海藻糖、海藻胶及寡糖对南美白对虾蛋白质冷冻变性的抑制作用

海藻糖、海藻胶及寡糖对南美白对虾蛋白质冷冻变性的抑制作用 海藻糖、海藻胶及寡糖对南美白对虾蛋白质冷冻变性的抑制 作用 现代食品科技 Modern Food Science and Technology 2014, Vol.30, No.6 海藻糖、海藻胶及寡糖对南美白对虾蛋白质 冷冻变性的抑制作用 马璐凯，张宾，王强，邓尚贵，王斌 (浙江海洋学院食品与医药学院，浙江舟山 316000) in L* 基金项目:国家国际科技合作项目(2012DFA30600);国家自然科学基金青 年科学基金项目(31201452);浙江省公益性技术应用研究计划项目 (2012C33081);浙江省自然科学基金项目(LY13C200005，LY13C200006) 作者简介:马路凯(1991-)，男，博士研究生，研究方向为水产品加工及 贮藏 通讯作者:张宾(1981-)，男，博士，副教授，研究方向为水产品加工及 贮藏 酶活性和微生物生长几乎完全受到抑制，从而使其得以长期保藏。然而，深度冻藏时溶质浓缩及冰晶形成，会使冷冻虾肉品质——————————————————————————————————————————————— 发生改变。随着冻藏时间延长，造成虾肉蛋白冷冻变性，如持水性、柔嫩性、胶凝性及营养价值等产生劣变。此外，当解冻和加热时虾仁汁液流失增多，且出现肉质变硬、易碎，口感粗糙，外观色泽变暗现象[1]。 140 现代食品科技 Modern Food Science and Technology 2014, Vol.30, No.6 为了延缓冷冻虾仁蛋白质的冷冻变性，通常在冻藏虾仁中添加抗冷冻变性剂，如糖类、复合磷酸盐、氨基酸及抗冻蛋白质等物质。糖类作为抗冻保水剂在冷冻水产品中的应用已较为广泛，其作用原理是糖类在热能作用下相互缠绕形成三维网络，与肌肉中盐溶性蛋白相互结合形成良好的网络结构[2]。海藻糖、海藻胶及多糖类等在诸多海藻中均含量丰富，约占海藻干重50%以上，多种具有提高机体免疫、抗肿瘤、抗辐射、降血脂及抗蛋白质变性等生物活性[3]。研究表明，海藻糖在多种恶劣环境条件下，能起到稳定细胞膜和蛋白质结构，防止蛋白质变性、抑制腐腥臭味产生和抑制脂肪酸分解等特性[4]。海藻胶在大分子状态下，往往利用其较高粘度和稳定性，应用在医药、食品及化工等领域。海藻胶被降解成低分子量寡糖后，经过分离、修饰后往往会呈现出各种生物活性，如海藻胶寡糖用于冷冻罗非鱼、鳙鱼品质改量及中国对虾保水作用等[5~7]。本研究以冷冻南美白对虾虾仁为研究对象，海藻糖、海藻胶及其寡糖为抗冻剂，通过比较探讨不同糖类对南美白对虾蛋白质冷冻变性的抑制作用，以期达到减少虾仁汁液——————————————————————————————————————————————— 损失和保障冷冻虾仁品质的目的，为其在冷冻水产品的应用开发提供一定支持。 藻胶溶液;? 0.5%海藻胶寡糖溶液;? 1.0%海藻胶寡糖溶液。(前期发现，0.5~1.0%磷酸盐类即可起到较好保水抗冻效果，因此选择此浓度范围进行比较研究; 以上均浓度为质量浓度)。 实验处理:鲜活南美白对虾(0~4 ?，进行清洗、去头尾、去壳，选取完整个体)?虾仁?随机分组(80条/组)?浸泡处理(虾仁与浸泡溶液1:2(m/V)，4 ?浸泡1 h，每10 min搅拌1次)?沥干、分装(纱布轻拭去水分，称重(记M1，)入封口袋)?速冻、冻藏(-65 3 h，-18 ?贮藏)?培养皿中，室温解冻2 h;M2，0.001 g)) 1.3 1.3.1 %(M1–M2)/M1×100 L*表示颜色透明L*=100为白色。每组样品取虾6L*值。 1 材料与方法 1.1 材料与仪器 场(体长9~10 cm)。箱内，30 min 主要试剂:海糖22O11海藻胶((C6H7NaO6)、n，Da)Na4P2>99%，食品级;型紫外分光光度计，上海型超低温冰箱，日本SANYOWSC-100型色差仪，北京光学仪器公司;HS-1300型洁净工作台，苏州安泰空气技术有限公司。 [5] 5.0 g虾仁样品，切碎后加入10倍量20 mmol/L Tris-顺丁烯二酸——————————————————————————————————————————————— 缓冲液(pH 7.0，含0.05 mol/L )，20000 r/min均质1 min，然后10000 r/min低温(4 ?)离心15 min。弃去上清液，沉淀加入10倍量20 mmol/L Tris-顺丁烯二酸缓冲液缓冲液(pH 7.0，含0.6 mol/L KCl)，匀浆1 min后4 ?下提取l h，然后9000 r/min低温(4 ?)离心10 min，上清液即为肌原纤维蛋白溶液。采用Lowry法[8]测定蛋白质含量。 1.3.4 盐溶性蛋白含量[9] 称取2.0 g虾仁样品，研碎后加入15.0 mL高盐缓冲液(0.5 mol/L KCl，0.01 mol/L NaH2PO4，0.03 mol/L Na2HPO4)，25 ?振荡4 h，4 ?提取16 h，经5000 r/min离心10 min(4 ?)，Lowry法测定上清液蛋白质含量。 1.3.5 肌原纤维蛋白Ca2+-ATPase活性[10] 制备反应混合液含pH 7.0，0.50 mol/L Tris-顺丁烯二酸缓冲液、0.10 mol/L CaCl2、H2O、pH 7.0，20 mmol/L ATP溶液和肌原纤维蛋白溶液。将以上反应混合液于30 ?水浴5 min，加入1.0 mL 15% TCA溶液终止反应。空白对照在反应前加入1.0 mL 15% TCA溶液，使蛋白质变性。反应结束后，取1.0 mL反应液，分别加入1.0 mL硫酸钼酸、0.5 mL米吐尔和2.5 mL水， 141 1.2 实验分组及处理 实验分组:? 空白对照(蒸馏水浸泡);? 阳 性对照(1.0%焦磷酸钠溶液);? 0.5%海藻糖溶液;? 1.0%海藻糖溶液;? 0.5%海藻胶溶液;? 1.0%海 ——————————————————————————————————————————————— 现代食品科技 Modern Food Science and Technology 2014, Vol.30, No.6 混匀后室温发色45 min，在640 nm下测定吸光值。曲线绘制以0.5 mmol/L KH2PO4作标准。Ca2+-ATPase活性计算: 活性=A-B/t?酶蛋白量 式中:A-1.0 mL反应液中生成的磷酸量(μmol);B-空白值(μmol);t-反应时间(min);酶蛋白量-1.0 mL反应液所含酶量(mg)。 藻胶溶液(32~200 KD，无法有效渗入到肌肉间隙，其对冷冻虾仁的抗冻、保水性基本无影响。海藻糖(342 Da)处理显著降低了冷冻虾仁解冻损失率(5.00~ 5.54%，p<0.05)，且1.0%高浓度处理效果优于0.5%低浓度处理。关于海藻糖抗冻保水机制，一种解释是海藻糖分子同肌肉蛋白质结合形成一种类似水晶状的玻璃体结构，使蛋白质分子空间结构更加稳定，从而在冻藏时起到保护作用[8];另外一种认为，海藻糖分1.3.6 数据分析 明度(L*)为各色混合的非彩色，这些非彩色由暗到明表现为黑色-灰色-白色，L*值越大颜色越亮。解冻后的虾仁发白略红，颜色较一致，所以选定L*值来进行其色泽评价。添加不同抗冻剂对冷冻虾仁解冻后L*值的影响，如表2所示。冻藏初期，各处理组虾仁解冻后L*值均出现一定程度的增加，是由于冷冻肌肉中形成的冰晶，造成虾肉持水性改变，致使解冻后 142 ——————————————————————————————————————————————— 处理虾仁L*值增加幅度较小，也表明此几种处理虾仁肌肉内的冰晶损伤作用较弱。经过4~6周冻藏期后，蒸馏水、0.5%和1.0%海藻胶处理虾仁L*值表现出逐渐降低的趋势，可能此时冻藏的虾仁肌肉肌原纤维蛋白、肌浆蛋白结构及ATPase活性下降程度较大，导致虾组织状态、表观明度发生变化[15]。此外，蒸馏水、海藻胶处理虾仁L*值变化幅度也最为显著，说明该两 现代食品科技 Modern Food Science and Technology 2014, Vol.30, No.6 组虾仁肌肉蛋白质冷冻变性程度最大。0.5%和1.0%焦磷酸钠、海藻糖和海藻胶寡糖处理虾仁，L*值稍有变化但不显著(p>0.05)，表明该3种物质对于冷冻虾仁表观明度具有良好的保护作用，即可有效减弱冻结冰 晶对于细胞膜的机械损伤作用;此3组处理对虾仁的抗冻保护效果差异不显著(p>0.05)，但均以1.0%高浓度处理组优于0.5%低浓度处理组。 * 表2 不同抗冻剂对于冷藏过程中(解冻后)虾仁L值的影响 时间 /周 蒸馏水 /% 焦磷酸钠/% 0.5 1.0 海藻糖/% 0.5 ——————————————————————————————————————————————— 1.0 海藻胶/% 0.5 1.0 海藻胶寡糖/% 0.5 1.0 引起的[16]。经6周冻藏期后，蒸馏水、0.5%和1.0%海藻胶处理虾仁肌原纤维蛋白含量呈现出快速下降的趋势，具体由115.6 mg/g下降至84.6、85.1和84.8 mg/g，且三者间无显著性差异(p>0.05)，该结果恰符合虾仁解冻损失率结果。0.5%、1.0%海藻糖和海藻胶寡糖处理，相比于空白组对肌原纤维蛋白含量的保持作用显著(含量范围为100.6~104.2 mg/g，p<0.05)， (反映肌球蛋白杆部的性质)，在冻藏过程中，氢键、疏水性和二硫键等形成往往导致蛋白质盐溶性下降。 不同抗冻剂对于贮藏虾仁中盐溶性蛋白含量的影响，如图2所示。新鲜对虾中盐溶性蛋白含量为108.5 mg/g;随着冻藏时间延长，各种处理方式下的冻虾仁盐溶性蛋白含量均显著下降，其中以蒸馏水、0.5%和1.0%海藻胶处理虾仁下降程度最大(6周后，含量依 143 现代食品科技 Modern Food Science and Technology 2014, Vol.30, No.6 次为91.2、92.0和91.6 mg/g)，且三者间无显著性差异(p>0.05)。1.0%海藻胶寡糖、焦磷酸钠和海藻糖处理效果较好(6周后，含量依——————————————————————————————————————————————— 次为104.1、104.2和103.8 mg/g)，且优于0.5%海藻胶寡糖、焦磷酸钠和海藻糖处理(102.2、100.0和99.6 mg/g)。研究表明，引起冷冻虾仁肌肉盐溶性蛋白含量下降的原因很多，如肌肉蛋白质中的结合水、自由水冻结成冰晶析出，导致蛋白质分子间形成非共价键而凝聚，蛋白质巯基氧化形成二硫键导致肌球蛋白重链的聚合，从而降低溶解性等[18]。上述结果表明，无任何抗冻剂的虾仁在冻藏过程中发生了较强的变性作用，且贮藏时间越长变性程度越加严重，而海藻糖、海藻胶寡糖等抗冻剂的添加，则可在很大程度上抑制其冷冻变性，提高冻藏稳定性，从而保持冷冻虾仁制品的品质。 效果不佳，可能就是由于加入的较高浓度焦磷酸钠引入了较高的离子强度，致使肌球蛋白头部结构发生改变、Ca2+-ATPase活性下降较快[10](6周后为0.122 μmol Pi/(mg?min))。而海藻胶寡糖、海藻糖的加入，显著抑制了虾仁Ca2+-ATPase活性下降，该结果也符合冷冻虾仁肌原纤维蛋白含量的变化情况。 3 结论 Ca2+-ATPase品质。 2.5 南美白对虾虾仁Ca2+-ATPase活性变化 参考文献 on the quality changes of tiger shrimp () frozen by air-blast and cryogenic freezing ,,薛长湖等.褐藻酸钠裂解物提高凡纳滨对虾 [J].水产学报,2011,35(10):1547-1553 YUAN Li, GAO Rui-chang, XUE Chang-hu, et al. Mechanism of enhancing the water-holding capacity of ——————————————————————————————————————————————— white leg shrimp by alginate oligosacchrides [J]. Journal of Fisheries of China, 2011, 35(10): 1547-1553 [3] Pawar SN, Edgar KJ. Alginate derivatization: A review of chemistry, properties and applications [J]. Biomaterials, 2012, 33(11): 3279-3305 [4] Campbell LH, Brockbank KGM. Culturing with trehalose produces viable endothelial cells after cryopreservation [J]. Cryobiology, 2012, 64(3): 240-244 [5] 冯慧.多聚磷酸盐在冷冻罗非鱼肉中的水解以及水产品无 磷保水剂的研究[D].青岛:中国海洋大学,2008 FENG Hui. Study of polyphosphate hydrolysis of frozen Tilapia muscle and non-phosphate additive [D]. Qingdao: Ocean University of China, 2008 [6] 高瑞昌.鳙鱼中多聚磷酸盐水解机理及无磷保水剂的研究 [D].青岛:中国海洋大学,2007 GAO Rui-chang. Study on the mechanism of polyphosphates hydrolysis in bighead carp and non-phosphate additive [D]. Qingdao: Ocean University of China, 2007 [7] 张丽,王丽,李学鹏等.褐藻提取物与复合磷酸盐对中国对 图3 不同抗冻剂对于冷藏虾仁中Ca2+-ATPaseCa2+-ACa2+-ATPase 于冻藏虾仁TPase3所示。Ca2+p<0.05)。冻藏6周后，和1.0%焦硫 酸钠处理酶0.092、0.095、0.100和0.122 μ(新鲜虾仁活性为0.162 ——————————————————————————————————————————————— μmol Pi/(mg?min)1.0%、0.5%海藻胶寡糖和海藻糖、0.5%焦磷酸钠 处理虾仁Ca2+-ATPase活性依次为0.142和0.135、0.141和0.134、0.131 μmol Pi/(mg?min)。由此可见，以上处理组对于冷冻虾仁肌肉 Ca2+-ATPase活性保持效果相对较好。有研究认为，肌肉Ca2+-ATPase 活性的丧失是由于肌肉组织内冰晶和离子强度的增加、pH下降等导 致ATPase三级结构发生改变[19]。本实验中1.0%焦硫酸钠对于虾仁 Ca2+-ATPase活性保持 144 现代食品科技 Modern Food Science and Technology 2014, Vol.30, No.6 虾保水效果的比较[J].水产学报,2010,34(10):1610-1616 ZHANG Li, WANG Li, Li Xue-peng, et al. Comparisons of the effects on water-holding capacity of shrimp (Fenneropenaeus chinensis) between extractives from brown algae and compound phosphate [J]. Journal of Fisheries of China, 2010, 34(10): 1610-1616 [8] 李佼.中国对虾贮藏过程中肌肉蛋白质生化特性变化规律 研究[D].杭州:浙江工商大学,2011 LI Jiao. Postmortem changes in muscle proteins of Chinese shrimp (Fenneropenaeus chinensis) during storage [D]. Hangzhou: Zhejiang Gongshang University, 2011 [9] 崔瑞颖,焦学芹,崔波等.冻藏对海湾扇贝闭壳肌蛋白质变 性及组织结构的影响[J].食品工业科技, 2013, 34(22): 298- 301 ——————————————————————————————————————————————— CUI Rui-ying, JIAO Xue-qin, CUI Bo, et al. Effects of frozen storage on protein denaturation and structure of Argopecten irradiams muscle [J]. Science and technology of food industry, 2013, 34(22): 298-301 [10] Benjakul S, Bauer F. Physicochemical and enzymatic changes of cod muscle proteins subjected to different freeze-thaw cycles [J]. Journal of the Science of Food and Agriculture, 2000, 80(8): 1143-1150 [11] Sola-Penna M, Meyer-Fernandes JR. Stabilization and function: why is trehalose more effective sugars [J]. Archives of Biochemistry and 360 (1): 10-14 [12] Tadanori S, Takehiko Growth rate morpholog[13] 朱思明,,.应 用及研究现 状[J].Zhi-ying, et al. The preparation, application and current state of research on alginic acid [J]. China Food Additives, 2003, 6: 61-65 [14] 陈韬,周光宏,徐幸莲. 不同持水性冷却肉的品质比较和蛋 白质的DSC测定[J].食品科学,2006,6(27):31-34 CHEN Tao, ZHOU Guang-hong, XU Xing-lian. Comparison of meat quality with different water holding capacity and determining of porcine muscle proteins with DSC [J]. Food Science, 2006, 6(27): 31-34 [15] 李立杰,柴春祥,鲁晓翔等.价[J].食品工业科技LI Li-jie, CHAI al. Color evaluation of the freshness y of [16] 李佼.研究:shrimp (chinensis) ——————————————————————————————————————————————— during storage [D]. [17] ,黄海,李八方.不同冻藏温度对鲈鱼肌肉蛋白 质生 [J].青岛海洋大学学报,2003,33(4):525-530 ZENG Ming-yong, HUANG Hai, LI Ba-fang. Effect of frozen storage temperature on the changes of biochemical properties of Lateolabrax japonicus muscle protein [J]. Journal of Ocean University of Qingdao, 2003, 33(4): 525-530 [19] Benjakul S, Seymour TA, Morrissey MT. Physicochemical changes in pacific whiting muscle proteins during iced storage [J]. Journal of Food Science, 1997, 62(4): 729-733 145 ———————————————————————————————————————————————