p16mRNA在成釉细胞瘤中的表达
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文章编号1007—9564(2004)03—0272—02
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p16mRNA在成釉细胞瘤中的表达
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基础论着?
646000四川省泸州市,泸州医学院病理教研室龚莉陈照立蔡嫒刘来奎何志秀 关键词成釉细胞瘤;p16nfl~NA;原位杂交
摘要目的研究成釉细胞瘤中p16mRNA的表达及其临床病理意义方法应用原位杂交方法研究分析了47例成釉细胞瘤中
p16mRNA的表达及其与临床病理参数的关系..结果32例良性成釉细胞瘤中p16nLRNA的阳性表达率为71.9%(23/32),恶性成釉
细胞瘤中则为40O%(6/15),二者之间差异有统计学意义(P<005);p16nfl~NA表达与患者年龄,性别,肿瘤大小,部位无相关性(P
>0.05);在11例复发肿瘤和36例无复发肿瘤中,p16mRNA阳性表达率分别为364t{6(4/11)和694%(25/36),二者间差异有统计
学意义.结论p16基因mRNA表达缺失与成釉细胞瘤的发生发展有关 中国分类号R446文献标识码A
p16基因是新近发现的一个重要的多肿瘤抑制基因
(MTS1),是目前发现的唯一一个直接作用于细胞周期的抑
癌基因,调控着细胞周期的演进及细胞的生长分化,p16基因
的缺失,突变等异常可导致细胞恶性转化而发生肿瘤l_
但p16基因在成釉细胞瘤中表达的研究文献报道较少.本研
究应用原位杂交方法检测了p16基因mRNA在成釉细胞瘤
中的表达,并初步探讨了p16基因与临床病理因素之间的关
系.
1材料与方法
1.1材料47例成釉细胞瘤来自泸州医学院病理科和四川 大学口腔医院病理科的存档蜡块,其中良性成釉细胞瘤32 例,恶性成釉细胞瘤15例;复发病例11例,未复发36例同 时选取5例正常粘膜进行对照.
1.2试剂人pl6nLRNA原位杂交试剂盒(购自武汉博士德 生物工程有限公司):胃蛋白酶,预杂交液,p16寡核苷酸探针 杂交液,封闭液,生物素化鼠抗地高辛,SABC—POD,生物素 化过氧化物酶.
1.3方法原位杂交前将实验所需器皿,玻片进行灭活 RNA酶处理,液体试剂均以二乙基焦碳酸酯(I)EPC)水配制. 石蜡切片时以0.5‰IPC水浸泡切片刀,以灭活切片刀上 可能存在的RNA酶.实验的各个步骤亦注意避免RNA酶 污染.步骤如下:切片脱蜡水化,3cY0H灭活内源性过氧化 物酶,胃蛋白酶消化暴露mlCNA核酸片段后固定,预杂交,滴 加地高辛标记p16寡核苷酸探针杂交液,42?杂交过夜,2× 氯化钠街檬酸钠缓冲液(SSC),0.5×SSC,0.2×KSC洗涤, 加封闭液,生物素化鼠抗地高辛,SAN2,生物素化过氧化物 酶,3,3二氨基联苯胺(DAB)显色,苏木素复染,常规脱水,透 明,封片.用磷酸缓冲液(PBS)代替杂交液作阴性对照. 1.4结果判断pl6nLRNA阳性杂交信号为棕黄色,主要位 于细胞浆中.采用双盲法记数5个高倍视野,阴性(一):无杂 四川大学华西口腔医院病理科
交信号出现;弱阳性(+):杂交信号阳性细胞数<25%;阳性 (++):杂交信号阳性细胞数在25%,75%;强阳性(H+):杂交 信号阳性细胞数>75%
15统计学处理采用检验比较各组间阳性表达率差异 有无统计学意义
表1pl6mRNA在各组织学类型的表达(例)
表2pl6nLRNA表达与临床病理参数的关系(例) 2结果
2.1pl6mRNA表达的组织学类型正常V1腔粘膜中均见 pl6nLRNA阳性杂交信号,位于细胞浆中,呈棕黄色细颗粒. 在成釉细胞瘤中,阳性杂交信号主要位于外周柱状或立方状 细胞浆中,32例良性成釉细胞瘤中pl6mRNA阳性杂交信号 出现率为71,9%(23/32),15例恶性成釉细胞瘤则为40.0% (6/15),良,恶性肿瘤间pl6n~RNA表达差异有显着性(P<
中国煤炭工业医学杂志2004午箜!鲞笪.
0.05),见表1.
2.2p16mRNA表达与临床病理参数的关系成釉细胞瘤 中pl6mRNA表达与患者性别,年龄,肿瘤大小,部位无相关 性(P>0.05),但与肿瘤是否复发密切相关(P<0.05),见表
2.
3讨论
p16基因,也称为MTS1/CDKN2/p161NK4A,是新近发 现的与细胞周期相关的基因之一,其编码的p16蛋白可与细 胞周期素D1(cyclinD1)竞争性结合细胞周期素依赖性激酶 (CDK4/6),抑制Rb蛋白的磷酸化,从而抑制细胞的增殖 研究表明,pl6基因突变和缺失与多种肿瘤的发生发展密切 相关.郭山春等E3,用原位杂交技术检测了120例乳癌标本中 的pl6mRNA表达,pl6mRNA的阳性表达率为70.8%(85/ 120),近1/3病例mRNA低表达,p16mRNA表达情况与雌, 孕激素受体状态无相关性,但与乳腺癌的分级及转移有较明 确的关系,pl6mRNA未表达更多见于分化差或有淋巴结转 移的乳腺癌中.提示p16mRNA的异常表达对乳腺癌的演进 及最终使癌细胞获得转移的潜能产生重要作用.晁红霞等_4一
发现38例子宫内膜癌中有27例pl6mRNA表达下降或无表 达,占71.1%.p16基因甲基化与子宫内膜癌的发生发展有 关.在胃癌,肺癌,卵巢癌,口腔鳞癌等的研究中均证明这些 肿瘤的发生或发展与p16基因的突变或缺失有关l.成釉 细胞瘤是口腔颌骨内最常见的牙源性肿瘤,临床上具有侵袭 性,溶骨性生长,易复发,可恶变等特点,其发生机制仍不清 楚.王恩博等l10J测定了牙源性囊肿及成釉细胞瘤细胞核中 DNA含量,发现DNA增殖倍体含量较高,细胞增殖活跃,这 些可能是成釉细胞瘤具有局部侵袭性生长行为的基础.又有 学者研究表明,成釉细胞瘤中端粒酶催化亚单位(hTERT) mRNA有较高的表达,与成釉细胞瘤的临床生物学行为一 致…j.但有关pl6mRNA在成釉细胞瘤中表达的研究仍少 见报道.本研究应用原位杂交方法检测了47例成釉细胞瘤 中pl6mRNA的表达情况.正常121腔粘膜中pl6mRNA均呈 阳性杂交信号,在71.9%(23/32)的良性成釉细胞瘤中出现 pl6mRNA杂交信号,而在恶性成釉细胞瘤中仅40.0%(6/ 15)出现杂交信号,说明pl6mRNA的表达与成釉细胞瘤瘤细 胞的分化成熟程度有关.pl6mRNA的表达缺失也可能与成 釉细胞瘤的发生有关,并可能是使细胞不断增殖临床上呈现 局部侵袭性生长的生物学基础.有研究表明,成釉细胞瘤外 周柱状细胞DNA含量,增殖细胞核抗原(PCNA)增殖活性较 高,提示外周柱状细胞生长,增殖较为活跃[10,12J.但在本 研究中发现,pl6mRNA阳性表达杂交信号亦主要出现于外 周柱状或立方细胞,推测可能的原因是,这些外周柱状或立方 细胞虽有pl6mRNA的阳性表达,却不能表达出有活性的p16 蛋白.成釉细胞瘤中p16基因表达,DNA含量测定及PCNA 增殖活性的关系尚需进一步研究.在研究中还发现,成釉细 胞瘤中pl6mRNA表达与患者的年龄,性别,肿瘤大小,部位 等无相关性.而在复发组和未复发组之间,pl6mRNA的表
达差异有统计学意义.复发组pl6mRNA的阳性表达率明显
低于未复发组,说明p16mRNA的表达缺失可能是成釉细胞
瘤易复发的原因,pl6mRNA表达缺失可作为判断成釉细胞
瘤预后的一个检测指标.
在本研究中初步证明了成釉细胞瘤中也存在pl6mRNA
的表达缺失,而启动子甲基化是引起p16基因失活的一个重
要机制,有关成釉细胞瘤中启动子甲基化状态与pl6mRNA
表达之间的相关性有待进一步研究.
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