology, 2001, 10(2): 111-113 [18] Wang J, Sun L, Myeraff L L, et al. Demonstration that mutation of the type?TGF-βreceptor error-positive colon carcinoma cells [J]. J. Biol. Chem., 1995, 270(37): 22044-22049 [19] Keen J, Davidson N. The biology of breast carcinonma [J]. Cancer, 2003, 97: 825-833 [20] Russo I, Russo J. Role of hormones in mammary cancer initation and progression [J]. J. Mannary Gland Biol. Neoplasia, 1998, 3: 49-61 14 [21] Missmer S, Eliassen A, Barbieri R, et al. Endogenous estrogen, androgen and progesterone concentrations and breast-cancer risk among postmenopausal women [J]. J. Natl. Cancer Inst., 2004, 96: 1856-1865 [22] JERossouw, Anderson G, Prentice R, et al. Risks and benefits of estrogen plus progestin in healthy 现代食品科技 Modern Food Science and Technology J. A. M. A., 2002, 288(3): 321-333 2015, Vol.31, No.8 postmenopausal women: principal results From the Women’s Health Initiative randomized controlled trial [J]. 31 百度搜索“就爱阅读”,专业资料,生活学习,尽在就爱阅读网 92to.com,您的在线图书馆 15