血清甘油三酯的测定方法与标准化研究最新进展

血清甘油三酯的测定方法与标准化研究最新进展 血清甘油三酯的测定方法与标准化研究最 新进展 ? 454?Q堡旦筮鲞篮Al2005. v0l28.N4 血清甘油三酯的测定方法与标准化研究最新进展 鄢盛恺夏良裕 血清甘油三酯/三酰甘油(TG)是一项重要的临床血脂 常规测定指标,特别是随着对其致动脉粥样硬化(AS)作用 研究的深入,TG作为冠心病的一项独立危险因素13益受到 重视[1-3].但是目前血清TG测定及其临床应用尚存在很多 问题,如生物学变异,游离甘油对测定的影响,测定的标准化 系统不完善等等.本综述仅对TG的生物化学,测定方法与 标准化,临床意义等方面的近况作一简述. 一 ,TG的生物化学 TG又称中性脂肪,由3分子脂肪酸和1分子甘油酯化 而成,是体内能量的主要来源.TG处于脂蛋白的核心,在血 中以脂蛋白形式运输.除TO,外周血中还存在甘油二酯,甘 油一酯(两者总和不足TO的3%)和游离甘油(FG).各种 脂蛋白中,乳糜微粒(CM),极低密度脂蛋白(VLDL)及其残 粒中TG含量高,统称为富含TG脂蛋白(TRL),也称残粒样 脂蛋白(HEr).越来越多的临床与实验证据提示,TRL在病 因学中扮演重要角色,可能作用于AS病变早期l4.TG的 代谢可分为外源性和内源性两条途径.外源性途径指食物 中的TG在小肠内水解成脂肪酸和甘油一酯,二酯后由肠黏 膜吸收入细胞,再合成TG并与其他脂质形成CM,通过淋巴 系统入血.CM中的TG在脂蛋白脂酶(LPL)作用下水解为 甘油和游离脂肪酸(FFA),被细胞利用或贮存.高脂饮食后 3,6h,血液中CM相关的TG达到峰值,脂肪的吸收速度因 食物中脂肪的成分及个体差异而不同.内源性代谢途径指 CM水解产物——CM残粒以受体介导的形式被肝脏吸收, 其衍生物和一些新组分合成VLDL.与CM水解类似,VLDL 分泌到血液后被IJPL水解成残粒,其中部分直接被肝吸收, 分解,另一部分继续水解形成中间密度脂蛋白(IDL),最后 生成LDL.VLDL的合成与水解受多种因素调节,包括底物 利用率,激素状态,水解酶的活性及一些特殊载脂蛋白辅因 子的活性. 二,TG测定的方法学 血清TG测定方法一般可分为化学法,酶法和色谱法3 大类引.早期测定方法是以总脂质与胆固醇和磷脂之差估 算.化学法用有机溶剂抽提标本中的TG,去除抽提液中磷 脂等干扰物后,用碱水解(皂化)TG,以过碘酸氧化甘油生成 甲醛,然后用显色反应测甲醛.比较准确的是二氯甲烷一硅 酸.变色酸法(VanHandel—Caslson法),此法抽提完全,能去 作者单位:100730中国医学科学院中国协和医科大学北京协 和医院检验科 ? 国内夕卜进展. 除磷脂及甘油干扰,变色酸显色灵敏度高,显色稳定,至今还 是美国疾病控制与预防中心(CDC)的内部参考方法.但因 操作步骤繁多,技术要求高而不适于临床常规应用.核素稀 释/气相色谱/质谱技术(ID/GC/MS)主要用作参考系统中 决定性方法的建立及参考物质的制备与定值,此法费用昂 贵,样品处理复杂,难以推广应用. 目前几乎所有的临床实验室都用酶法检测血清TG水 平,虽然方法各异,但一般都包括3个基本步骤口l6l7]:用最 合适的LPL水解TG生成甘油和FFA;接着是转化,该步骤 一 般只用一种酶,例如甘油激酶,将甘油磷酸化以进行下一 步反应,或者生成中间待测物;最后是有色染料(常为醌亚胺 等)或者紫外吸收物质的形成,再通过分光光度法计算相应 的TG浓度.如脂蛋白脂酶.甘油磷酸氧化酶一过氧化物酶. 4.氨基安替比林和酚法(GPO—PAP法)等.此法具有简便快 速,微量,精密度高的优点,且特异性强,易于达到终点,线性 范围宽.用一步法测定的是血清总甘油酯(定义为TG和 FG及少量甘油二酯,甘油一酯之和,习惯统称为TG).为了 消除FG的干扰,中华医学会检验分会曾推荐GPO—PAP法的 两步酶法作为血清TG常规测定方法"J,该法不增加试剂成 本和工作量,适合自动化分析,由于试剂分成两部分加入,对 正确设置测定有较高要求.对此法能否去净游离甘油 近来中华医学会检验分 方面有人提出质疑.针对这一情况, 会在《关于临床血脂测定的建议》文件中建议酶法如GPO— PAP法作为临床实验室测定血清TG的常规方法.普通临 床常规实验室可采用一步GPO—PAP法,有条件的实验室(如 三级以上医院)应考虑开展游离甘油的测定"J. 血清FG对TG测定结果的影响是临床十分关注的问 题.国外资料显示,正常人体FG含量为0.06,0.22mmol/ L,约占总TG的6%,14%J.国内结果与此相近,我国正 常人FG水平平均约为0.08mmol/L (0.02,0.33mmol/L),约占总TG7.19%(0.81%, 21.64%).虽然临床标本中FG显着升高者很少见,但有些 异常或病理情况下如应激反应(肾上腺素激活u'L促进体 内脂肪水解),剧烈运动,服用含甘油的药物如硝酸甘油,静 脉输入含甘油的营养液,肝素治疗,某些严重的糖尿病,肝病 与肾病,取血器材或试管塞上带有甘油等时,可见血清FG 显着升高,并给临床决策带来误导.因此,可采取测定 "真"TG的方法减少其影响:一种是同时测定总甘油和FG, 两个结果的差值反应了真TG浓度(外空白法),另一种是用 上文所述的两步酶法直接测定TG(内空白法).前者国内 堡筮垫鲞墓翅ChinJLabMed.April2005.V0128.N0.4 外应用较少,后者国外(如日本)使用较多,目前国内已有许 多临床实验室开展. 对于FG空白的设置建议采取如下措施[3]:(1)临床实 验室应备有可以做FG空白的检测系统,在任何情况下都可 以做FG空白;(2)TG单中应标明是否为FG空白结果, 实验室应告知临床医生FG空白的意义;(3)临床及基础研 究,参加CDC脂质标准化计划的实验室都要做FG空白; (4)住院病人中内源性甘油过高群体的标本都应做FG空 白;(5)体检及门诊患者可以不做FG空白,但糖尿病或其他 特殊门诊例外;(6)FG>2.3mmol/L者最好做FG空白;(7) 对某些可疑情况.如TG高而血清不混浊应排除高FG的可 能.一些物质如抗氧化物质(维生素c等),黄疸,溶血,脂 血等对酶法测定TG有干扰,可采用设置血清空白予以消 除. 在应用自动生化分析仪进行临床常规TG测定时.还要 特别注意交叉污染和基质效应对测定的影响J.最易对TG 测定产生交叉污染的是总蛋白和铁试剂,因其还原物质浓度 可影响Trinder反应.如果接着TG测定直接胆红素,也会因 表面活性剂的导入产生误差.铁测定对TG的影响与亚铁 氰化钾的量有关.此外,还要注意常规酶法测定TG对制备 物的基质效应.Holani等用24份新鲜血清为对照.对5 份CAP制备的冻干血清及9份CDC冰冻混合血清进行了评 价.以3种商品TG酶试剂测定,以CDC参考方法为对比方 法,校正游离甘油后,2种商品试剂对CAP及CDC血清均无 基质效应,另一种商品试剂对4份CAP血清有基质效应. 也有资料表明,各种质控血清中FG占TG的12%一85%. 近来我们的研究也发现,目前临床使用的各种TG检测试剂 盒,不同的测定/校准系统,质控血清之间存在明显的基质效 应,因此对于不同方法/试剂的选择,如选用两步酶法试剂和 质控物时要注意其反应的通用性与适用性. 三,生物学变异和分析前变异对TG测定的影响 TG测定的结果受取样时个体生物学变异(c)和分析 不精密度(c)的影响.一般情况下,c相对较小(约 为3%),而c占总变异的90%多J.即使严格按美国胆 固醇教育计划(NCEP)要求控制的个体,在2周内2次所测 的TG结果差异百分比约为胆固醇的5倍,75%以上的个体 在两周内的变异大于1O%.李健斋等研究发现,我国人 群血清TG个体间变异为28%,居所有血脂项目之首.国外 资料表明,空腹2.5个月的人群TG变异约25%,非空腹状 态的变异更大.日间约为6.3%一65%,月内为12.9%一 34.8%,1年为12.9%一39.9%,以上数据均为正常个体 稳定饮食状态的结果,某些病理状态下的波动会更大. 为减少上述变异对TG测定的影响,NECP建议受试者 在两个月内分次测定,两次间至少间隔l周,测定结果取均 值.但当血脂水平远离医学决定水平时,无需多次取样.标 本采集要求受检者在前3周内不改变饮食习惯,采血前至少 12h不进食,72h不饮酒.抽血后应尽快检测,某些含有高 ? 455? 活性LPL的标本,如用肝素治疗的病人标本,TG常会过度水 解.标本最好放在冰浴中,2h内分离血清.室温放置1d TG下降达34%.Eberly等..发现非空腹高TG血症的发 生明显多于空腹,而两种状态高TG血症所致冠心病的危险 基本相同,因此测非空腹1'G更有利于冠心病危险预测. 临床上常见到肉眼脂血标本,这常与一些潜在的错误有 关.其中之一是LPL水解TG时产生的"清除效应".在用 血清而非试剂作空白时,大颗粒TRL散射引起假性高基线 吸收.随着反应的进行,TG被水解,脂蛋白颗粒变小.浊度 也减小,总的效应是在吸光度上升(产生NADH)的反应 中,结果轻微偏低.这种误差所占比率较小,且只发生于高 浓度TG标本中,其误差通常是可接受的.另外,肉眼脂血 标本特别是CM含量过高者,由于CM漂到样品杯上层使标 本成为多相.因此,对于肉眼脂血标本,应充分混匀且尽快 检测.TG水解产生大量脂肪酸,特别是脂血标本,由于其浊 度和产物的抑制作用,对分析也有影响.在反应的缓冲液中 加入牛血清白蛋白或一环式糊精可以避免上述情况]. 四,TG测定的标准化 目前美国的TG测定的参考系统较为完善,其推荐的 决定性方法是由美国国家标准与技术研究所(NIST)建立的 ID/GC/MS法,以"c甘油三软脂酸酯为内标,可测总甘油 酯和"净"TG,一级参考物质为NIST的SRM1595(三软脂酸 甘油酯);参考方法为美国疾病预防和控制中心.国家心肺血 液研究所(CDC)的二氯甲烷.硅酸-变色酸法,一直被用作美 国CDC—NHLBI血脂标准化计划中的参考方法,该法用 Supelco的三油酸酯和NIST的三软脂酸甘油酯标准物质 SRM1595的2:1混合物作标准,测定值不仅是TG,还包括 (或部分包括)甘油二酯和甘油一酯.二级参考物质有NIST 的SRM1951a,CAPRM026及CDC的多种冰冻血清.此参考 方法步骤烦琐,实验室间进行方法学转移比较困难,目前 CDC拟对其进行改进,以期在胆固醇参考方法实验室网络 (CRMLN)建立一个结合提取,水解步骤的酶法作为"指定参 考方法".国内陈文祥等[123建立了高效液相色谱(HPLC)测 定总甘油和游离甘油的方法,测定总甘油酯的相对不精密度 小于2%,游离甘油小于4%,总甘油平均回收率100.0%, 游离甘油99.7%,与ID/GC/MS法相对偏差不大于?2%. 此法拟推荐作为我国TG测定的参考方法. 血脂测定标准化并非要求统一测定方法,而是要求实验 室测定结果达到所制定的技术目标.对于TG测定,目前国 内外要求不精密度(用CV表示)应不大于5%,不准确度 (用偏差表示)应不大于?5%,总误差应不大于15%.总 误差=偏差%+1.96c(与参考血清的靶值比较). 特别值得一提的是卫生部北京老年医学研究所血脂实验室 已于2002年3月被接纳CDC的CRMLN成员(全球共l2 家),在血脂测定的标准化方面积累了丰富的经验,我国TG 测定的参考系统正在建立之中. 四,TG测定的临床意义 ? 456? 测定血清rG水平主要用于了解机体内rG代谢状况, 高甘油三酯血症诊断和评价冠心病危险,代谢综合征的诊断 及应用Friedewald公式计算LDL-C水平等4方面目 的"3'"J.其中应用Friedewald公式计算LDL—C有3个前 提条件,结果的可靠性也受TG浓度的影响,随着直接检测 LDL—C的方法逐渐成熟,该公式应用越来越少. 由于种族,饮食等的差异,各国的分类水平也不尽相 同.如荷兰认为理想的TG浓度为<1.1mmol/L,在 1.1—4.0mmol/L范围内冠心病发生的危险增加,>4.0 mmol/L危险下降,极度升高则息胰腺炎危险高度增加.土 耳其的研究表明TG中等程度升高(即1.6,2.5mmol/L)时 冠心病危险增加.目前国内的划分标准为:合适TG水平? 1.69mmol/L;>1.69nu'nol/L为TG升高".NCEP成人治 疗专家组第3次报告(ATP?)将血清TG分为4个水平: >15.64mmol/L为极高,2.2—5.63mmol/L为升高,1.69, 2.25mmol/L为边缘性升高,<1.69n'u'nol/L为正常.ATPm 认为降低TG治疗比升高HDL—C更重要,将LDL加VLDL胆 固醇的和[定义为非HDL胆固醇](TC—HDL—C)=作为高 TG人群(?2.26mmol/L)治疗的第二靶标". TG增高主要见于家族性高甘油三酯血症,家族性混合 性高脂血症,冠心病,AS,糖尿病,肾病综合征,甲减,胆道梗 塞,糖原累积症,妊娠,口服避孕药,酗酒,急性胰腺炎(> 11.3nunol/L).高甘油三酯血症是否为冠心病的独立危险 因素?对于这一问题,以往学术界存在争议.一些研究发 现,在单因素分析中,TG水平上升与冠心病危险呈正相关. TG升高常伴随高密度脂蛋白胆固醇(HDL.C)降低,经多因 素分析修正HDL.C等其他危险因素后,TG与冠心病危险的 相关性在许多情况下会减弱或消失.但近些年许多大规模 流行病学和前瞻性研究分析显示,高TG也是冠心病的独立 危险因素,提示一些富含甘油三酯脂蛋白(TRLs)被认为是 致AS因素,TG和HDL—C一样,成为冠心病防治的目标之 一 .虽然继发性或遗传性因素可升高TG水平,但临床中大 部分血清TG升高见于代谢综合征".鉴于TG和冠心病 之间的关系,有必要对TG水平高低做出分类,为临床诊断 治疗提供依据. 虽然许多情况下TG水平升高对于心血管疾病的危险 评估所起作用不如胆固醇,但高甘油三酯血症也是冠心病的 生璺筮垫鲞筮塑ed,Aoril2005,Vol28.N4 独立危险因素,其对于代谢综合征的诊断具有重要的临床意 义.特别是还需注意的是,极高浓度的TG还可以导致急性 胰腺炎.因此,对于TG测定的方法学研究,尤其是建立适 合我国国情的TG测定的参考系统,开展标准化工作,收集 我国人群的TG资料,提出人群TG水平划分标准等是目前 亟须解决的问题. 参考文献 1鄢盛恺,执笔.关于临床血脂测定的建议.中华检验医学杂志, 2003,26:182—184. 2MillerM.Currentperspectivesonthemanagementof hypertriglyeeridemia.AmHeartJ,2000,140:232-240. 3ColeTG,KlotzschSG,MeNamaraJR.Measurementoftriglycefide concentration.In:RifalN,WarniekGR,DominiczakMH,eda. 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