甘草酸二铵对肝纤维化大鼠肝脏脂质过氧化与间质性胶原酶活性的影响

甘草酸二铵对肝纤维化大鼠肝脏脂质过氧化与间质性胶原酶活性的影响 甘草酸二铵对肝纤维化大鼠肝脏脂质过氧 化与间质性胶原酶活性的影响 中国病理生理杂志ChineseJournalofP [文章编号]1000—4718(2005)11—2233—05 甘草酸二铵对肝纤维化大鼠肝脏脂质过氧化 与间质性胶原酶活性的影响* 刘成海',李风华,陈文慧,一,吴定中一,胡义扬,刘平 (上海中医药大学肝病研究所上海高校中医内科学E一研究院,上海201203;云南中医学院基础部,云南昆明650011; 上海市传染病总院,上海200083) [摘要]目的:探讨甘草酸二铵影响纤维化肝脏脂质过氧化与间质性胶原酶活性的抗肝纤维化作用机制. 方法:以四氯化碳(cch)皮下注射与高脂肪低蛋白饮食复合因素诱导大鼠肝纤维化模型,而后予以甘草酸二铵口服 治疗,正常大鼠与模型对照组给予等量生理盐水.HE染色与胶原染色观察大鼠肝组织炎性坏死与胶原沉积病理改 变,按试剂盒方法检测血清肝功能(ALT,AST,Alb与总胆红素等)变化,检测肝组织主要过氧化损伤指标:超氧化物歧 化酶(SOD)活性,丙二醛(MDA)含量,谷胱甘肽(GSH)含量与谷胱甘肽过氧化物酶(GSH—Px)活性,水解法测定肝组 织羟脯氨酸含量,酶底物反应法分析肝组织间质性胶原酶活性变化,RT—PCR法分析肝组织l型前胶原基因达. 结果:与正常大鼠相比,模型大鼠肝脏有明显胶原沉积与肝纤维化,伴有不同程度的肝细胞炎性损伤坏死;甘草酸二 铵药物组明显减轻模型大鼠肝组织损伤坏死与胶原沉积等病理变化.模型大鼠肝功能指标,包括血清总胆红素含 量,ALT与AST活性,白蛋白含量均明显减少(P<0.01).药物组大鼠血清总胆红素 含量,AS3'与ALT活性显着低于 模型组(P<0.05),而白蛋白含量高于模型组(P<0.05).此外,药物组大鼠肝组织 羟脯氨酸含量(151.3?37.3tc/g) 明显少于模型组(170.9?15.3}g,P<0,05),I型前胶原基因表达弱于模型组 (P<0.05);肝组织MDA含量(1.96 ?0.23wnol/g)低于模型组(2.44?0.32llmol/L,P<0.05),SOD水平(19.60? 0.97NU/g)高于模型组(20.60?0.33 NU/g,P<0.05),GSH含量(47.0?9.1g/g)与GSH—Px活性(53.1?4.1U/g)高于模型 组(41.2?3.5s/g;46.7?6.1 U/g,P<0.05);肝组织间质性胶原酶活性(43.894-7.74U)高于模型组(32.01? 275U,P<0.05).结论:甘草酸二铵 有明显抗肝纤维化大鼠肝脏脂质过氧化损伤与提高肝组织间质性胶原酶活性的 作用,该作用是药物抗肝纤维化的 重要机制. [关键词]甘草酸;肝硬化;过氧化脂质类;胶原酶类 [中图分类号]R363[文献标识码]A Effectsofdiammoniumglycyrrhizinateonthelipidperoxidationandintersti- tialcollagenaseactivityinfibroticliverinrats UUCheng—hai,LIFeng—hua,CHENWen—hui,WUDing—zong,HUYi_yang, UUPing (InstituteofLiverDiseases,ShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Shanghai 201203,China) [ABSTRACT]AIM_.Toinvestigatetheeffectofdiammoniumgyeyrrhizinate(Ganlixin)ag ainstliverfibrosisthroughpre— ventinglipidperoxidationandregulatinginterstitialco~agerb3seactivity.METHOI~:Theli verfibrotiemodelwasinducedthrough subcutaneousinjectionofcchandthefeedingwithhighfatandlowproteininrats.Diammoniu mgyeyrrhizinateWasadministered (70rag/kgratBW).Hepaticinflanunationandeo~agenwereobservedwithH— EandSiriusredstaining.Theliverfunctionin? eludingSel'ulnALT,ASTactivity,Albandtotalbilintbinlevelweredetermined,ThehepaticlipidperoxidationincludingSODand GSH— Pxactivities,MDAandGSHcontentwerealsomeasured.Hepatichydroxyproline(Hyp)contentwasdetectedwithJamall' smethod.TheactivityofinterstitialeollagenaseinhverWasassayedbytherBac~onwith[H]labeledtype1eoUagen,andthegene expressionofal(I)pro—eoUagenWasanalyzedbyRT— PCR.REsIII.:Themodelratshadremarkableinflammatorynecro— sis.collagenaccumulationandfibrosisatliver.whilethediammoniumgyeyrrhizinatetreatedgroupshowedslighterhepatici.jury [收稿日期]2004—03—26[修回日期]2OO4—09—27 *[基金项目]上海市第4期重点学科建设项目资助;上海市教育委员会E一研究建 设计划项目部分资助(E03008) Tel:021—51322445:E—mail:chenghai—liu@yahoo.COI/I.cn andcollagendeposition,andthemuchbetterliverfunctionthanthemode1.Thediammordumgyeyrrhizinate—treatedgrouphadlow— erlevelsofhepaticMDA,Hypandal(J)pro— collagenmRNAexpressionthanthoseinthemodelgroup,buthadhigherlevels ofinterstitialeollagenaseactivity,GSH('or]tel'It,SODandGSH— Pxactivitythanthoseinthemodelgroup.CONCLUSION:Di— ammonitungyeyrrhizinatehasagoodeffectagainstliverfibrosis,whichmayberelatedtothepreventionfromlipidpemxidationand improvementofinterstitialcollagenaseactivityinfibroticlivers. [KEYWORDS]Glycyrrhizicacid;Livercirrhosis;Lipidperoxides;Collagenases 甘草酸二铵(diammoniumglycyrrhizinate,商品名 "甘利欣")是自甘草中提取出的a体甘草酸二铵盐, 具有较强的抗炎,保护肝细胞膜及改善肝功能的作 用,临床上主要用于急性与慢性肝炎患者.肝纤维 化是包括慢性肝炎等大多数慢性肝病的共同病理特 点,有报道发现该药有抗慢性乙型肝炎肝纤维化的 作用_1J,我们既往实验证实甘草酸二铵对二甲基亚 硝胺诱导的肝纤维化大鼠有良好的抗肝纤维化作 用j.本研究通过观察甘草酸二铵对肝纤维化模型 大鼠肝脏脂质过氧化损伤与问质性胶原酶活性等的 影响,以探讨该药物抗肝纤维化的作用机制. 材料和方法 1材料 1.1药物甘草酸二铵,为l8a体,分子式C42H68 N2016,分子量为857.OI,由江苏J卜大天晴制药厂提供. 1.2动物Wistar大鼠33只,雄性,SPF级,170— 180g.中科院上海动物实验中心提供. 1.3主要试剂四氯化碳,分子式CCL,,上海华东 试剂公司产品.肝功能检测试剂盒,购自卫生部上 海生物制品研究所.羟脯氨酸(hydmxypmline,Hyp) 品,13本4-灭株式会社产品.[H]标 记大鼠工型胶原,购自Dupont公司.超氧化物歧化 酶(superoxidativedismutase,SOD)活性,丙二醛(ma1. ondiadehyde,MDA)含量,谷胱甘肽(glutathione,CsH) 含量与谷胱甘肽过氧化物酶(glutathionepemxidase. GSH—Px)活性等检测试剂盒,购自南京建成生物工 程公司. 2方法 2.1模型复制[31co4模型大鼠首次以纯co40.5 mlJl00gBW,以后以40%CCL,一橄榄油溶液0.3 mlJl00gBW,在大鼠背部后侧皮下注射,每周2次, 共6周;造模的第1—2周饲以高脂玉米粉饲料,第3 — 6周以纯玉米饲养;自由饮水.正常组大鼠以普通 饲料喂养. 2.2分组与用药造模结束后,大鼠分为正常组(9 只),模型组(12只),甘草酸二铵治疗组(12只)共3 组.甘草酸二铵组以7ms/100g大鼠BW(65kg成 人临床口服用量450d,大鼠用其等体重的l0倍 量)l_4J,自造模之日起灌胃,每日1次,共6周.其余 各组灌以生理盐水,每日1次,共6周. 2.3肝功能检查血清白蛋白(albumin,Alb),溴钾 酚绿比色法;血清总蛋白,双缩脲法;血清门冬氨酸 氨基转移酶(aspartateaminotransferase,AST),比色法; 丙酸氨基转移酶(alanineaminotransferase,ALT)测定, 赖氏法;血清总胆红素,重氮法,按卫生部上海生物 制品研究所试剂盒说明进行. 2.4肝组织脂质过氧化测定SOD活性,MDA含 根据试剂盒说明书测 量,GSH含量GSH—Px活性, 定. 2.5肝组织HE染色与胶原染色肝组织经中性 甲醛缓冲液固定,石蜡包埋,切片为5tan厚度,多级 酒精脱水,二甲苯透明,分别作HE染色,胶原染色丽 春红胶原染色. 2.6肝组织羟脯氨酸检测采用Jamall法【引,即肝 组织匀浆液中加入等体积12mol/LHC1,105水解 18h,过滤,取水解液100烘干.另取Hyp标准品 0.2—0.6g,设为反应标准对照管.每个样品与标准 管设2个复管,经氯铵T溶液,欧氏液[25%(/V) 对二甲基氨基甲苯,27.3%()高氯酸的异丙醇溶 液]反应,50?,30min水浴后,558Bin测定值,计 算标准曲线与样品羟脯氨酸含量. 2.7胶原酶活性测定参考文献方法L引.肝组织 匀浆液与['H]标记I型胶原孵育,同时以匀浆缓冲 液与精制胶原酶代替组织匀浆液,分别为空白对照 管与胶原酶对照管.经对苯汞苯甲酸溶液激活(以 EDTA为EDTA对照管),混匀后37?反应24h.离 心取上清,测定各反应管counts/min值.根据以下公 式计算酶活性,活性单位为:ttgcollagen?mgprotein? h,. 胶原酶活性:墨繁誓薯墨霍 ×20(组织蛋白倍数) 2.8肝组织总RNA提取与I型前胶原mRNA表达 检测工型前胶原(el(工))与看家基因l3一actin引 物设计参考文献[,引,由上海生工公司合成,纯化与 鉴定,序列如表1. 表1I型前胶原mlRNA扩增引物设计 TablDesignofprimersforamplificationofctl(I)procollagentypeImRNA 异硫氰酸胍/酚/氯仿一步法自细胞中提取总 RNA[9],以RT—PCR试剂盒,根据说明书,采用以下 条件(1)48oC,45min,1个循环,(2)94cc,2rain.1 个循环,(3)94oC,30S,60oC,lrain,38cc,2min, 30个循环;(4)68?,7min,1个循环,分别进行样品 的I型前胶原与B—actin(内参照)的cDNA扩增. PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳,紫外透射反射仪 下照相. 3统计学处理 数据以元-4-s表示,t检验. 结果 1甘草酸二铵对肝纤维化大鼠肝脏炎症与胶原沉 积的影响 模型组大鼠死亡1只,甘草酸二铵药物组死亡2 只.模型组大鼠肝组织HE染色见中央静脉周围肝 细胞明显脂肪空泡变性,并见散在肝细胞坏死,汇管 区炎性细胞浸润;丽春红染色可见肝组织胶原纤维 明显增生,尤以汇管区明显,呈放射状排列向肝实质 延伸,部分大鼠完全形成假小叶.药物组肝组织脂 肪空泡变性明显减轻,点状坏死灶与炎性细胞浸润 减少;汇管区周围胶原沉积亦减轻. 2甘草酸二铵对肝纤维化大鼠血清肝功能的影响 模型组大鼠血清ALT与AST水平,总胆红素含 量显着高于正常大鼠,Alb明显低于正常大鼠.而甘 草酸二铵治疗组大鼠血清ALT与AST水平,总胆红 素含量显着低于模型组,而Alb含量高于模型组 (表2). 3甘草酸二铵对肝纤维化大鼠肝组织Hyp含量与 间质性胶原酶活性的影响 模型大鼠肝组织Hyp含量明显高于正常大鼠, 间质性胶原酶与正常大鼠无显着区别(P>0.05),而 甘草酸二铵治疗组肝组织Hyp含量低于模型大组, 间质性胶原酶活性高于模型组(表3). 表2甘草酸二铵对肝纤维化大鼠肝功能的影响 Tab2DianunoniumglycyrrhizirmteeffectOFIliverfunctionatliverfibroticrats(?s) P<0.01normal;P<0.05mode1. 表3甘草酸二铵对肝纤维化大鼠肝组织Hyp含量与胶原酶 活性的影响 Tab3DiammoniumglyeyrrhizirmteeffectOilliverHypcontentand eollagenaseactivityatliverfibroticrats(?s) P<0.05伪normal;P<0.05伪mode1. 4甘草酸二铵对肝纤维化大鼠肝组织I型前胶原 基因表达的影响 模型大鼠肝组织al(I)mRNA表达水平明显高 于正常大鼠,而甘草酸二铵组肝组织al(工)mRNA 的表达水平明显低于模型大鼠(图1). 5甘草酸二铵对肝纤维化大鼠肝组织脂质过氧化 损伤的影响 模型大鼠SOD与GSH—Px活性,GSH含量显着 低于正常组,而MDA含量高于正常组,甘草酸二铵 治疗组肝组织SOD与GSH—Px活性明显高于模型大 鼠,GSH含量高于,而MDA含量低于模型组(表4). 讨论 肝纤维化是肝脏对多种原因慢性损伤的一种修 以肝脏细胞外基质代谢失衡,大量增生 复愈合反应, 沉积为特征,脂质过氧化损伤可刺激肝星状细胞等 2236 l"胶原因蛋lI表达增Jsi【.导致IIP-+~维化. HvD垃胶原所特氨基峻.1l-匣映胶原含量实骢 -憷大鼠消AI,T,AST水平升.总Ull~1:素含 增JSl1.All,龠哇下降,』互映肝细胞炎性损伤较严雨;mj 肝呲胶l『J_?[霉1.J[;成纤维问隔0假小叶.肝脏 Hyp含量着上升,表示肝纤维化已叫融形成甘草 酸二铵盯』I显降低模型大鼠血清A盯,AST水平与总胆 【素含量,促进Alb,1i戚.城轮卅:组织胶原沉极与肝 呲Hyp含并抑制JJt:脏nl()前胶原基因表达.进一 步证实该药卉一定的抗H1:损伤与抗肝纤维化效果 表4甘草酸二铵对肝纤维化模型大鼠肝组织脂质过氧化损伤的影响 4"J圳^圳u?J~.rrhizAnae-1ll1]he~mliI?pidpen~idutionalli~erfihrofit.1?(? P<()05……tlIIi1l:,'<I1.(/5…IIl-l 5?hD I5(ibp 30(Ibp 50(1bp I+-:lLfinf163hp "ll1)(253bp) l34)67 FlDiartllnorlillli1gly,,13Iliziruleeltbt:tI?lallI)[m~.ollagen'y 【collJi~t?IIillHN^f,lJ川lit["?rfihroticm111eli,.+el lilmll?m,KMinILlt11byo;h__ijectionanda<lministra? lion)I-tilexxlwilhhighfatBmlImlteininratsand? n,hninist~-redw_lI_dilulun<niium.ynhizilutleHIado~lgeuf 70n],kgIBWIllet,+tMIIN^f~xtr,aetf+d1li~'eJ Ildit/ert?gr<.tips.?l(1)【PLpm—collagenand Ihlml(Nb,f…lI??"J洲PImJ廿1Irwin 兀l.【a}Jl?Ir{haill?tifn1andtim】IucH l'ra~li,1~.xlllyI59+?gelIllIt!l:PCRll,kt-j(50 l如,3?,500ll;2,3:lnnallul【)mid0一a(:tillm— Hlivdy.Ihe+.dill4+Mh:m'4,5:<~nlrol;6.7: treutedf…1dianillliln[tun,rrhizimlte). 图1甘草酸二铵对肝皇千维化模型大鼠肝组织O.1cI)I型前 肢原基因表达的影响 SOD是体内清除趟氧化堆矧(也括超氰化『{}j离 子(h'jff.j主要盼系.通过歧化反J,能使晰个十H 作I?j肜成H2H20:则可【11过氰化氢酶(CA'I')和 禽硒的胱…捷过氰化胁(一<;SII—Pxj来清除.从 保',-+lilJ旭结恂与功能自丛f起组织细胞损伤 的机除J能'J{物JJ葵蚩质起反应外.还_一j,{=物 膜flgJI~质进{7I?氧化眨,产'#过氰化脂质,严再影 Illh]sL物膜的各种性能其._j有3个或3个以lz 的双键脂脐簸起…韫反应川.?h丙二醛(?In), MI)A自两个功能基,I-『Jjl起大分子问的交联.并可 直接刺激J1I.星状细胞激活…GS1+l作为一种低分子 清除刹.是GSH—Px降解过氧化氟所必需,GSI]水平 是衡量机体抗氧化能力的重要指标.本实验发 现,模型大鼠SOD与GSI:I—Px活性明疑降低,GSH 含鲢下降,而MDA含量增加,证实了脂质过氧化在 肝纤维化的重要作用而甘:酸二铵提高肝纤维化 艇)大鼠肝脏SOD与GSH—Px活.,GSH的含量, 降低MDA禽量,提示该药有良好的抗月f脏过氧化损 伤作用,且这种作川町能是该药抑制胶腰基因表达 .防止肝纤维化形成的重要机理.. '拍向生成 正常IIp.r!J~胶原等纽『胞外基质的生成降解保持 动态平衡,降解主要由胶原酶(基质金属蛋白酶) 渊节,肝纤维化形成除了胶腺等增增f』『J,另,重要 原因是降解减少纤维化肝脏以I型腔原增加明 显,而th】质性胶原酶在其降解代谢巾起雨要作用. 胶原酶活性存肝纤维化形成的不同阶段有不同变 化,炎症损伤阶段常有升高,导致正常组{结构破 坏,而扁煳埘一PI-抑制因子表达增Jill,活性下降,导 致胶原C社!本实验结束时模刑大鼠肝脏炎症仍较 明闻IJl'1tJ质性胶原酶活性有轻度上升.但药物明 显增加质比胶原酶的活性.从f何促进胶原降解与 肝纤维化的好转:因此,目'草酸二铵一方面通过抗 脂质过氧化钡伤,抑制胶原增,,另一面,通过促 进胶原酶活性,促进过鹰增生沉引的胶原降解,从 m】发挥Jt:+tl;ll4:纤维化的作川t: (敏谢:汀茅lE大天晴药业脞份有限公司提供实验药物, 特此敛谢f1 [参考文献] I:硅荣.摄红畿.张瑞辟1十草敬二胺治疗肝纤维化近 期疗技蛆察jJ.中国I{I丽隈结台消化杂志.2001,9 (4):2I6—217. 2]j三臻柏,赵长青李风华H草酸二恢埘二甲基幔硝 胺诱导日1:纤维化太鼠肝脏胶原增生沉积的影响[J:.中 国巾阿医结音脾胃杂志,D0[】.8(5:28I一284. 3]制.吴定中,刘成海.等.扶正化癀中药复方促避 cch大鼠肝纤维化逆转的配伍机理研究[J].上海中医 药大学,2002,l6(1):39—41. [4]国家基本药物领导小组编.国家基本药物一西药[M]. 北京:人民卫生出版社,1999.51l一5l2. [5]Jmn~lIS,FinelliVN,QueHeeSS.Asimplemethodtode- terminenanogramlevelof4——hydroxyprolineinbiologicaltis?? suesIJJ.AnalBiochem,1981,l12(1):70—75. 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