法国梧桐叶与果

法国梧桐叶与果 材料与方法1.1 材料与试剂 法国梧桐叶、法国梧桐落果 采集于新乡市洪门镇。 正己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇、正丁醇、无水乙醇、钨酸钠、磷钼酸均为分析纯天津市科密欧化学试剂有限公司;磷酸分析纯(中国莱阳市双双化工有限公司);AlCl3 10;CH3COOK 1 M;DPPH 11-二苯基-2-三硝基苯肼为 Sigma 公司产品; DMSO 二甲基亚砜;FeSO47H2O 10 mM;EDTA(乙二胺四乙酸酸根离子10 mM);2-脱氧核糖(10 mM);磷酸盐缓冲液(0.1 M，pH7.4);H2O2(10 mM);TCA(三氯乙酸 2.8);TBA(二硫代巴比妥酸 1);磷酸盐缓冲液(pH6.6);K3FeCN6 铁氰化钾，1;TCA(三氯乙酸 10);FeCl30.1;蒸馏水 实验室自制。1.2 仪器与设备 KQ-500B 型超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司;RE-52AA 型旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂;DHG-9070 型电热古风恒温干燥箱 上海市三发科学仪器有限公司;BS124S 电子天平 北京赛多利斯仪器系统有限公司;HH-8 型水浴锅 金坛市杰瑞尔电器有限公司;HH-S 精密数显恒温水浴锅 常州市国立试验设备研究所;WB-2002 水浴锅 郑州长城科工贸有限公司;UV-1100 紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限公司;Anke TGL-16B 型台式离心机 上海安亭科学仪器厂 ;SHB-III 型循环水式多用真空泵 郑州国瑞仪器有限公司;低温冷却循环泵 郑州长城科工贸有限公司。1.3 实验方法1.3.1 提取与萃取 用 将粉碎好的法国梧桐叶和果实分别乘装于 10L 广口瓶内， 90乙醇和 95乙醇溶液浸泡于 50 ?恒温水浴锅中，加热回流提取 24 h。对提取液用旋转蒸发仪进行浓缩蒸干，以上过程重复三次，得法国梧桐叶和果实提取物，再分别向法国梧桐叶和果实提取物中加入水，以正己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇的顺序按 1:1 的比例进行萃取;每种溶剂萃取三次，最后得到水层。去除溶剂得到的法国梧桐叶和果实提取物和各层萃取物组分。1.3.2 DPPH 自由基清除能力的测定 原理:DPPH 自由基是一种比较稳定的自由基，在 517 nm 处有最大吸光度其醇溶液呈紫色。当它遇到自由基清除剂时，与自由基清除剂配对，化合物溶液从紫色变为淡黄色。此时，DPPH 基团在 517 nm 处的吸光度减小，由于褪色程度与电子数量成定量关系，因此可以通过测定加入样品时的 517 nm 下的吸光度变化，从而求得该样品对自由基的消除率1。 样品对 DPPH 自由基的清除能力依据 Yen 和 Chen(1995)23的方法修改后 即来测定样品清除 DPPH 自由基的能力。 Ao : 0.5 mL 0.2 mmol/L 的 DPPH 甲醇溶液0.5 mL 试样溶剂，Ai:0.5 mL 0.2 mmol/L 的 DPPH 甲醇溶液0.5 mL 待测样品溶液， j: 0.5 mL 样品溶液 0.5 mL 试样溶剂混合均匀后室温下于暗处静置 30 Amin，然后在 517 nm 处测定吸光度。由下面的方程式(1)计算样品对 DPPH 自由基的清除能力: 消除效率()1-Ai-Aj/Ao×100, (1) 其中:A0 为对照组的吸光度 Ai 为测试组的吸光度 Aj 为空白组的吸光度 方法:将正己烷层、二氯甲烷层、乙酸乙酯层、正丁醇层、水层和 95乙醇层待测样品分别配制成 25、50 、100 μg/mL 的一系列溶液，然后配制 Ao 、Ai、Aj，最后测定对应待测样品浓度的吸光度，每个样品的每个浓度重复 3 次。计算DPPH 自由基清除率和不同层样品对 DPPH 自由基清除能力的 EC50 值，并绘制DPPH 自由基清除率对样品浓度柱状图。1.3.3 羟基自由基消除能力的测定 原理:Fe3的螯合物如 Fe-EDTA存在下的 Fenton 型 Haber-Weiss 反应可产生OH，反应方程式为:Fe2 H2O2 ?Fe3 OH- OH 工艺上将 Fe2和 H2O2 的组合成为 Fenton 试剂4。反应生成的羟基自由基能够进攻 2-脱氧核糖，使其降解生成丙二醛。氧化产物丙二醛能够与硫代巴比妥酸进行显色反应，生成粉红色物质在 532 nm 处 有最大光吸收。如果在溶液体系中加入具有清除OH 功能的被测物质，它可以与 2-脱氧核糖竞争羟基，使产生的红色物质减少，即 532 nm 处的吸光度减小。因此可以通过测吸光度间接测其对羟基自由基的清除作用5。 由下面的方程式(2)计算样品对羟基自由基的清除作用: 消除效率()(1-As/Ao)× 100, (2) 其中:As 为待测溶液的吸光度 Ao 为对照组溶液的吸光度 方法:将正己烷层、二氯甲烷层、乙酸乙酯层、正丁醇层、水层和 95乙醇层待测样品分别配制成 250 、500 、1000 μg/mL 的一系列溶液，先后依次加入100 μL 的 FeSO47H2O、EDTA、2-脱氧核糖、100 μL 各浓度的样品溶液(空白对照组加入 100 μL 样品溶剂水)、500 μL 磷酸缓冲溶液，100 μLH2O2 于试管中于 37?水浴加热 4 小时。然后加入三氯乙酸TCA、二硫代巴比妥酸(TBA)各500 μL。 之后将它们放在 100?恒温水浴锅中加热十分钟后，冷却至室温后在3000 rpm 下离心 5 分钟。最后分别测定各样品在 532 nm 下的吸光度，每个样品的每个浓度重复 3 次。计算对应待测样品浓度时其对羟基自由基的清除率，并绘制清除率对样品浓度柱状图。1.3.4 还原能力测定 在还原能力测定实验中，来自样品中的抗氧化剂能将铁氰化钾中的 Fe3 还原成 Fe2，Fe2 进一步生成在 700nm 处有最大吸光值的 Perl 普鲁士兰，因此测定 700 nm 处吸光值的高低可以间接反应抗氧化剂还原能力的大小6。 将法国梧桐落果提取物样品配制成系列浓度: 250、500、1000 μg/mL，分别移取各浓度的样品 0.2 mL 于试管中加入磷酸盐缓冲液pH 6.6 0.5 mL 再加入1铁氰化钾溶液 0.5 mL 在 50 ?下反应 30 分钟。然后加入 10 三氯乙酸溶液0.5 mL 充分混和均匀，3000 rpm 下离心 10 分钟。移取上清液 0.5 mL 于试管中，加入 0.5mL 蒸馏水，再加入 0.1 三氯化铁 0.1 mL，常温下反应 5 分钟，然后使用紫外可见分光光度计于 700nm 波长下测定吸光值。同时做空白对照组，不加样品，加入 0.2 mL 蒸馏水。 根据各反应组吸光度的高低评价法国梧桐落果 95乙醇提取物、各萃取层和法国梧桐叶子 90乙醇提取物、各萃取层的抗氧化能力。吸光度越高表示还原能力越强。2.结果与分析2.1 法国梧桐果实实验结果:2.1.1. DPPH 自由基清除能力的测定结果及讨论1 样品对 DPPH 自由基的清除率数据见表 1: 表 1 样品对 DPPH 自由基清除率()数据 样品 25μg/mL 50μg/mL 100μg/mL 95EtOH 萃取物 14.27 17.31 21.90 C6H14 萃取物 6.76 11.05 12.29 CH2Cl2 萃取物 4.36 9.23 22.71 EtOAc 萃取物 21.46 22.32 54.94 BuOH 萃取物 9.55 82.68 97.90 H2O 萃取物 47.71 48.39 74.87 2 样品对 DPPH 自由基清除能力柱形图见图 1 图 1 DPPH 自由基清除能力柱形图 可以看出，各个萃取层的 DPPH 清除能力均随着浓度的增加而增强。其中95EtOH 层，MC 层，EA 层和 Bu 层随浓度变化效果明显，100ppm 均比 50ppm增加 10以上，EA 层达到了 32.62。MC 层、EA 层、Bu 层，DPPH 自由基清除能力整体随着极性的增加而增加，Bu 层的 50ppm 比 25ppmDPPH 自由基清除能力有显著的提高，达到 73.13。由此可见 Bu 层有一定的科研价值，值得进行深入研究。2.1.2 还原能力测定结果及分析1) 不同层样品还原能力的测定数据见表 2 表 2 样品的还原能力的测定数据 样品 250μg/mL 500μg/mL 1000μg/mL 95EtOH 提取物 0.218 0.257 0.281 C6H14 萃取物 0.171 0.175 0.179 CH2Cl2 萃取物 0.292 0.360 0.394 EtOAc 萃取物 0.329 0.394 0.426 BuOH 萃取物 0.240 0.294 0.336 H2O 萃取物 0.031 0.031 0.0312.2 不同层样品还原能力的测定柱形图见图 2 图 2 样品还原能力的测定柱形图 从表中和图中可以看出来 95EtOH 层、Mc 层、EtOAc 层、Bu 层的还原能力较强，并且 随着浓度的加大，其还原能力也随之增强，其中 Mc 层和 EtOAc层的还原能力较为突出。水层的还原能力较弱，且随浓度的加大其还原能力基本保持不变，可能是前几个萃取层对具有还原能力的化学物质萃取的效果比较充分。其中，Mc 层和 EtOAc 层相对于其他各萃取层有一定的研究价值。不过总体来说比较国内外文献，还原能力偏弱。2.1.3 羟基自由基消除能力的测定结果与分析1 不同层样品羟基自由基消除能力的测定数据见表 3 表 3 样品对羟基自由基清除率()数据 样品 250μg/mL 500μg/mL 1000μg/mL 95EtOH 提取物 53.24 62.44 65.44 C6H14 萃取物 43.92 50.57 52.66 CH2Cl2 萃取物 43.29 55.33 57.82 EtOAc 萃取物 40.95 48.06 51.20 BuOH 萃取物 36.01 36.76 41.20 H2O 萃取物 23.46 29.61 42.542 不同层样品羟基自由基消除能力的柱形图见图 3 图 3 样品羟基自由基清除能力测定柱形图 从表 3 和图 3 可以看出，各个萃取层对羟基自由基的消除能力均随着样品浓度的增大而增强。且除了 95EtOH 层外，从 H 层到 W 层，各萃取层的对羟基自由基的消除能力有下降趋势。 95EtOH 层对羟基自由基的清除能力效果最好，250μg/mL，500μg/mL，1000μg/mL 对羟基自由基的清除能力分别达到 53.24，62.44，65.44。且 H 层，Mc 层，EA 层对羟基自由基的消除能力相差不大，可以进一步深入研究。2.2 法国梧桐叶的研究实验结果2.2.1 DPPH 自由基清除能力的测定结果及讨论1 样品对 DPPH 自由基的清除率数据见表 1: 表 1 样品对 DPPH 自由基清除率()数据 样品 50μg/mL 100μg/mL 250μg/mL 500μg/mL 1000μg/mL EtOH 提取物 3.41 4.19 12.20 19.80 33.80 H 萃取物 6.57 6.06 7.13 19.40 21.90 Mc 萃取物 12.20 17.50 24.30 28.20 37.70 EA 萃取物 11.50 13.90 23.60 40.40 77.10 Bu 萃取物 11.50 15.10 25.40 51.60 74.70 W 萃取物 5.52 13.40 14.80 25.70 55.102 样品对 DPPH 自由基清除能力柱状图见图 1 图 1 DPPH 自由基清除能力柱状图 由上图可以看出，各个萃?〔阊返?DPPH 自由基清除能力随浓度的增加而增加，且在 50μg/mL 是各层样品的清除能力相差不大。EtOAc 层、Bu 层，和 W层样品的 DPPH 自由基清除能力随浓度变化明显，在 1000μg/mL 浓度时有较高清除效率，分别为 77.10、74.70、55.10。2.2.2 还原能力测定1 不同层样品还原能力的测定数据见表 2 表 2 样品的还原能力的测定数据(吸光度) 样品 50μg/mL 100μg/mL 250μg/mL 500μg/mL 1000μg/mL EtOH 提取物 0.203 0.305 0.374 0.456 0.54 H 萃取物 0.287 0.295 0.299 0.315 0.36 Mc 萃取物 0.31 0.316 0.352 0.426 0.516 EA 萃取物 0.329 0.379 0.501 0.605 0.683 Bu 萃取物 0.352 0.397 0.549 0.683 0.732 W 萃取物 0.355 0.385 0.473 0.584 0.7632)不同层样品还原能力的测定柱状图见图 2 图 2 样品还原能力的测定柱状图 依据表格和柱状图得出，各个萃取层样品还原能力随浓度增加而逐渐增强。H 层样品增长缓慢，吸光度从 50ppm 时 0.287 变化为 1000ppm 时的 0.360。从50ppm 到 250ppm，Mc 层无明显增强，但从 250ppm 变化到 1000ppm，Mc 层还原能力明显增强。EtOH 层样品的还原能力随浓度增长增长明显，吸光度从50ppm 的 0.203 变化到 1000ppm 的 0.540。除此之外 EtOAc 层，Bu 层与,层样品均在 50ppm 到 100ppm 浓度变化时还原能力增长不明显， 再随浓度增加，还原能力显著增强。2.2.3羟基自由基消除能力的测定1 不同层样品羟基自由基消除能力的测定数据见表 3 表 3 样品对羟基自由基清除率()数据 样品 50μg/mL 100μg/mL 250μg/mL 500μg/mL 1000μg/mL EtOH 提取物 0.00 29.69 41.79 52.49 54.34 H 萃取物 0.22 32.55 43.75 44.48 45.21 Mc 萃取物 3.59 30.31 45.60 48.40 54.06 EA 萃取物 33.33 41.06 48.85 53.89 55.57 Bu 萃取物 24.23 35.46 47.56 52.44 56.13 W 萃取物 25.27 38.77 48.01 53.33 56.302 不同层样品羟基自由基消除能力的柱形图见图 3 图 3 样品羟基自由基清除能力测定柱形图 由表 3 和图 3 可以看出，各样品层对羟基自由基的清除能力随浓度增加而增强。 层样品在 50ppm 处清除率为 0.22， H 50ppm 时达 32.55，250ppm、500ppm、1000ppm 几乎无增强，分别为 43.75、44.48、45.21。90EtOH 提取物样品在 50ppm 时清除效率为零，100ppm 时达 29.69。EtOAc 层样品清除效率一直保持高位增长，50ppm 时 33.33，明显高于各层同浓度下清除效率，且随浓度保持平稳增长，在 1000ppm 时达到 55.57，仅次于 Bu 层的 56.13和 W 层的56.0。综合各层来看，1000ppm 时除 H 层外，其他各层样品的清除效率几乎平衡，分别为 90EtOH 提取物样品 54.34、Mc 层 54.06、EtOAc 层 55.57、Bu 层 56.13、W 层 56.30。2.3 叶与果实提取物与各萃取物的抗氧化活性对比2.3.1 DPPH 自由基清除能力对比法国梧桐叶与落果提取、萃取物在一定浓度下的对比如下: 表 1:50μg/mL 时各馏分 DPPH 自由基清除能力对比 提取物 H Mc EtOAc Bu W叶 3.41 6.57 12.20 11.50 11.50 5.52果实 17.31 11.05 9.23 22.32 82.68 48.39图 1:50μg/mL 时各馏分 DPPH 自由基清除能力柱状图由表 1、图 1 可以看出，法国梧桐叶子、果实的各馏分 50μg/mL 时，在 DPPH 自由基清除能力方面，除叶子 Mc 层馏分 DPPH 自由基清除率稍高于果实外(仅 ，其余各馏分，果实均强于叶子，且在 Bu 层、W 层较为明显，分别多出2.97)71.18、42.87。表 2:100μg/mL 时各馏分 DPPH 自由基清除能力对比 提取物 H Mc EtOAc Bu W叶 4.19 6.06 17.50 13.90 15.10 13.40果实 21.90 12.29 22.71 54.94 97.90 74.87图 2:100μg/mL 时各馏分 DPPH 自由基清除能力柱状图由表 2、图 2 可以看出，法国梧桐叶子、果实的各馏分 100μg/mL 时，在 DPPH自由基清除能力方面，果实的各馏分均强于叶子，在 EtOAc 层、Bu 层、W 层中，果实的馏分的 DPPH 自由基清除率分别比叶子的馏分高 41.04、82.08、61.47，差异较为明显，Mc 层馏分差异最小(果实馏分仅比叶子 DPPH 清除率高 5.21)。总的来说，法国梧桐叶子及果实各馏分在 50μg/mL、100μg/mL 时，在 EtOAc 层、Bu 层、W 层中，果实的馏分的 DPPH 自由基清除率均远强于叶子的馏分，差异最明显的是 Bu 层均高于叶子馏分 70以上，比较有价值。其余各馏分差异不明显。2.3.2 还原能力对比法国梧桐叶与落果提取、萃取物在一定浓度下的对比如下:表 1:250μg/mL 时各馏分还原能力对比 提取物 H Mc EtOAc Bu W叶 0.374 0.299 0.352 0.501 0.549 0.473果实 0.218 0.171 0.292 0.329 0.240 0.031图 1:250μg/mL 时各馏分还原能力柱状图表 2:500μg/mL 时各馏分还原能力对比 提取物 H Mc EtOAc Bu W叶 0.456 0.315 0.426 0.605 0.683 0.584果实 0.257 0.175 0.360 0.394 0.294 0.031图 2:500μg/mL 时各馏分还原能力柱状图表 3:1000μg/mL 时各馏分还原能力对比 提取物 H Mc EtOAc Bu W叶 0.540 0.360 0.516 0.683 0.732 0.763果实 0.281 0.179 0.394 0.426 0.336 0.031表 3:1000μg/mL 时各馏分还原能力柱状图 从以上各表和图可以看出，法国梧桐叶子和果实提取物及各馏分分别在250μg/mL、500μg/mL、1000μg/mL 时的还原能力，具有相似的规律:叶子各馏分的还原能力均大于果实，且在 EtOAc 层、Bu 层、W 层差异更明显， W 层相差最大，各浓度分别多出 0.442、0.553、0.732。2.3.3 羟基自由基消除能力对比法国梧桐叶与落果提取、萃取物在一定浓度下的对比如下:表 1:250μg/mL 时各馏分羟基自由基消除能力对比 提取物 H Mc EtOAc Bu W叶 14.79 43.75 45.60 48.85 47.56 48.01果实 53.24 43.92 43.29 40.95 36.01 23.46图 1:250μg/mL 时各馏分羟基自由基消除能力柱状图表 2:500μg/mL 时各馏分羟基自由基消除能力对比 提取物 H Mc EtOAc Bu W叶 52.49 44.48 48.40 53.89 52.44 53.33 果实 62.44 50.57 55.33 48.06 36.76 29.61图 2:500μg/mL 时各馏分羟基自由基消除能力柱状图表 3:1000μg/mL 时各馏分羟基自由基消除能力对比 提取物 H Mc EtOAc Bu W叶 54.34 45.21 54.06 55.57 56.13 56.30果实 65.44 52.66 57.82 51.20 41.20 42.54 从以上各表和图可以看出，法国梧桐叶子和果实提取物及各馏分在250μg/mL 时的羟基自由基消除能力，提取物层、H 层果实的高于叶子的。Mc层、EtOAc 层、Bu 层、W 层叶子大于果实，且差异逐渐增大，分别是:2.31、7.9、24.55。可以看出，W 层叶子馏分羟基自由基消除能力远大于果实。500μg/mL、1000μg/mL 时，提取物层、H 层、Mc 层，果实各馏分羟基自由基消除能力大于叶子，但差异均不是较明显。EtOAc 层、Bu 层、W 层叶子大于果实，且差异逐渐增大。综合来说，提取物层、H 层、Mc 层，在羟基自由基消除方面，差异较小，但 EtOAc 层、Bu 层、W 层叶子大于果实，且差异逐渐增大，W 层最显著。3 结论1 在法国梧桐果实提取物及各馏分抗氧化活性测定中随样品浓度增加抗氧化 活性增强。但在不同方面，果实各馏分表现出来的性质不同。在 DPPH 自由 基消除能力方面，随萃取溶剂极性增大，馏分消除能力增强。但各层随浓度 增加而消除能力增强的程度不均。羟基自由基消除上，随溶剂极性增加消除 力下降。Mc 层、EtOAc 层还原能力较好。2 在法国梧桐叶提取物及各萃取馏分中，同样随样品浓度增加抗氧化活性增强。 EtOAc 层、Bu 层在各抗氧化活性方面均较强，但在随浓度变化趋势上，增长 程度不均，无明显规律。3 对法国梧桐叶子和果实提取物及各馏分在抗氧化活性方面进行对比后发现: 果实的提取物和各馏分对 DPPH 自由基的清除能力较叶子强，特别是 Bu 层、 W 层馏分差异更明显。而在还原能力及羟基自由基消除能力方面，叶子表现 出来更好地抗氧化活性性质。参考文献:1 S Z Nishanbaev Z A Ku.