流式细胞术分析嗜碱性粒细胞活化试验在过敏性疾病诊断中的应用[权威资料]

流式细胞术分析嗜碱性粒细胞活化试验在过敏性疾病诊断中的应用[权威资料] 流式细胞术分析嗜碱性粒细胞活化试验在过敏性疾病 诊断中的应用 [摘要] 流式细胞术是20世纪70年代发展起来的一 种快速的细胞定量分析和分选的新技术，具有测量速度快、 高灵敏度、高精确度、多参数分析、高纯度分选的特点。过 敏性疾病为威胁人类生命健康的疾病之一，但其诊断通常依 赖病史以及适当的确证试验，但这些确证实验尚缺乏有力确 证依据。过敏反应发生时，嗜碱性粒细胞面分子可发生相 应变化，通过对其表面标志物的检测，可达到对过敏性疾病 进行鉴别诊断的目的。本文就流式细胞术分析嗜碱性粒细胞 活化试验的几种设门筛选嗜碱性粒细胞思路加以介绍，并对 流式细胞术在过敏性疾病诊断中的应用价值做一综述，从而 为流式细胞术在过敏性疾病诊断领域中广阔的应用前景提供 一有力的理论支持。 [关键词] 流式细胞术;嗜碱性粒细胞活化试验;过 敏性疾病 [] R725.6 [] A [] 1673-7210(2014)04(a)- 0164-05 Application of flow cytometry analyzing basophil activation test in allergy diagnosis ZHANG Haoyue HOU Yangdong GAO Cairong SONG Wei Department of Forensic Medicine， Shanxi Medical University， Shanxi Province， Taiyuan 030001， China [Abstract] Flow cytometry is a new technology for rapid quantitative analysis and sorting，which is developed during 1970s. It has many advantages such as rapid speed， sensitivity， accuracy， multi parameters， and high purity selection. Allergic disease is one of the diseases which is threatening human life and health. Allergic disease diagnosis usually depends on the history and the confirmatory test. However， those tests are lack of proven evidence. When allergic reaction occurs，basophils surface molecules will change correspondingly，so that detect these surface markers can be a feasible method of differential diagnosis of allergic disease. This paper introduces several gating strategies in a flow cytometry analyzing basophil activation test， and also reviews of the application value，in order to provide more powerful theoretical support for flow cytometry in the diagnosis of allergic disease. [Key words] Flow cytometry; Basophil activation test; Allergic diseases 随着工业化社会的到来，过敏性疾病已逐渐成为影响 甚至威胁人类生命健康的疾病之一。早在20世纪前， Portier和Richet就对过敏性疾病进行了描述，但速发型过 敏反应的诊断目前仅依靠临床表现和病史，尚缺乏可靠的实 验室诊断指标，并且但许多方法都是重现过敏反应过程，这 使得检测过程并不是绝对安全且令人愉快的[1]。自1991年 Knol等人阐述了关于嗜碱性粒细胞脱颗粒后的表面标记物 CD63以来，建立在嗜碱性粒细胞活化功能的流式细胞术也随 之发展起来[2]。近年来国内外研究进一步发现还可从其他细 胞表面分子的方向如CD45、CD123、CD69、CD203c[3]以及 CD13、CD164、CD107a、CCR3、CRTH2、P38MAPK等分子入手， 对过敏性疾病加以诊断，可见流式细胞术作为一种新兴细胞 分析技术，在过敏性疾病的诊断方面具有很大的潜力。本文 就流式细胞术分析嗜碱性粒细胞活化试验的几种设门筛选嗜 碱性粒细胞思路加以介绍，并对流式细胞术在过敏性疾病诊 断中的应用价值做一综述，以期为今后实验工作提供有关理论依据和指导。 1 流式细胞术及嗜碱性粒细胞活化试验 1.1 流式细胞术 流式细胞术(flow cytometry，FCM)是利用流式细胞仪对处在快速、流动、直线运动状态下的荧光标记后的细胞或者颗粒进行定性、定量，并加以分选的细胞分析技术。其具有高速度、高灵敏度、高精度及高分辨率、分选纯度高、分析参数多的特点。 常用的胞术胞活化脱颗粒时的表面标志物后，基于嗜碱性粒细胞功能的的流式细胞术常用的荧光染料有异硫氰酸荧光素(FITC)、藻红蛋白(PE)、多甲藻叶绿素蛋白(PerCP)和一些能量传递的复合染料。这些染料可标记各抗体，并且不影响抗体自身的免疫反应特性。同时，这些染料经激发后各可发出不同波长的荧光。 荧光免疫标记一般分为间接荧光免疫标记和直接荧光免疫标记。间接荧光免疫标记:利用“一抗”标记细胞的特异抗原，再用荧光标记的“二抗”来检测细胞上的“一抗”。此标记法优点在于具有信号放大作用，但也存在很强的非特异干扰信号的缺点。直接荧光免疫标记:将各种不同的荧光素分子直接标记在各种不同特异性的单克隆抗体上。这样，若同时研究细胞不同抗原成分时，可选用不同的荧光素标记相应单克隆抗体。近年来FCM一般采用此标记法[4]。 1.2 嗜碱性粒细胞及嗜碱性粒细胞活化试验 1.2.1 嗜碱性粒细胞 嗜碱粒细胞由CD34+的多能干细胞分化而来，迁移至骨髓中成熟，在外周白细胞中占不到1%[1]，其胞浆中含有嗜碱性颗粒，可贮存并释放大量的组织胺、IL-4和IL-3，以及大量的白三烯C4及L1、B4[5-6]。与肥大细胞相似，常被认为是“循环中的肥大细胞”。嗜碱性粒细胞是参与过敏反应的效应细胞之一。当受到特定变应原刺激后，嗜碱性粒细胞活化，从而同时启动脱颗粒及合成新 介质两个平行过程，其中嗜碱性粒细胞脱颗粒后会释放出组胺、趋化因子、肝素等介质;同时嗜碱性粒细胞膜磷脂降解，继而释放花生四烯酸。 1.2.2 嗜碱性粒细胞活化试验 嗜碱性粒细胞活化时，其表面的一些分子发生变化，从而可以采用流式细胞术加以分析。方法步骤是:在100 μL肝素化血液中加入20 μL刺激缓冲液在37?下孵育10 min。将过敏原、具有趋化作用的多肽以及抗IgE抗体作为正控制，添加的洗涤液为负控制。置于冰箱冷却5 min，终止嗜碱性粒细胞脱颗粒。随后，细胞与被PE标记的抗IgE抗体以及被FITC标记的抗CD63抗体结合。经红细胞裂解和洗涤后，采用流式细胞仪对嗜碱性粒细胞的活化进行评估，从而量化嗜碱性粒细胞的活化程度[7]。活化程度通常用嗜碱性粒细胞活化率(SI)来表示，即活化的嗜碱性粒细胞占全部嗜碱性粒细胞的比率，一般认为SI?2或者考虑到非特异性激活的因素，认为绝对嗜碱性粒细胞活化率?5时嗜碱性粒细胞活化[8]。 1.2.3 嗜碱性粒细胞表面免疫标记分子 研究表明，嗜碱性粒细胞在活化后，在脱颗粒释放介质的同时，其细胞膜表面的分子标志物也会随之发生改变，如CD45、CD203c、CD63、CD69以及CD123[9]，还有CCR3、CRTH2、CD13、CD107a、CD107b、CD164等。 CD63(gp53，LAMP-3)溶酶体颗粒糖蛋白是十四次跨膜蛋白超家族中的一员，在嗜碱性粒细胞、肥大细胞、血小板及巨噬细胞上表达。嗜碱性粒细胞未活化时，CD63固定在胞质内颗粒上，仅仅表达于颗粒膜表面。嗜碱性粒细胞活化时，经胞吐作用颗粒与质膜融合后，CD63可在活化的嗜碱性粒细胞表面产生高表达[10]。利用CD63这一特性可更加准确计算出嗜碱性粒细胞活化率。在青霉素过敏患者中，用9种过敏原刺激患者血清中嗜碱性粒细胞，相互比较后观察CD63的特异性，最终证明CD63可作为青霉素过敏患者特异性的观 察指标[11]。因此，CD63是活化嗜碱性粒细胞较好的标志物。 CD203c又称神经细胞表面分化抗原，E-NPP3。属于E-NPPs家族中的?型糖基化跨膜分子，可催化寡居核苷酸、核苷类磷酸盐及NAD的水解。仅表达在D34+起源细胞、嗜碱性粒细胞以及肥大细胞的表面，在活化状态嗜碱性粒细胞的表面，CD203c的表达水平明显高于CD63[10]。因其在嗜碱性粒细胞未激活的状态下也有少量表达，故提出CD203c可作为嗜碱性粒细胞特异性激活标志物[12]。 CD45又称白细胞共同抗原，广泛表达于除成熟红细胞和血小板以外的所有血细胞表面，而在机体其他器官组织细胞不表达，具有良好的靶向性[13-14]。其在不同系的成熟细胞上表达的抗原密度不同，淋巴细胞>单核细胞>粒细胞>红细胞(存在于有核细胞表面)，细胞越幼稚CD45表达量越小[15]。因此，可将CD45作为所有白细胞的标志物，从而为正确设门捕获病理细胞提供基础[16]。 其他表面标记分子如CCR3又称为嗜酸性粒细胞趋化因子受体-3，主要表达在嗜碱性粒细胞、肥大细胞以及Th2淋巴细胞表面。在T细胞表达时与CD3结合可提高纯化率。CRTH2也同样表达在嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞以及Th2淋巴细胞表面。通过联合SSC与CD3可进一步识别嗜碱性粒细胞。CD123为IL-3受体的一个亚单位，其高表达于外周血的嗜碱性粒细胞与树突细胞表面，与CCR3表达水平相似，且优于IgE[2]。 1.2.4 筛选嗜碱性粒细胞的几种设门思路 嗜碱性粒细胞活化实验对全血的要求十分严格，在对样本进行处理后，如何应用分析软件设门寻找出满足要求的嗜碱性粒细胞则是试验的关键，以下介绍几种利用细胞分子寻找嗜碱性粒细胞的设门方法: ?利用IgE、CD63联合设门。在对嗜碱性粒细胞进行设门筛选时，可先利用前向角与侧向角选出嗜碱性粒细胞所 在大致区域，之后通过IgE-FITC标记出嗜碱性粒细胞，最后利用CD63确定出活化的嗜碱性粒细胞[11]。流式细胞术对于碘造影剂的过敏诊断是有实用价值的。 ?利用IgE、CD45、CD63/CD203c联合设门。有人对猫上皮过敏进行研究的一项实验，标记采用anti-IgE PE、anti-CD45 PerCP、anti-CD63 FITC 以及anti-IgE FITC、anti-CD45 PerCP、anti-CD203c PE两套[17]。首先采用低CD45高IgE表达来选出嗜碱性粒细胞，之后用 CD63/CD203c将活化的嗜碱性粒细胞选出。最终得出，IL-3可提高嗜碱性粒细胞的活化程度，使CD63表达敏感性增强，但对CD203c却不能达到同样效果，因为IL-3可同时提高静息状态及活化状态下CD203c的表达，导致两者表达量差距更加不明显。 ?利用CD123、HLA-DR、CD63联合设门。最近，以CD63为基础的检测，可使用特化嗜碱性粒细胞的抗CD123和抗人白细胞抗原(HLA)DR抗体标签替代。有报道采用此思路对支气管哮喘患儿以及荨麻疹患者外周血加以检测，将CD123+ HLA DR-定义为嗜碱粒细胞，CD63+、CD123+、HLA-DR-定义为活化嗜碱粒细胞，最终通过管内小球数的绝对计数，从而达到对活化嗜碱粒细胞计数的目的[18-19]。但也有报道称，CD123、HLA-DR在树突状细胞的亚群上表达，非嗜碱性粒细胞的特异性标志[20]。 ?利用CD45、CD63、CD203c联合设门。因为外周血中CD203c只限在嗜碱性粒细胞表达，因此不需要IgE抗体或CD123/HLA-DR抗体确定细胞，为实验提供了有利条件。户尘螨致敏的研究则通过对CD45、CD63和CD203c联合设门来寻找嗜碱性粒细胞，先以FSC和SSC参数大致观察，然后在CD45和SSC双参数点图上选取有核细胞，再在CD203c和SSC双参数点图上选取CD203c阳性的细胞，之后利用CD45与SSC将选出的细胞再次进行回选，排除淋巴细胞、单核细胞的干扰，最后利用CD63及CD203c选出活化的嗜碱性粒细胞，以阴性对照作为参考，如果CD63 上调比例达到5%，则认为嗜碱性粒细胞脱颗粒试验阳性[21]。 ?利用CRTH2、CD4、CD63联合设门。有报道研究变应性鼻炎[20]时采用的是另一种设门方法，先在FSC和SSC双参数图上大致观察，在CRTH2和SSC双参数点图上，参照阴性对照圈定位于SSC坐标底部的CRTH2+ 细胞;然后在CD4和CRTH2的双参数点图上选取CRTH2+、CD4-细胞(即嗜碱性粒细胞);最后在CRTH2+、CD4-细胞中加设CD63门，在CD63和CRTH2双参数点图上选取CRTH2+、CD63+细胞(即活化的嗜碱性粒细胞)，最终得出嗜碱性粒细胞活化率。 ?利用CRTH2、CD203c、CD3联合设门。有报道将CD203c作为嗜碱性粒细胞活化特异性的观察指标，旨在研究发生慢性荨麻疹时，患者外周血清中嗜碱性粒细胞的活化率[22]。CRTH2特定表达于人外周血嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞表面， 其在识别嗜碱性粒细胞方面优于IgE及CD123[23]，近来被认为也可用于外周血嗜碱性粒细胞的识别。因此许多研究选取CRTH2、CD203c、CD3分子进行联合设门，先用FSC和SSC参数大致观察，然后利用CD3与SSC选出CD3-的细胞，之后利用CD203c和CRTH2筛选出CD203c+细胞。以未活化的嗜碱性粒细胞作为对照，如果CD203c的表达量超过10%，那么可以认为嗜碱性粒细胞脱颗粒试验阳性。 迄今为止，在文献中报道的大多数涉及嗜碱性粒细胞的研究都仅采用荧光标记的IgE抗体和利用CD63的上调来捕获的嗜碱性粒细胞，从而从嗜碱粒细胞活化方面评估过敏反应。当然许多问题仍有待解决，如优化测试的分析性能，检查分析前条件，设定最优的门控，引入新的运算法和参数，引进IgE抗体的控制以及寻找新的活化标志物[24]。 2 流式细胞术在过敏性疾病诊断中的应用 采用基于单克隆抗体技术的流式细胞术分析嗜碱性粒细胞活化情况，从而精确分析出嗜碱性粒细胞活化数量以及功能状态，以期为过敏性疾病的诊断提供客观准确的依据 [11]。与体内试验的皮肤点刺试验相比，流式细胞术具有特异、高效、安全、省时的优势;与组胺释放试验等体外试验相比，嗜碱性粒细胞活化试验具有准确、简单易行的优点，所以说流式细胞术可作为研究过敏性疾病的又一新型手段。采用流式细胞术分析嗜碱性粒细胞活化以CD63及CD203较为敏感，近几年研究较多[25]。 2.1 CD63相关性检测 在检测针对梯牧草花粉以及屋尘螨过敏的哮喘及鼻炎患者血清后发现，嗜碱性粒细胞中CD63的表达水平与白三烯及组胺的释放水平相关，同时显示CD63表达的特异性为98.4%，敏感性为93.3%[5]。 通过对IgE介导的食物过敏患者的血清进行检测后发现，嗜碱性粒细胞受刺激后除特异性表达CD63外，还同时可检测到LTC4的释放，且二者特异性和敏感性良好，因此可推测CD63与LTC4可作为IgE介导的食物过敏的客观诊断指标[26]。此项指标同样适用于橡胶过敏患者[27-28]。 在药物过敏反应中，肌松药过敏患者嗜碱性粒细胞激活后表达CD63，敏感性达54%，特异性达100%[29]。在β-内酰胺类过敏患者中，嗜碱性粒细胞活化后表达CD63的特异性与敏感性分别为93.3%、50%[30-31]。欲进一步提高诊断率，可联合CAP对IgE抗体进行检测。而在青霉素过敏患者中，嗜碱性粒细胞活化后CD63的特异性与敏感性分别为93.33%、65.12%，若想进一步提高阳性率，可采用FAST、RAST和ELISA联合测定sIgE、slgG和CD63含量，最终测得阳性率为90.7%。针对麻醉药物过敏患者，可联合利用CD63和CD203c表面分子对患者的过敏情况进行评估，与组胺释放试验相比，CD203c的敏感性为36%，CD63的敏感性达79%，组胺释放试验敏感性达64%，三项指标的特异性均达到100%[32]。 2.2 CD203c相关性检测 对过敏性体质患者研究发现，嗜碱性粒细胞在激活状态下，CD203c相较CD63而言，表达的敏感性以及特异性均升高[33]。 CD203c可作为诊断对昆虫毒液过敏的重要指标[34-35]。新近发现[36-37]，在重组过敏原的刺激下，嗜碱性粒细胞表面CD203c的表达水平可显著提高。而CD203不宜作为青霉素过敏患者的诊断指标[38]。 CD63和CD203c在对致敏患者进行变应原激发后，其迅速上调表明其可作为嗜碱性粒细胞活化特定标记。专一性与特异性IgE的测定相比却更高。尽管流式细胞术相当复杂、昂贵，但是相对于过敏反应或是矛盾的测试结果来说，流式细胞术还可提供额外的信息辅助分析，是一种很好的替代手段[39]。 2.3 其他分子相关性检测 CRTH2由于仅特异性的表达在嗜碱性粒细胞与嗜酸性粒细胞表面，故可与CD4联合以检测急慢性变应性鼻炎患者血浆中嗜碱性粒细胞活化率，从而揭示变应性鼻炎发作机制[20]。正因为CRTH2与PGD2在过敏性疾病中具有良好的相关性，以及CRTH2在迟发型超敏反应中担任重要角色，可通过检测慢性过敏性疾病患者的CRTH2，从而达到对迟发型超敏反应诊断的目的，以便为进一步治疗提供客观、准确的实验室依据[40]。同时，通过对接触性超敏反应，特别是慢性过敏性皮炎患者[41]研究后发现，CRTH2作为PGD2的受体，在超敏反应发生过程中起到了重要作用，所以说研究CRTH2分子拮抗剂，可有效地从发生机制上阻断过敏反应的发生，为接触性超敏反应提供针对性强的干预性治疗手段[42]。 CCR3分子目前已成为干预过敏性鼻炎的靶分子，其可以与α2巨球蛋白、ECP以及类胰蛋白酶联合，监控季节性过敏性鼻炎患者病情，CCR3与H1拮抗剂干预过敏性鼻炎的效果，从而达到治疗此疾病的目的[43]。而CCR3对于过敏性结膜炎的研究目前仅限于动物模型，实验在安慰剂与CCR3拮抗 剂的基础上，利用流式细胞术证明了CCR3与过敏性结膜炎具有相关性[44]。 CD69在过敏性鼻炎患者外周血NK细胞可显著升高，揭示了T淋巴细胞及单核细胞在过敏性鼻炎发生过程中的作用[45]。根据其在嗜酸性高反应性气道炎症疾病中扮演着重要的角色，证实了CD69可作为治疗过敏性鼻炎的又一靶向分子[46]。CD69与CD107a是T淋巴细胞活化的标志物，因此，在迟发型药物变态反应中证实具有良好的相关性、敏感性与特异性[47]。通过检测银屑病患者治疗前后外周血中CD13后发现，CD13与银屑病情变化有一定关系[48]，但在其他过敏性疾病中的研究还未见报道。 无论是近期发现的嗜碱性粒细胞识别抗原，CRTH2(DP2)(表达在Th2细胞的趋化受体同源分子)，还是活化抗原CD13，CD164(表达类似CD203c)和CD107a(与CD63表达同步)，被应用于流式细胞术中辅助过敏性疾病的诊断的价值仍待进一步探讨[39]。 3 结语 流式细胞术在过敏性疾病诊断方面虽已做过一定研究，但仍存在有待解决的问题。首先嗜碱性粒细胞仅参与由IgE介导的过敏反应，并不涉及非IgE介导途径引发的过敏反应[6]，故仍有一定缺陷。其次在标本保存方面，对于存放环境，存放时间并没有达到标准化，即时、4、6、12 h，甚至24 h均有涉及，究竟存放条件对实验结果的影响程度有多大，最佳条件是什么仍有待探讨。在检材处理方面，若采用全血法，血清成分会对检测结果产生干扰;若采用嗜碱性粒细胞分离法，则存在细胞成分损失以及体外激活的隐患。在检测结果分析方面，有文献报道由IgE介导的嗜碱性粒细胞的激活案例中，5%,10%并未出现特异性活化指标的上调[39]，以致影响检测的灵敏度与特异性，通过进一步分析得知，这种无应答状态可能只是暂时的，应排除其他干扰因素重新检测即可。最后，在检测指标方面，嗜碱性粒细胞特异 性的活化指标仍在进一步探索与确认中，近年来新活化抗原 的发现，如CD123、HLA-DR、CRTH2等应用于流式细胞术中分 析嗜碱性粒细胞活化试验的价值仍需探讨。 新工具物肥大细胞株、大鼠嗜碱性粒细胞白血病细胞 株[49]以及液相芯片技术[50]的发展，使得流式细胞术的应 用范围进一步拓展。综上所述，嗜碱性粒细胞活化试验在诊 断过敏性疾病，判断免疫治疗效果，评估疾病风险中有着重 要的临床价值，而流式细胞术分析嗜碱性粒细胞活化试验则 有助于更加全面、准确认识过敏性疾病，同时也弥补了过敏 性疾病实验室诊断方面的不足，为过敏性疾病的研究、诊 断、治疗提供了全新的视角与强有力的手段。 [参考文献] [1] Ebo DG， Bridts CH， Hagendorens MM， et al. 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(收稿日期:2013-11-08 本文编辑:苏 畅) 文档资料:流式细胞术分析嗜碱性粒细胞活化试验在过敏性疾病诊断中的应用 完 整下载 完整阅读 全文下载 全文阅读 免费阅读及下载 阅读相关文档:微量元素碘、硒、氟与甲状腺疾病相关性的研究进展 高等教育适 应论历史误区还是发展规律 瘦素在治疗糖尿病中的应用前景 全程音乐疗法对下 肢动脉闭塞症支架植入术患者舒适状况的影响 干预前后清洁切口手术围术期抗菌 药物使用及医院感染情况对照研究 长白山区野生北五味子藤皮挥发油成分分析 新形势下对社会医疗机构医院文化建设的探讨与思考 G蛋白偶联受体56在喉癌 组织中的表达及其意义 误诊为传统性脑血管疾病危险因素所致脑卒中的17例临床分析 血糖波动与糖尿病慢性血管并发症关系的研究进展 针灸合并早期中医干预治疗乳腺增生症的效果观察 农药中毒患者死亡危险因素的Logistic回归分析 多 感谢你的阅读和下载 *资源、信息来源于网络。本文若侵犯了您的权益，请留言或者发站内信息。我将尽快删除。*