【doc】肿瘤浸润淋巴细胞

【doc】肿瘤浸润淋巴细胞 肿瘤浸润淋巴细胞 第l期 Tit'}5} _1张家口医学院每报 肿瘤浸润淋巴细胞 及和照速 ———— 随着细胞生物学,分子生物学及分子免疫 学的发展,目前肿瘤生犄疗法日益受到^们的 重视.其中免疫活性细胞的过继免症治疗 (AIT.adoptiveimmunotherapy)是最人目 的手段之一AIT成功的关键是获取大量,高 赦,特异的具抗瘤活性的效应细胞.肿瘤浸润 淋巴细胞(T[L.tumoriMiitratinglymphocy'te) 作为一种蛙淋巴园子敬活杀伤细胞(LAK)后 的第二代抗揎效应细胞,其体外扩增后抗瘤活 性较LAK强50,100倍,因此目前对其研完极 为活跃.自Rt~aaberg1986年成功地分离并研 究TfL以来,不足十年中,^们对TIL进行了 较全面而深^的研究.本文综述近年来T[L从 制备到临康应用各方面研宽进展. 1TIL的制备 11单细胞悬渣的制备为使TIL得到有救 分离必频将瘤组织制成单细胞悬液.常规方 法为:手术切睬肿瘤标本后,去睬正常及坏死 组织.机械法是将瘤组织剪切成lmm3大小的小 块,再将其置于台0.01%透明质豉酶V,0. 002%DNA酶I,0.1%胶原酶?及抗生素的消 化液中室温消化6,24hs,消化过程中可不断搅 拌促其消化完垒.消化结束后,滤除来消化 组织即成细胞悬渍….鉴于酶在清化细胞闷 成分的同时,可能台影响TIL表面的某些成分 而影响后继试验,后又出现单酶法.国内李彪 如等_2成功地采用单胶原酶?(0.125g/100ml 盐水)或单肢原酶?(0.1g/100ml盐水)对组 职块在4"C下消化24hs,即可消化组织块至能用 滴管吹散成细胞悬液,谈方法经济,实用,方 便. 1.2T[L的分离己报道的有单纯重量法和离 心法较为成熟的是非连续密度梯度离心分离 浩:向离心管内顺序加入100%和75%的FI-[舟 离液,再将用Hanks液重悬曲细胞悬液铺干上 层,500g离心30舟钟在75%与100%舟商 液界面上即为富台TIL的制备物.而瘤细胞则 被隔于75%分离液上层l.此法分离淋巴细胞 纯度艚组鲠者为67.29?11.78,区域琳巴结 蛇 刘士先审棱7;.. 者为8208?8.48,活力>90%1.J. 上述方法简便,快速,但会造成一些淋巴 细胞亚群的丢失.据报道此法分离后淋巴细胞 回收章仅为原始数量的40%,60%.近来人们 采用单抗包被磁珠从细胞悬液中直接提取浸润 细胞获得成功.Dttrltant等[】据以往经验选择能 识别几乎所有浸润细胞的单抗混合液包被磁珠, 再将其与相应数量的细胞悬液相互作用,或先 用单抗包被细胞,再用包被有羊抗鼠Ig的磁珠 与细胞悬液作用.然后分别磁性法分离细胞. 两种方法均能较好地分离出所需细胞,且毗后 者为优.虬法快速,准确,不失为一种好方法 2TII的体外扩增 将制成的细胞悬液从25,5.0×10细胞 /m|的浓度加入含20%(V/V)LAK上清的 RPMII640(内含10%^血清,抗生素,Hepes 缓冲碱10raM.L一罄氨酰胺2mM)完垒培养基 中,最后加^rlL一2使其终艘度为1000u/m[, 再将其放^培养扳,37?,5%0.2环境中培养, 定期换液.总细胞数在培养初期往往下降,提 示瘤细胞的死亡.瘤细胞消失后,TIL开始扩 增.瘤细胞消失约在培养开始后第9,28天(平 均16天).TIL在经23,100王后达最大扩增率 (平均61天),之后其数量保持稳定或下降.淋 巴细胞扩增率为8,9.1×10倍(平均2700 倍)… 基于酶消化对细胞成分产生影响,过多离 心会造成细胞扭伤的观点,王文阁等创用了 筒化的T[L村备法:省去酶消化和离心的过程, 将剪碎的瘤组织块直接置于RPMI1640完垒培 养基(内台RPMI1640,10%^AB血清, 500[U/milL2)中培养.结果发现,培养后得 到的TIL数量鞍常规方法提高10倍左右,且其 特性和其他方法者无差异,该法可谓简单,高 效. 鲤证实,冻存与复苏处理后TIL均能保持 良好的增殖能力和抗瘤活性,即砗存与复苏对 TIL活力无明显影响. 3TIL构成特点与表型变化 张家口医学院1996年第13卷第1期 TII是一个由多种琳巴细胞漫稠于蓿组担而 形成的异质性群体.它和PBI有不同的构成特 点功能状况.这方面的资料有助于了解肿瘤 局部史疫状恋殛进一步阐明TII生物学特性. 表1TIL新鲜制备液中的细胞成分 多数研宽结果表明在肿瘤部位Tll,王要由 T细胞构成.另外尚有NK细胞.B拓胞.N细 胞,M中等,但i堡有浆细胞的存在.至于其中吾 细胞的比例各家报道不一.T细胞中CD4与 3.6 表2TII在IL2中培养后的表型 肿瘤病理类型作者n=CD3CD4CD8CD25HLADR 黑色素瘤Topalian2683,953,1968,9325,3668,92 肉瘤TopMmn478?724?1052=1538?1484?4 腺癌Topallan779?531?752?827?482?4 胶质细胞瘤~wamura159040443688 头颈部腺癌Whsteside7701I550?1226?1526?I5321I2 肾细胞癌Belldegrun30905538.54252 表3增强TIL细胞毒性物质及其效能情况 应用试剂袋法 毒性 1996年第l3卷第1期张家口医学院 CD8细胞的比率颇有争议.多数认为TIL中学的发展和研究肿瘤范围的扩大,陆续 发现了 CD4<CD8'而有别于PBI中CD4>CD8,多种肿瘤TII均具此性质.~awarnura等[11对 即机体淋巴细胞对肿瘤的浸润有其免疫选择性.30倒星形胶质瘤TIL研究发现其经体外大量扩 表17列出了TIL中的各种表型构成,推测各家增后,主要由对自体瘤组瓤具杀伤活性的并能 结果不一的原因之一,可能是肿瘤蛆织来源不溶解球状瘤组织的T细胞构成.Peop[~等ll对 同而表达不同MHC抗原凌定蔟蔫【发不同淋巴细来经治疗的卵巢癌病人TAL和TIL研究发现其 胞亚群的识别造成的.中CD8T细胞对自体瘤细胞具明显特异性. 经体外甩IL2培养后.TIL在增殖反应过4.4如何增强TIL的细胞毒作用.人们对此也 程中各种成分的比例也有相应改变,同时TIL作了不少尝试.表3对此作了简要概括,这些 在功能上也台发生质的变化.表2n列出了培养物质以不同方式应用可和IL2协同作用.使 后TIL的表型构成资料.由表可见培养后TILTII活化更完全,毒性可进一步增强. 中CD4'/CD8各家报道仍不一致.尽管其机理5TIL的临康应用r 不明,但其与不同的培养条件,植剥方法和培TII用于肿瘤AIT的研究仍处于试用阶段, 养时间的差异可眈有一定关系.目前治疗和疗效各家报道不一.浩疗方法 4TII的抗瘤活性和细胞毒性上,一般主张TII经体外扩增后以10,10"细 4.1TII的抗瘤活性较LAK高50--100倍.国胞的数量分次回输入病人体内,同时佐强静脉 外SvIess等采用静注同基因MCA105制备路予适当剂量IL一2,但也不尽然.Miki等El3] 荷瘤鼠模型,组担学检查证实接种瘤细胞后3从眼前房肿瘤引流淋巴结藐取TII,体外将其克 天,鼠肺组织内即出现微小转穆瘤灶.约15天喹化,裘取肿瘤特异性CD8细胞,之后将这种 后杀鼠取肺计数瘤结节,以250个瘤结节/肺为细胞直接行瘤局部注射,结果引起进行性生长 .作者在接种瘤细胞3天的小鼠中每攻静的眼内肿瘤完垒消退.S曰i协等[川从1例癌性胸 注同基因TIL,2.5×10,同时腹腔注入rII一2膜炎病人胸腔渗液中提取TII,扩增后将TIL 7500u/8hs,持续5王.治疗15天后,结果肺与II一2联台行胸腔内滴注,滴后渗液明显减 转穆抑制率近100%,而LAK细胞为藐指同疗少,其内恶性细胞清戋而无明显毒副作用. 鼓需输注10细胞共两次,可见TIL的体内杀瘤TIL临康应用结果表明,机体能耐受涪疔荆, 效应是LAK的50,100倍.量的TIL而无剐作用,且环磷酰胺化疗后再行 42通过表型分析显示具抗瘤活性的教应细胞分AIT可明显提高疗效,肿瘤局部或垒者艘疗也. 为两类.Ishii等将46倒^实体瘤TII在rII可和TII协同怍用.Taka~ma荨..的研究表 2中培养后采用4h"cf释艘法和流式细胞仪分明TIL转输入病人体内后均能优先定位于肿瘤 析其抗瘤活性和表型构成,发现CD3淋巴细胞部位.精^TIL后病人PBL中CD8细胞百舟 在所有新制备TII中均占大多数,而rIL2活数增加,CD4保持稳定,使CD4/CD8下降, 化的TII的抗瘤活性却和一十无CD3抗原表达CD16和CD56细胞数量也增加,提示AIT诱 的Iu19细胞群的增长有关.通过直接补体依导细胞免疫的活化和增强病人体内的自抟杀伤 桢性细胞毒作用选择性去隙TIL中某种细胞,活性【I6]. 再进行细胞毒试验,确认CD3CD16Leul9为尽管TII在临康应用方面尚有很多问题悬 主要作用细胞群,CD3CD16NK细胞具较姨而未决,但初步应用结果已显示出了TIL临床 要作用.另有作者通过有限稀释法将TIL克应用的巨大潜在优势:?TIL来薄广迁,可是活 隆化分析发现其对自体瘤具特异性抗瘤披应的栓标丰,切除的肿瘤组虹,;f流淋巴结甚至恶 细胞则主要是CD3CD8.这种差异形成的原性脚腹水,而不象LAK那样需反复抽取病^ 固有待进一步考证.血.固此尤其适用于体盾虚弱的晓期患者.? 43TIL杀瘤作用的特异性以前的观点认为TII坦体耕,扩增后,能良好地迅速增殖,并儇持 睬黑色素瘸TIL具鞍高的抗自体瘸杀伤特异性其生物活性,而使其很喜易达到治疗所需细胞 外,其他TII无此特性.近几年.随宴验方法量.?TII具较强的抗瘤活性如特异性,不损伤 94 张家口医学院1996年第l3卷第1期 正常细胞,其所需I】一2教量远小于LAK.使 瘸人容易耐受,且减小了患者的经济负担.? 冻存与复苏对T]I活力无明显影响,因而能长 期应用,有助于对转穆和复发病人的治疗及重 复治疗之用.综台以上,TIIl临床应用目前已具 有驶充分的可能性和可行性,有着美好的前景 Tl1的研究作为一A全新的科研领域,因其 明显的l临床宴用价值,正;l起更多人的关注, 现己积累了丰富的资料并已试用于临床.取得 了亮破性进展,虽尚有裉多问题亟待船决,但 TII作为一种新型抗瘤效应细胞无疑将为肿擅免 疫学的研究揭开垒新的一页,为肿瘤生物疗法 的发展带来新的希望. 参考文献 1To~UanSTna【Jlmm~otMed1987: 102:127—14l 2享彪如,等.实验生物,1994:27(1):103 — 107 3Nak~muraHnCancer1988;62:2489 4李莉,等上海免疫学杂志.1993;13(2):72— 75 5Dun~amLGJZmm~MM1992;147:57 — 64 6王又闺,等宴用肿瘤学杂志.1993;4:13—14 7李莉国医学免疫学分册,1991;14(1):236 — 241 8SOlePJetJNC11987;79:1067 9IshiiSetNip~nGekaGak~iZasshL 1993:94(3):213—247 10ShimizuYeta【C…R1991:51 (22):6153—62 11~wamuraY毗a__}"【ka】d0Igak 199l;66(6):868—78 12PGEeta__Surry1993114 (2):227—34 13M嘶SetIavesto?t}Iahn?5sm 1993;34(13):3622—34 14SaitoTe1Nip~nny0bkC~kkai za船1992:83(10):1717—20 l5TakavamTet.(:a口cer1991:68(11): 2391—6 16Ik啪sl】LHetC缸孵R郫1994:54 f1):190—6 (上接9l万) 药物,我们也看到了其美好前景,例如可寻找x 一 蛋白作用的抑制物,抑制HBV的传播和致癌 作用.或用x基因的反义mRNA来阻止x蛋自 的合成而达到同样的目的等等诸如此粪均可 为我们利用HBV转基因小鼠进行乙肝药物筛选 提供了许多可行的思路. 参考文献 1KimiAmh:Prce,Nat[,Acad.,USAVo[86: 207—211 2HamldA.Dtm~ord.SIwardse?et: Canc~ResehVol50:10:34[H】一3407 3A】e~darS.KeI丑N栅reVd361;25 burary1993 4PItMAeca【:Vi~]ogy,Vd187:1992 215—222 5MilIerRHet:队NSV03:1986:2531 2535 6GuoWTec:JVir0IVd65;1991:6686— 6692 7RoglerCE:(atleusVoE:1990:366—369 8WangWLet:Hepatology?14;1991 29—37 9unmoto,Tet:PrceNat【AcadscL IIsAVol84;444—448 10Patn~N.GdI.eta【:Joumat.fVirobgy Vd661992:3955—3960 辛笤撰笞担笞霭爨等暑零零牙零牙零辑爨g孪需劫 略曲 略唱 i欢迎订阅'2 嘱罄 瞩骺 畦鲁碰}世}世}长&缸}《碰嚣嚣靠&《粕嚣《粕} 95