大肠杆菌重组人干扰素α-2b的发酵

大肠杆菌重组人干扰素α-2b的发酵 大肠杆菌重组人干扰素α-2b的发酵 作者:丁少云 指导老师:江 诚 1000) (安徽医学高等专科学校，安徽合肥，23 摘要: 目的: 探索获得大肠杆菌的高密度发酵和高效表达分泌型重组人干扰素α-2b 的方法。方法: 通过小试研究获得大肠杆菌分泌型重组人干扰素α-2b 发酵的基本条件; 通过中试研究碳源、氮源等营养物质补加的方式;同时就单独补充碳源、分别补充碳源和氮源的两种不同的发酵方式进行对比分析。结果: 经优化后的发酵条件, 最终菌体的光密度可达A 600 = 70, 分泌型重组人干扰素α-2b 终产品为120 g? L - 1菌体, 平均比活性为2.2×108 IU ?m g- 1蛋白。结论: 获得了较满意的高密度发酵条件和重组人IFN α-2b 的高表达条件。 关键词:重组人干扰素α-2b; 大肠杆菌; 发酵 1.引言 干扰素α-2b (interferonα-2b, IFNα-2b) 是由165 个氨基酸组成的单链多肽, 理论 219, 由两对二硫键构成, 有一定空间结构, 其中29-138位的二硫键对于维持活分子量为19 性尤其重要[ 1 ] 。干扰素是最早通过基因工程技术表达的蛋白质之一。利用传统的胞内表达方法有一定的缺陷, 如蛋白始终以还原状态存在, 无法形成正确的三级结构。本课题组利用分泌型表达技术构建的IFNα-2b工程菌,使所表达的外源蛋白直接分泌于细菌的细胞间质中, 有利于蛋白质纯化; 同时, 所表达的蛋白同天然IFNα-2b有相同的一、二、三级结构, 因此有100%的生物学活性。本实验研究了大肠杆菌重组人IFNα-2b的发酵工艺,对比单独补充碳源、同时补充碳源和氮源的两种不同方式的发酵方法, 获得了较满意的高密度发酵条件和重组人IFNα-2b的高表达条件。 2.材料与方法 2.1 菌 种 工程菌为E .coli JM 101, 基因型F -m crA m crB IN (rrnD -rrnE ) lam da, 来自A T C C ;IFN α-2b cD N A 来自安徽农业大学免疫学教研室; 用于构建表达质粒的起始质粒P S T ?其结构包括碱性磷酸酶启动子(phoAprom oter)、翻译增强子序列、SD序列、S T ?信号肽序列、A m p 及T et抗性基因、复制起点。 2.2 发酵罐 B .B raun 5 L 发酵罐、A pplican 40 L发酵罐。 2.3 培养基 ?种子培养基: L B 培养基; ?筛选培养基(g? L - 1 ): 葡萄糖2 g、酵母粉1.2 g、蛋白胨15 g、N aC l 1.2 g 、N H 4 C l 0.96 g、M gSO 4? 7H 2 O0.494 g、调pH 至7.5; ? 发酵基本培养基(g? 10 L - 1 ) N aH 2 P O 4? 2H 2O 8.5 g、K 2 H P O 4 ?3H 2O 22.3 g、(N H 4 )2 SO 4 42 g、M gSO 4? 7H 2 O12 g 、葡萄糖10 g、酵母粉50 g、蛋白胨36 g、柠檬酸三钠9.65 g, 微量元素5 m L 。其中微量元素混合物成分: F e、C o、M o、Zn 、C u、M n、B 等; ?补料:a. 50% 葡萄糖(105?灭菌20 m in );b . 蛋白胨45 g,酵母粉14 g, 溶解于1 L 水中; c. 采用单独流加葡萄糖方法, 需在每升发酵基本培养基中另加入蛋白胨4.5 g, 酵母粉1.4 g。使用发酵罐培养时, 不应加入任何抗生素。 2.4 检测方法 通过SDS -P A G E 电泳, 并经V D S扫描仪分析IFNα-2b的表达量; 通过尿糖检测试剂 盒检测发酵培养过程中糖的变化; 中试发酵结果的研究采用低渗裂解方法,并通过SDS -P A G E 电泳法检测蛋白量; 对40L发酵罐中试结果的分析, 均采用统一的纯化工艺路线; 终产品检测方法及质量标准符合《中国药品生物制品检定规程》(2000 版) 有关。 2.5 大肠杆菌重组人IFNα-2b发酵基本条件 发酵基本条件的摸索采用摇瓶完成, 通过SDS -P A G E检测IFNα-2b表达量来决定发酵基本条件的优劣。小试实验条件相同: 划L B 平板(含Tet,37?培养过夜), 挑取单克隆, 接种于10 ml 液体培养基中(含Tet)。37?培养至A600 在1.5 左右, 分别进行下面的不同实验, 每组实验均采用筛选培养基, 接种量均为5% , 摇床转速220 r?min- 1 。 2.6 发酵培养周期 通过分泌型表达技术构建的工程菌, 结构中包括碱性磷酸酶启动子(phoAprom oter), 其特点是随着培养基中磷酸盐的逐渐消耗, 出现低磷酸盐条件时, 开始诱导表达分泌IFNα-2b。采用5 L 发酵罐和发酵培养基, 采用单流加葡萄糖补料, 并控制比生长速率。在37?、pH 7.0、保持溶解氧不低于30% 的发酵培养条件下, 确定IFNα-2b工程菌的发酵周期。 2.7 中试发酵工艺研究 中试发酵工艺是在5 L发酵罐结果基础上进行线性放大, 采用40 L 发酵罐进行研究。既往关于采用流加补料的形式获得相对高密度的发酵结果的研究已经很多, 故未将其列入, 而重点研究单补糖及补糖、补氮结合的流加方式的比较。将发酵工程菌划种L B 平板, 37?培养过夜, 挑单菌落, 接种于10ml L B (含Tet) 的三角瓶中, 37?培养至A600 = 1.0, 再在摇瓶中(含Tet) 放大培养至A600 = 2.0, 作为种子液。按5%接种量接种于发酵培养基中, 进行中试发酵。?连续流加葡萄糖方法补料: 控制罐压小于0.2 bar; 调节搅拌速度为200,1000 r?min- 1 ; 通气量始终保持溶解氧在30% 以上; 通过流加氨水控制pH = 7.0;通过糖检测试剂盒检测发酵罐中葡萄糖含量。当罐中原有葡萄糖被耗尽时,开始以2.5 g? L - 1? h- 1 的速度补充葡萄糖, 并逐步增加到8.5 g? L - 1? h - 1 ,此后一直保持在5 g? L - 1? h- 1 直至发酵终止。?连续流加葡萄糖及氮源方法补料: 补糖及检测方式同连续流加葡萄糖方法, 同时流加补料c, 进入稳定期前, 补料c 的流速为补糖流速的1/2, 进入稳定期后, 流速与补糖流速一致。 3.结果 3.1 发酵基本条件的确定 ? 温度对发酵结果的影响:取50ml 摇瓶(带机制档板),分别加入10ml表达培养基, 接入种子液, 分别放置于28?, 33?及37?培养(图1), 说明发酵最适温度为37?;?溶解氧对发酵结果的影响: 分别采用普通摇瓶及特制内部带有挡板的摇瓶对工程菌进行培养及诱导表达(特制内部带有挡板的摇瓶在同样转速下比普通摇瓶能提供更好的溶解氧, 图2), 表明高溶解氧有利于目标蛋白表达; ?pH 值对发酵结果的影响:取50ml摇瓶(带机制档板), 分别加入10ml表达培养基, 接入种子液, 培养基起始pH 值分别为6.0、7.0 和8.0 (图3), 表明发酵最适pH 值为7.0。根据上述结果, 本研究确定IFNα-2b发酵的基本条件: 温度37?, pH 7.0 左右, 保持较高的溶解氧, 有利于目的蛋白的表达及分泌。 3.2 发酵培养周期 根据摇瓶实验的结果,结合发酵其他分泌型工程菌的经验, 本研究确定的IFNα-2b 的发酵基本条件:温度37?, pH 6.5,7.5,溶解氧不低于30% 。在发酵过程中, 定时取样, 通过镜检监控大肠杆菌生长情况;通过SDS -P A G E 结果来确定表达开始时间及表达量, 初步确定IFNα-2b的发酵周期为22 h, 结果见图4。 3.3 中试发酵工艺 通过控制碳(C) 源、氮(N)源的流加速度, 很容易控制比生长速率, 减少有机酸的积累, 获得高密度发酵并使目标蛋白高表达,结果见图5和6。从多次中试发酵实验结果分析, 分别 补充碳源和氮源优于单补碳源, 结果见表1。经优化后的发酵条件, 光密度达A600 = 70, 重组人IFNα-2b 终产品为120g? L - 1 菌体, 平均比活性为2.2×108 IU ? m g- 1 蛋白。 4.讨 论 对一个有商业潜质的蛋白类药物的研究, 主要是要寻找一条稳定的工艺条件和获得较高的工作效率, 因此在高密度发酵过程中对培养基、补料方式及补料时机的选择就变得十分重要。通过分泌型技术表达的蛋白质, 采用流加葡萄糖的补料方式优于批发酵[ 3 , 4 ] 。但在实际发酵工作中, 对于不同的表达体系及不同的蛋白类型来说,面临的问题都不同。要求培养基的营养物质比例要恰当, 如碳氮比值(C /N )偏小, 菌体虽然生长旺盛但确会提前衰老自溶; 若C /N 偏大, 则菌体繁殖较慢, 代谢不平衡[ 4 ] 。因此在实际工作中, 实现高密度培养并高表达的报道较少。 Fig. 1 The expressions of IFNα-2b/W 3110 in differen ttemperatures(SDS -P A G E ) Lane 1 :Pro teinmarker;Lane 2: 2 8?;Lane 3 :3 3 ? ; Lane 4 :3 7? Fig .2 The expressions of IFN α-2b/W 3110 in different D O2 Lane 1: Pro teinmarker; Lane 2: Special conical flask ; Lane 3 :Normal conical flask Fig . 3 The expressions of IFNα-2b/W 3110 in different p Hvalu es Lane 1 :Pro tein Mark er; Lane 2 : pH = 6. 0 ;Lane 3: p H = 7. 0 ;Lane 4 :p H = 8 .0 ; Lane 5 :IF N α-2 b standard Fig .4 T h e expressions of IF N α-2b/W 3110 in differenttim e Lane 1 :1 h ou r;L an e 2: 4 h o u rs; Lane 3 : 8 h o u rs;Lane 4 :1 3 h o u rs; Lane 5 : 14 h ou rs;Lane 6: 1 7 h o u rs;Lane 7 :1 9 h o u rs; Lane 8 : 22 h ou rs;Lan e 9: IFN α-2b standard Fig . 5 T h e alteration o f pH -T of two different feedingm ethods Fig .6 T he alteration of A 600 -T of two differen t feedingm ethods 高密度发酵时表达量下降的原因可能与代谢副产物(主要是乙酸等有机酸) 的积累有关[ 2 ] , 而有机酸的积累又与葡萄糖的利用有关。但在发酵过程中,能量、营养物质的传递有一个过程, 而代谢另有一个过程, 这也是进入对数生长期的大肠杆菌的增长速度低于理论值的原因之一。而常规的检测方法,如采用糖指示剂方法检测发酵过程中葡萄糖含量, 不能及时反映葡萄糖的变化情况, 使补充的碳源和氮源滞后, 影响细菌的正常生长及代谢过程, 从而影响高密度发酵及蛋白质的表达。单纯的补充碳源,可能存在的问题是由于检测方法滞后, 不能及时补充能量。 细菌的正常生长,依赖于能量的平衡(C /N )。为保证能量的平衡, 需要在起始培养基中加入足够的含氮物质, 如常使用的酵母粉、蛋白胨、干酪素等。这类物质既可以作为氮源又可以为碳源, 在碳源缺乏时, 微生物可以将这些物质作为碳源使用, 发酵参数表现为pH值的剧烈变化。但是, 在发酵罐中一次性投入过多的氮源, 也较容易促使细菌生长过快和养分的过早消耗, 以致于菌体出现早衰而自溶[ 3 ] 。本研究初步确定了IFNα-2b的中试发酵工艺,该工艺能很好地克服上面的问题, 并可获得高密度的菌体及高表达的IFNα-2b。 参 考 文 献 [1] 吴梧桐, 丁锡申. 基因工程药物基础与临床[M] . 北京:人民卫生出版社, 1996:157-159. 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