肿瘤坏死因子

肿瘤坏死因子 作者:孙嗣国，马保安，周勇，范清宇 【关键词】 ,肿瘤坏死因子 Osteoclast formation and bone resorption induced by tumor necrosis factorα 【Abstract】 AIM: To investigate whether tumor necrosis factorα (TNFα) can induce osteoclast formation from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) independent of receptor activator of nuclear factor kappa B ligand (RANKL). METHODS: PBMCs were cultured in the presence of macrophagecolony stimulating factor (MCSF) and TNFα in vitro. RANKL blocking agent RANK:Fc and neutralizing antiTNFα antibody were respectively added to the culture. At the end of the culture, PBMCs cultured on coverslips were fixed and stained for tartrate resistant acid phosphatase (TRAP), a marker of osteoclast. Lacuna resorption on dentine slices, a functional marker of osteoclast, was also observed using scanning electron microscopy and light microscopy. RESULTS: TNFα induced the formation of multinucleated cells (MNCs) which were TRAP 1 positive and showed evidence of lacuna resorption pit formation on dentine slices. RANK:Fc did not inhibit this process while neutralizing antiTNFα antibody completely blocked both the formation of MNCs and lacuna resorption. CONCLUSION: In the presence of MCSF, TNFα can directly induce mononuclear phagocyte osteoclast precursors to differentiate into osteoclastic cells capable of lacuna resorption. 【Keys】 TNFα; osteoclast; bone resorption 【摘要】 目的: 验证肿瘤坏死因子α(TNFα)是否可以直 接诱外周血核细胞(PBMCs)分化为具有骨吸收作用的破骨细胞. 方 法:小白鼠PBMCs体外培养中加入TNFα和白细胞介素1α(IL1α) 及巨噬细胞克隆集落刺激因子(MCSF);同时，分别加入细胞核因子κ B受体活化因子配体(RANKL)的拮抗剂RANK:Fc和抗TNFα中和抗体. 对培养终末细胞作组织化学染色，检测破骨细胞特征性标志物抗酒石 酸磷酸酶(TRAP)的达;并以象牙磨片上虫蚀样骨吸收陷窝的形成 为指标检测其生物学活性. 结果:PBMCs体外培养形成大量TRAP阳性 的多核细胞(MNCs);象牙磨片上见到虫蚀样骨吸收陷窝，后者的面积 对TNFα呈剂量依赖性. RANK:Fc对此现象无抑制作用，而抗TNFα中 和抗体可完全阻断该现象的发生. 结论:TNFα能够直接诱导PBMCs 分化为具有骨吸收功能的破骨细胞. 2 【关键词】 肿瘤坏死因子α;破骨细胞;骨吸收 0引言 破骨细胞是由单核巨噬系统的破骨细胞前体细胞分化而来的多核细胞(MNCs). 多种炎性及非炎性的骨与关节的病变，如骨质疏松、风湿性关节炎、无菌性松动等都与破骨细胞代谢异常有关. 近年来的研究表明肿瘤坏死因子(TNFα)通过多种方式参与破骨细胞的分化及生物学活性的调控,1,2,. 在本实验中，我们将小白鼠外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)及RAW246.7细胞体外培养，并加入TNFα及其他因子，验证TNFα是否可以直接诱导破骨细胞前体细胞分化为具有骨吸收活性的破骨细胞. 1材料和方法 1.1材料 1.1.1试剂αMEM中加入100 u/mL青霉素，10 mg/L链霉素和10 mmol L谷氨酸及100 mL/L胎牛血清(Invitrogen, UK) 配制成完全培养基(MEM/FBS);重组人巨噬细胞克隆刺激因子(MCSF)、鼠可溶性细胞核因子κB受体活化因子配体(solvable receptor 3 activator of nuclear factor kappa B ligand, sRANKL)、RANKL拮抗剂(RANK:Fc)，TNFα，IL1α，抗TNFα中和抗体均购于R&D Systems公司(UK)，抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)试剂盒购于Sigma公司(UK). 1.1.2动物及细胞系6~9 wk的BALB/c小鼠(第四军医大学实验动物中心提供). RAW264.7细胞系由Mike Rogers博士(Aberdeen, UK)惠赠. 1.1.3象牙骨片的制备将象牙磨至65 μm厚,再冲压成直径4 mm的圆形骨片,超声波处理,消毒备用. 1.2方法 1.2.1小白鼠PBMCs的分离、培养及试验分组将小白鼠外周血按1?4稀释于MEM后缓慢加到histopaque (Sigma, UK)表面, 离心(693 g) 30 min. 吸取处于界面层的细胞，重悬于MEM并离心(600 g)10 min，重复两次，然后重悬于MEM/FCS. 50 mL/L醋酸溶解红细胞后，细胞记数板记数PBMCs. 事先将灭菌的4 mm直径的象牙磨片和直径6 mm的玻璃盖玻片分别放入96孔细胞培养板. 将2×105 PBMCs加入放有象牙磨片或盖玻片的96孔细胞培养板，调整培养液(MEM/FBS)至总体积0.1 mL;孵育2 h后将象牙磨片及玻璃盖玻片取出，并在 4 MEM/FCS中充分涮洗以去除非黏附细胞，然后转移到24孔组织培养板，培养板内加入各种因子并调整培养基至总体积为1 mL. 每3日更换培养液及各种因子. 实验分组:A组加入25 μg/L MCSF和10 μg/L IL1α作为阴性对照;B组加入25 μg/L MCSF和30 μg/L sRANKL作为阳性对照;C组加入25 μg/L MCSF，10 μg/L IL1α和不同浓度的TNFα;D组E组加入25 μg/L MCSF，10 μg/L IL1α和25 μg/L TNFα，分别再加入100 μg/L的抗TNFα中和抗体和RANK:Fc. 1.2.2RAW246.7细胞的培养及实验分组5×103 RAW246.7细胞加入含有0.5 mL MEM/FCS及2块玻璃盖玻片或3块象牙磨片的24孔细胞培养板中，调整培养液至总体积为1 mL. 孵育2 h后将盖玻片和象牙磨片取出并在MEM/FCS中充分涮洗，去除非黏附细胞后放入新的24孔细胞培养板，培养板内加入各种因子并调整培养基至总体积为1 mL,每2日更换培养液及各种因子. 实验分组:A组加入25 μg/L TNFα和10 μg/L IL1α; B组加入10 μg/L IL1α作为阴性对照;C组加入30 μg/L sRANKL作为阳性对照. 1.2.3破骨细胞的鉴定于孵育24 h中止部分象牙磨片和玻璃盖玻片上的细胞培养并鉴定,以排除PBMCs中含有成熟OC的可能. 再于9 d，14 d分别终止玻璃盖玻片和象牙磨片上的PBMCs细胞培养. 于培养的第5日和第8日分别终止玻璃盖玻片和象牙磨片上的RAW246.7 5 细胞培养. 玻璃盖玻片用于TRAP染色，象牙磨片用于检测骨吸收陷窝的形成. TRAP染色:玻璃盖玻片于空气中晾干并用柠檬酸/丙酮固定细胞，按照试剂盒说明作组织化学染色检测破骨细胞标志物TRAP的表达. 甲苯胺蓝染色及电镜扫描(SEM):象牙磨片浸泡于NH4OH (1 mol/L) 30 min、超声波处理去除黏附的细胞及碎片后，蒸馏水润洗并于空气中晾干. 甲苯胺蓝染色后，光学显微镜下检测虫蚀样骨吸收陷窝的形成，并计算虫蚀样骨吸收陷窝面积占象牙磨片总体面积的百分比. 另外有一部分象牙磨片用梯度乙醇脱水、空气晾干并覆以金粉涂层后做电镜(Philips SEM 505)扫描. 统计学处理: 每次实验中各组分别设3个象牙磨片，实验一共重复3次. 应用SPSS 10.0软件包处理数据. 计量以x?s表示. 在比较C组与E组的骨吸收陷窝面积差异时采用Students t检验，P<0.05时认为差异具有显著性. 2结果 2.1TNFα诱导PBMCs形成具有骨吸收活性的MNCs24 h后终止 6 细胞培养未见TRAP阳性MNCs或虫蚀样骨吸收陷窝形成. 培养终止后，仅有MCSF和IL1α存在的条件下(A组)，未见TRAP阳性细胞或虫蚀样骨吸收陷窝形成. 而加入sRANKL后(B组)有大量TRAP阳性MNCs(Fig 1A)和虫蚀样骨吸收陷窝形成(Fig 2A，B). 在MCSF和IL1α存在的条件下，TNFα(C组)诱导PBMCs形成数量不等的TRAP阳性的MNCs(Fig 1B)，相应的象牙磨片上出现数量、大小不等的虫蚀样骨吸收陷窝(Fig 2C，D)，并且虫蚀样骨吸收陷窝的面积随TNFα剂量的增加而增大(Fig 3). 同sRANKL(B组)相比较TNFα(C组)诱导的TRAP阳性MNCs的直径小且所含细胞核数量少，视野内见大量TRAP阳性的单核细胞(Fig 1B);并且所形成的虫蚀样骨吸收陷窝亦较后者小而浅(Fig 2C，D). 加入抗TNFα中和抗体(D组)完全阻断TRAP阳性MNCs和虫蚀样骨吸收陷窝的形成. RANK:Fc(E组)未能阻断TRAP阳性MNCs的形成，而且RANK:Fc组(E组)与不含RANK:Fc组(C组)的骨吸收陷窝面积的差异也不显著,(9.28?2.14) vs (9.76 ?1.96)，n=9,P>0.05,. 2.2TNFα诱导RAW246.7细胞的影响为了进一步验证上述结果，我们将25 μg/L TNFα和10 μg/L IL1α加入RAW264.7细胞培养中. 于培养结束时见小的TRAP阳性MNCs和小而浅的骨吸收陷窝. 而阴性对照组未见TRAP阳性MNCs和骨吸收陷窝形成. 3讨论 7 破骨细胞的功能和活性在骨代谢调节中起着重作用,TRAP阳性和骨吸收作用为其特征性标志. 破骨细胞的形成依赖于破骨细胞前体细胞表面的RANK与其配体(RANKL)之间的相互作用;同时MCSF的存在也是破骨细胞分化及存活的必要条件,3,. 骨保护素(OPG)是RANKL的饵受体，通过与RANK竞争结合RANKL从而抑制RANKL诱导的破骨细胞分化及骨吸收作用. 许多细胞因子通过调节RANKL与OPG之间的平衡来影响破骨细胞的溶骨作用,4,. 最近Kodo等,5,报道炎性细胞因子白细胞介素6(IL6)和IL11能够直接诱导破骨细胞分化而不依赖于RANKL/RANK作用机制. TNFα是一种非常重要的炎性因子，它具有多种生物学功能，包括调节炎性反应、免疫应答、调亡和抗病毒反应等. 在骨骼系统中，TNFα能够抑制细胞外基质沉积并刺激基质金属蛋白酶的合成,1,、而且它还可以促进溶骨性细胞因子如MCSF和RANKL的表达,2,. Kobayashi等,6,和Kudo等,7,先后报道了TNFα体外直接诱导老鼠和人的破骨细胞分化成为具有骨吸收活性的破骨细胞，并且IL1α能够明显增强这种破骨细胞的活性. 然而Lam等,8,则认为TNFα独自不能够诱导的破骨细胞分化，只能在最低允许浓度RANKL存在的条件下才能诱导破骨细胞形成. 我们的结果与Kabayashi和Kudo研究小组的结果一致，显示TNFα能够直接诱导小鼠PBMCs中破骨细胞前体细胞分化为具有骨吸收活性的成熟的破骨细胞. 原始细胞培养24 h未见TRAP阳性细胞，象牙磨片上也未见骨吸收陷窝形成， 8 表明原始培养细胞中不含有破骨细胞. 经过9~14 d培养后，TNFα诱导PBMCs分化为TRAP阳性的具有骨吸收活性的MNCs. 而且，象牙磨片上虫蚀样骨吸收陷窝的面积随TNFα的剂量增加而增大，提示破骨细胞的活性对TNFα表现出剂量依赖性. 抗TNFα中和抗体能够阻断这一过程，而RANKL阻断剂RANK:Fc对这一过程无显著影响，表明这种作用是由TNFα介导而不依赖于RANKL/RANK作用机制的. RAW264.7细胞是一种鼠源性的单核细胞系. 它能够分泌MCSF，并且在sRANKL作用下能够分化成为具有骨吸收活性的破骨细胞. 在我们的实验中，TNFα能够诱导RAW264.7细胞分化为具有骨吸收活性的成熟的破骨细胞，进一步证实TNFα诱导破骨细胞形成是不依赖于RANKL/RANK途径的. TNFα诱导形成的破骨细胞与RANKL诱导形成的破骨细胞不同;前者的体积小并且所含细胞核的数量少. 这种相对较小的TRAP阳性的多核细胞和单核细胞与gp130细胞因子(如IL6)诱导形成的细胞相似,5,. Witten等,9,曾在斑马鱼模型中观察到单个核破骨细胞可以形成小而浅的虫蚀样吸收陷窝. Quinn等,10,也报道过在研究破骨细胞体外模型时见到TRAP阳性的单核细胞，但其性质尚不清楚. 我们在实验中也观察到TRAP阳性的单核细胞，笔者认为它们是处于即将融合状态的破骨细胞前体细胞;但是这种细胞是否具有骨吸收活性还不清楚，需要作进一步的研究. 9 在多种病理条件下，如风湿性关节炎和人工关节置换术后无 菌性松动，局部组织中TNFα水平都有所升高，作为一种炎性分子， TNFα通过多种途径参与骨代谢过程. 我们的实验结果进一步证明， TNFα可以直接诱导破骨细胞分化并刺激其活性从而在骨代谢中发挥 重要作用. 因此针对TNFα的治疗可能成为预防和治疗这些疾病的有 效措施. 【参考文献】 ,1, Siwik DA, Chang DL, Colucci WS. Interliukin1β and tumor necrosis factorα decrease collagen synthesis and increase matrix metalloproteinase activity in cardiac fibroblasts in vitro ,J,. Circ Res, 2000; 86(12):1259-1265. ,2, Kubota A, Hasegawa K, Suguro T, et al. Tumor necrosis factoralpha promotes the expression of osteoprotegerin in rheumatoid synovial fibroblasts ,J,. J Rheumatol, 2004; 31(3):426-435. ,3, Blair HC, Athanasou NA. Recent advances in osteoclast biology and pathological bone resorption,J,. Histol 10 Histopathol, 2004;19(1):189-199. ,4, Hofbauer LC, Hicok KC, Chen D, et al. Regulation of osteoprotegerin production by androgens and antiandrogens in human osteoblastic lineage cells ,J,. Eur J Endocrinol, 2002;147(2): 269-273. ,5, Kodo O, Sabokbar A, Itonaga I, et al. Interleukin6 and interleukin11 support human osteoclast formation by a RANKLindependent mechanism ,J,. Bone, 2003; 32(1):1-7. ,6, Kobayashi K, Takahashi N, Jimi E, et al. Tumor necrosis factors alpha stimulates osteoclast differentiation by a mechanism independent of the ODF/RANKLRANK interaction,J,. J Exp Med, 2000;191(2):275-286. ,7, Kudo O, Fujikawa Y, Itonaga I, et al. Proinflammatory cytokine (TNFα/IL1α) induction of human osteoclast formation ,J,. J Pathol, 2002; 198(2):220-227. ,8, Lam J, Takeshita S, Barker JE, et al. TNFα induces osteoclastogenesis by direct stimulation of macrophages exposed 11 to permissive levels of RANK ligand,J,. J Clin Inves, 2000; 106(12):1481-1488. ,9, Witten PE, Hansen A, Hall BK. Features of mono and multinucleated bone resorbing cells of the Zebrafish Danio rerio and their contribution to skeletal development, remodeling, and growth ,J,. J Morphol, 2001; 250(3): 197-207. ,10, Quinn JM, Whitty GA, Byrne RJ, et al. The generation of highly enriched osteoclastlineage cell populations ,J,. Bone, 2002; 30(1):164-170. 12