组织块石蜡包埋.doc

组织块石蜡包埋.doc 组组组组石蜡包埋的:步 1.取材:尽量活,在死组组组组组30min内取材完,的大小一般，组组组组组组组组组组组组1.0- 1.5cm,*1.0cm*(0.2-0.3cm) 2.固定:常用甲液度组组组组组4%,是40%甲溶液和水按组组组组组组1:9比例配制而成。固定组组 以12-24h组宜。，4?冰箱可放置1-3个月, 3.冲洗:将放在固定的容器中用流水冲洗组组组组组组组组组组组组组组组组24h. 4.脱水:一次70%酒精2h, 80%酒精2h, 90%酒精1h, 95%酒精40min,无水乙醇 ?40min, 无水乙醇?30min。可将放于组组组组70%酒精中夜。组组组 5.透明:将脱水后直接浸入二甲苯透明中，二甲苯?组组组组组组组组组组组组组组组组组组, 二甲苯?,,次透明每组 10min。 6.浸蜡:常制片常用熔点高于组组组组组组组组组56?以上的石蜡,普通采用56-58??石蜡。先将组 组组组组浸入蜡?1h左右, 再浸入蜡?组组组40min,硬蜡?40min, 硬蜡?1h。，一般浸 蜡组组组3-4h,蜡熔点组组组组组45-50??,硬蜡熔点组55-60??。 7.包埋:将蜡液注入包埋硬具中,迅速将平放入蜡液中,正并组组组组组组组组组组组组组 组组组组组组组组组组组组组组组组组组组组组组组组平,然后移至冷却台,使同蜡液凝固在一起的程。，硬蜡凝固定型,石蜡切片法: 组组组组组组“组”组在切片前先切去本周多的石蜡，此程称修,,但也不能留得太少,否 易造成破坏,切片分片困。一般切片厚度组组组组组组组组组组组组组组组组组组组组组组4-6μm。 组组组组组组组组组组组组组组组组组组组组组组片先在干的玻片上涂一蛋白甘油,然后于60?恒温箱中烘烤1h,若未烤干可适当延,若剥脱可涂一蛋清加以固定。组组组组组组组组组组组组组组组组组组组组 做免疫化,玻片涂多聚氨酸,亦可防脱玻片。组组组组组组组组组组组组组组组组组组组组组组 HE染色的:步组 二甲苯?5-10min? 二甲苯?5-10min?无水乙醇?1-3min?无水乙醇?1-3min?90%酒精1min?80%酒精1min?70%酒精1min?水洗木精?组3-5min?水洗酸酒精?组1-3s?水洗和碳酸，氨水,?组组组组组组10-30s?水洗伊?组3-5min?水洗，短,?70%酒精1-2s?80%酒精3-5min?90%酒精3-5min?95%酒精3-5min?无水乙醇5-10min?二甲苯?3-5min? 二甲苯?3-5min?中性胶封片组组组组 染色液的配制: 1.Harris组木精的配制 组 木精1g 硫酸组组 15g 无水乙醇 10ml 蒸水组组 200ml 先用蒸水加溶解硫酸,用无水乙醇溶解木精再组组组组组组组组组组组组组组组组组组组组组组 倒入已溶解的硫酸蒸水中,煮沸组组组组组组组组组1min后,稍冷却,慢慢加入色氧化汞组组组组组0.5g,组组加至染液紫色,用布盖瓶口,用后组组组组组组组组组组组组组组组组组组组组组组组组每100ml加冰醋酸5ml。2.伊的配制组组组组 组 伊1g 90%酒精 100ml 组组组组组组组组组组组组组组组组组组先将伊溶于酒精中,用玻璃棒研碎溶解后,每100ml加冰醋酸1滴。3.组酸酒精分化液的配制: 组组 酸0.1-1ml 75%酒精 99ml 免疫化:组组组组组步 常石蜡水化,将石蜡切片浸于二甲苯中组组组组组组组组组组组组组组组组组5min,三次。取出切片置于无水乙醇中2次,每次3min,90%酒精、80%酒精、70%酒精,各三次。取出置于蒸水中。组组组组1.取出蒸水中的切片,甩干并擦干切片上周的液体,组组组组组组组组组组组组组组组组组组组组组组 平放于湿盒中,滴加氧化物阻断，常用组组组组组组组组组组组0.3%组组组组组组组组组组组氧化,于上避光孵育15min。蒸水冲洗,再将切片置于组组组组组组组组组组组TBS或PBS组冲液中,浸泡5min,三次。取出切片,甩干并擦干切片上周的液体,平放于湿盒中。组组组组组组组组组组组组组组组 2.滴加50-100μl一抗工作液于上,室温孵育组组组组组组组组2-3h,用PBS冲洗切片。将切片置于TBS或PBS组冲液中,浸泡5min,三次。取出切片,甩干并擦干切片上周的组组组组组液体,平放于湿盒中。 3.滴加50-100μlA液于上,室温孵育组组组组组组组组30min,用PBS冲洗切片。将切片置于TBS或PBS组冲液中,浸泡5min,三次。取出切片,甩干并擦干切片上周的液体,组组组组组组组平放于湿盒中。 4.滴加好的色组组组组组组组DAB工作液50-100μl,室温孵育5-10min,或光下控制色。组组组组组组组组组组组组组组组组色完全后,用蒸水冲洗止色。 5.需要,木精染,酸酒精分化组组组组组组组组组组组组组组1-2s,水洗。 6.各酒精，组组组组70%、80%、90%、无水乙醇?、无水乙醇?,脱水,每组3min,取出切片置入二甲苯5min,三次。 7.用中性胶封片。组组组组组 SABC组组组组组盒分: TM A chemMateEn Vision +/HRP, 兔、小鼠 1×5ml B DAB组组组 冲稀液2×6.25ml C DAB原液 1×0.25ml DAB工作液的配制: 组组组前按毫升每B液，DAB稀液,中加组组组组组1滴，或20微升,C液(DAB原液)的度组组配制所需要的用量,混合后用。组组组 PBS组冲液配制: 1×PBS，1000ml, Nacl(137mM) 4g Kcl(2.7mM) 0.1g NaHPO(10mM) 0.72g24 KHPO(2mM) 0.12g24 5×PBS，500ml, Nacl(137mM) 10g Kcl(2.7mM) 0.25g NaHPO(10mM) 1.8g24 KHPO(2mM) 0.3g24 TGF 1:50-1:200 1:100 孵育3h MMP 1:50-1:200 1:100 孵育3h 二抗羊抗兔 1:400 组组RNA提取: 1.称取子肌瘤和瘤旁组组组组组组组组50-100mg,放入3.5mmRNase Free dish 中,先加入4?组冷的 Trizol500μl,用眼科剪，RNase Free:用3%双氧水或仿浸泡组组组组30min,或用DEPC水 浸泡12h,将尽可能剪碎,再加入组组组组组组组组组组组500μlTrizol,混匀后入组组RNase Free EP管中。2.室温放置5min,加入4?组组组冷的仿0.2ml/mlTrizol,组组组组组组倒混匀，可烈,,要充分至出均匀乳糜状止,然后静置组组组组组组组组组组组组组5min,4?,14000rpm×15min。3.小心收集上水组组组组相600μl,置于另一个EP管，RNase Free,中,避免吸到中和组组组 有机相。 4.加入500μl组冷的异丙醇，0.5ml异丙醇/mlTrizol,,组倒混匀3-5次,-20?放置1h或室 温静置10min。 5. 4?,12000rpm×15min,离心后能看到少组组组组组沉淀附于EP管底部,弃上清,用组组组吸 干管口的余液,倒置于上组组组组组晾干1min。 6.加入1ml-20?组冷的75%乙醇，含DEPC,,洗组RNA沉淀。4?,12000rpm×5min。7.弃上清,加入1ml-20?组冷的无水乙醇,不要冲起沉淀,立即离心, 4?,12000rpm×5min。 8.弃上清,沉淀中即组组RNA,将EP管倒置于上,组组组组组组组组组空气中干燥10min,不能干燥组组度。 加入20μlRNase Free HO溶解沉淀,分装5μl/管,-70?冰箱保存。2 9.组RNA的定:组组组1%组组组组组组脂糖泳定RNA,组组组组组组组组组组组组组察出条的完整性来判断RNA是否降 解。核酸蛋白定定组组组组组RNA的含量和度。组组组 1%组组组组组组脂糖泳制胶: 15ml 0.5×TBE+0.125g组脂糖+2.4μl核酸染料 上:组组2μl 5×loading buffer +3μl组本+5μl DEPC水 150V 30min 组RNA含量:2μl组本+98μlDEPC水 TBE组组组组组组组泳冲液配制:10× PH7.0 T Tris碱 27g B 硼酸 13.75g E EDTA 7.44g 三蒸水500ml RT-PCR步组: RT:1.按下列组组组组组组组组组组组成配制反反液: 2μl? Mgcl 2 ? 10×RT Buffer1μl ? RNase Free dHO3.75μl2 ? dNTP mixture(各10mM)1μl ? RNase inhibitor0.25μl ? AMV Reverse Transcriptase0.5μl ? Oligo dT-Adaptor Primer0.5μl 实实实品RNA;?500ng total RNA,1μl total10μl/sample 2.按以下件实行反实实反实条(一循实个) ，30 10min?, 42 99 5??? 42-60 15-30min 60min 5min 5min?? 95 5min? 5 5min? PCR:1.配制PCR反组组 液100-500bp 10μl? 5×PCR Buffer 实菌蒸实水28.75μl ? TakaRa Ex Taq HS0.25μl 上游特性异PCR引物0.5μl 下游特性异PCR引物0.5μl cDNA10μl total50μl/sample 2.反实件;条25-35个循实, 94 30sec? 55-65 30sec?? 72 1min/kbp? TmP30cycl2Holds 1 Hid 3 es 9494退火温72?72?4? ??度 5mi30s30sec1min7min? nec PCR凝实泳制,;胶胶1.5%, 15ml 0.5×TBE+0.225g组脂糖+1.9μl核酸染料 上:组组2μl 6×loading buffer +7μl组本+ 3μl组组组菌蒸水 TGF- length 335 57.0? Sense 5′CAC AGT CCG CTA CTT CGT CC 3′20bpAnti-Sense 5′CCC TAA TGG CTT CCA CCC TC 3′20bpMMP11 length 409 56.9? Sense 5′TTC TAC ACC TTC CGC TAC CC 3′20bpAnti-Sense 5′GGA CTG GCT TCT CAC CAT CAT AT 3′23bp-actin length 592 56.0?