酸枣皮中多酚类物质的提取分离及其活性的研究（可编辑）

酸枣皮中多酚类物质的提取分离及其活性的研究（可编辑） 酸枣皮中多酚类物质的提取分离及其活性的研究 学校代码: 分类号:弘『.中 研究生学号: 密级:秘密、机密、绝密 酸枣皮中多酚类物质的提取分离及其活性的研究 ,专业名称: 营养与食品卫生学 张泽生教授 指导教师姓名: 研究生姓名: 叶卉 申请学位级别: 理学硕士 提交同期: 年月 论文课题来源: 自选 学位授予单位: 天津科技大学四八四 天津科技大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明:所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究工作所取 得的 成果。除文中特别加以标注引用的内容外,本论文不包括任何其他个人或集 体已经发 或撰写的成果内容,也不包括为获得天津科技大学或其它教育机构的学位或证书而 使用过的材料。对本文研究做出重要贡献的个人和集体,均已在文中以明确方式标明。 本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。 作者签名: ? ’ 日期:川年;月;口日 知识产权和专利权保护声明 本人郑重声明:所呈交的论文是本人在导师具体指导下并得到相关研究经费支持 下完成的,其数据和研究成果归属于导师和作者本人,知识产权单位属天津科技大学; 所涉及的创造性发明的专利权及使用权完全归天津科技大学所有。本人保证毕业后, 以本论文数据和资料发表论文或使用论文工作成果时署名第一单位仍然为天津科技 大学。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。 作者签名: 叮’亳 日期:’年弓月,了日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定,同意学校保留并 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版,同意公布论文的全部或部分内 容,允许论文被查阅和借阅。本人授权天津科技大学可以将本学位论文的全部或部分 内容编入有关数据库进行检索,可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本 学位论文。 年解密后适用本授权书。 保密 请在方框内打“、/”,在 本学位论文属于 不保密么请在方框内打“、/”。 作者签名:竹薪 同期:知岬年弓月扣同 嗍。”肘卵 刷磁辄确宣摘要 本论文以酸枣皮为实验材料,研究了从酸枣皮中提取、纯化多酚类物质的方法及 多酚提取物体内外抗氧化活性,并对其化学成分进行了初步的研究。 论文对热浸提提取和微波提取两种方法进行了比较,通过单因素实验和正交实 验,确定热浸提提取酸枣皮中多酚类物质的最优工艺条件为:%乙醇,料液比:, 提取温度?,提取时间,按此工艺提取次,酸枣皮中多酚类物质得率为 ./。确定微波提取酸枣皮中多酚类物质的最佳工艺条件为:%乙醇,料液比 :,提取功率,提取时问,按此工艺提取次,酸枣皮中多酚类物质得 率为./。 对上述提取物采用溶剂萃取和大孔吸附树脂进一步纯化,使用不同极性溶剂将提 取物分为乙酸乙酯部分、正丁醇部分和水溶部分,经过萃取后乙酸乙酯相的多酚含量 明显高于其他各相,较粗提物提高了一倍;实验选择大孔吸附树脂,纯化后提 取物多酚含量提高了约十倍。 本论文研究了酸枣皮多酚提取物的体外抗氧化效果以及其对鼠抗氧化系统 的影响。对纯化后的提取物各部分与粗提物进行体外抗氧化研究,结果证明均具有较 强的抗脂质过氧化活性和还原能力,并对?、、具有很强的清除作用, 其中多酚含量较高的乙酸乙酯部分与树脂纯化物的抗氧化活性也较强;酸枣处理组 鼠显示出较好的抗氧化性,且酸枣处理组的基因相对表达量明显高于模型 对照组.。组织形态学观察,表明酸枣提取物能够保护肝组织、脑组织的正常 形态,但间质性肾炎并无明显改善。 论文对酸枣皮多酚类提取物功能性化学成分进行了初步研究,通过多种高效 液相 条件,将提取物分离出一较明显的目标峰。粗品经过大孔吸附树脂纯化后,目标峰峰 面积增加。且在体外抗氧化研究中,经大孔吸附树脂处理过的产品抗氧化性较粗品有 明显的提高。由此可以推断,目标峰所代表的物质是起到抗氧化作用的物质或物质之 一。再将提取物进行液质联用,推断出目标物质的分子量应为或,但是 多酚类物质种类繁多,至于其具体结构,需要进行进一步的分离研究。 关键词:酸枣皮;多酚;提取;纯化;抗氧化 ., ,., %, : ?, :., , ./. : , %,: , . 、./., 、, ; ,, .. .. ,。 .. ,, .., . ,,. . . 、, . .?. ,. :,,,,目 录 前言?.。? .酸枣概述..酸枣的主要成分??..:..:??. ..酸枣的开发利用. ..酸枣的功能 .植物多酚? ..植物多酚的定义 ..植物多酚的结构和化学性质一 ..植物多酚的应用??。 .研究进展概述?.. ..多酚类物质的提取方法??. ..多酚类物质的纯化工艺 ..多酚类物质的测定方法 .本课题研究目的和研究内容?. ..研究目的..课题的主要意义..研究的主要内容??。 材料与方法? .实验材料 ..原料?。 ..主要仪器与设备.实验方法??. ..酸枣皮中多酚含量的测定? ..提取方法的选择?。 ..热浸提提取工艺优化实验..微波提取工艺优化实验.. ..酸枣皮提取物中多酚类物质的定性反应..酸枣皮中多酚类物质的纯化研 究??。 ‘..体外抗氧化活性 ..酸枣皮提取物对鼠抗氧化系统的影响??. ..酸枣皮多酚类提取物功能性化学成分的初步研究? 结果与讨论? ..酸枣皮中多酚类物质的提取方法..’热浸提提取工艺优化实验结果??.. 微波提取工艺优化实验结果??。 ..两种提取方法的比较 ..酸枣皮提取液中多酚类物质的定性检查.. .酸枣皮中多酚类物质的纯化研究..溶剂萃取纯化酸枣皮中多酚类物质??.. ..大孔吸附树脂分离纯化酸枣皮中多酚类物质的研究.体外抗氧化活性研 究? ..提取物还原力的测定 ..铁离子还原法. .. 自由基清除能力的测定??.. .抑制脂质体过氧化能力的测定..清除羟自由基分光光度法? ..清除羟自由基鲁米诺化学发光法..清除超氧阴离子分光光度法? ..清除超氧阴离子鲁米诺化学发光法? ..清除过氧化氢鲁米诺化学发光法??.. ..提取物功能成分与其抗氧化性的关系?一 .酸枣皮提取物对鼠抗氧化系统的影响.. ..生理生化指标的测定. ..肝组织 表达水平的测定..组织形态学观察??. .酸枣皮多酚类提取物功能性化学成分的初步研究..液相色谱条件的优 化??.. ..酸枣皮多酚类提取物液质联用分析 结论? 展望? 参考文献? 攻读硕士学位期间发表论文情况??.. 致谢??..天津科技人学硕.:学位论文 前言 .酸枣概述 酸枣,别名棘、野枣、山枣、山酸枣等,鼠李科枣属,落叶小乔 木。树干和老枝均为褐色;叶小而密,革质,长卵圆形;细长枝刺,托刺发达,长; 果近球形,成熟时深红色,味酸,核两端钝。酸枣在我国分布较广,集中在黄河中下 游流域一带,以山西、河北、河南、山东、陕西等省低山丘陵区最为常见。 酸枣果实具有很高的营养价值【】,我国最早的一部药书《神农本草经》中说:“补 中益肝,坚筋骨,助阴气,皆酸枣仁之功也”。 ..酸枣的主要成分 ...酸枣仁主要成分 酸枣仁所含化学成分有脂肪酸类【,主要包括油酸、亚油酸、棕榈酸、硬脂酸、 花生酸、二十碳烯酸等,其中油酸含量占脂肪酸总含量的%以上:三萜类【包括白 桦脂酸、白桦脂醇、麦珠子酸、酸枣仁皂苷、酸枣仁皂苷、酸枣仁皂苷及胡萝 羟基苯 卜苷等;黄酮类【包括..葡萄糖基异当药素、.、芥菜素..【? 甲酰基..吡喃酮糖基?】和..吡喃葡萄糖苷等;生物碱类,包括, ,,等;酚酸化合物阿魏酸等。除此之外,酸枣仁还含有氨 基酸、微量元素以及磷脂类成分磷脂酰胆碱等。 ...酸枣果肉、叶、根化学成分 研究表明【,酸枣果肉含有丰富的可溶性糖.%,多种有机酸草酸、苹果酸、 柠檬酸、醋酸,无机元素钙、磷、铁、镁、锌等,还含有种氨基酸种人体必需 氨基酸,维生素、、,.胡萝卜素。年国外学者从酸枣叶中分离出芦丁。 另有报道,酸枣叶含有、等种异喹啉类生物碱【。曾路指出,酸枣根、 根皮中含有.、.、、.、.、 等 .、等环肽生物碱, 、 酚酸化合物,白桦脂醇、桦木酸、熊果酸等三萜类化合物。 ..酸枣的开发利用 ...食用 酸枣有较高的营养价值,每干酸枣的可食部分中,含蛋白质高达.,碳水 化合物为.,维生素是苹果的倍,是山楂的.倍,比沙棘高%,有“天然 维生素丸之称。酸枣果实中富含钙、磷、铁等元素,还含有维生素和人体所 需的 种氨基酸等,可制成酸枣酱和饮料等保健食品。酸枣叶富含黄酮、芸香甙、 小檗碱、 苹果酸、酒石酸等,可用于制成保健茶叶【。 ...药用 酸枣是我国种贵重中药材之一。酸枣仁性味甘平,具有安神镇静作用,含脂肪 前言 油%和多种蛋白质及维生素,其提取物可作为一些疑难病症的防治新药。酸枣 叶 中可提取酸叶酮作为治疗冠心病的良药。酸枣根可以治疗失眠、急性痢疾等。 ..酸枣的功能 酸枣,味甘酸性平,入心、脾、肝、胆四经。富含脂液,酸收甘补,功能补肝益 胆,滋养心脾,安神定志,益阴敛汗,为治疗虚烦不眠,惊悸怔忡、烦渴、虚汗之良 药。《本草汇言》云:酸枣“敛气安神,舒筋养髓,和胃运脾’’。又说酸枣“均补五脏。 《本草再新》谓酸枣“平肝理气,润肺养阴,温中利湿,敛气止汗,益志定神,聪耳 明目”。 现代药理研究证明,酸枣具有镇静、催眠作用、镇痛、抗惊厥、降温作用,持续 降压等作用。因此,以酸枣为原料生产的产品临床可用来治疗神经衰弱、神经官能症、 更年期综合症、心悸怔忡、体虚多汗症,特别用来治疗失眠病人,不但效果可靠,而 且没有镇静安眠头昏倦怠等副作用。另外酸枣皮可用于治疗水火烫伤【】,效果较好。 常喝酸枣汁则可以益气健脾,能改善面色不荣、皮肤干枯、形体消瘦、面目浮肿等症 状。此外,酸枣中含有大量维生素,可以促进血液循环和组织生长,使皮肤与 毛发 具有光泽,让面部皱纹舒展。 近年来,英国学者在对虚弱症患者的观察中发现,凡是连续按时吃酸枣的,其康 复速度比单纯服用多种维生素类的快倍以上。因此,酸枣被证明具有防病抗衰老与 养颜益寿的作用【】,这些都与酸枣中富含多酚类物质有关。 .植物多酚 . ..植物多酚的定义 多酚是分子中具有多个羟基酚类植物成分的总称。 植物多酚 ..称植物单宁,是植物体内的复杂酚类次生代谢产 物,是广泛存在于中草药如五倍子、石榴皮、仙鹤草,植物类食品谷豆类如大麦、 高粱、绿豆和果蔬类如洋葱、葡萄、茶叶等中的一种多元酚类物质【。植物中多酚 的含量仅次于纤维素、半纤维素和木质素。 人们最早发现和利用植物多酚将其作为制革鞣剂。到世纪,植物多酚逐渐成 为具有商品性质的化学品,被称为拷胶 ,即植物单宁 ,也叫鞣质,而随着研究的深入,植物多酚在制革、化工、医药、农业、食品、 材料等领域得到了很好的应用?】。植物多酚在自然界的储量非常丰富,在崇 尚绿色科 学的今天,植物多酚作为一种源于绿色植物的可再生生物质材料逐渐成为研究的热 点,并在相关领域应用中发挥着不可替代的作用【。 ..植物多酚的结构和化学性质 ...植物多酚的结构 .在年提出植物多酚的科学分类法。按照单宁的化学结构特性, 和缩合单宁 两大类。 可将其分为水解单宁 天津科技人学硕上学位论文 水解单宁主要是聚桔酸醋类多酚,即桔酸及其衍生物与多元醇以酯键连接而成,可以 分为桔酸单宁和鞣花单宁两类:缩合单宁则主要由聚黄烷醇类多酚或原花色素,即羟 基黄烷醇类单体的组合物,单体间以.键相连【.】。 水解单宁和缩合单宁在结构组成上完全不同,因此它们在化学性质和应用范围上 的差异显著。如水解单宁在酸、碱、酶的作用下不稳定一易于水解;而缩合单宁则相 对稳定,但在强酸作用下会缩合成不溶于水的物质。当然,水解单宁和缩合单宁在分 子结构上仍具有一些共性,如二者的酚羟基数目最多,并以邻位酚羟基最为 典型;分 子量都较大,且分布较宽广。正是这种化学结构,赋予了多酚独特的化学性质【。 ...植物多酚的化学性质 植物多酚可通过疏水键和多元氢键与蛋白质发生结合反应是其最重要的化学特 征。植物多酚与其他生物大分子,如生物碱、多糖等的分子复合反应也与此相似。植 物多酚中多个邻位酚羟基可与金属离子发生络合反应,该反应是其多种应用的化学基 础。 抗氧化性也是植物多酚的一个重要性质。由于植物多酚的酚羟基中的邻位酚羟基 极易被氧化,且对活性氧等自由基有较强的捕捉能力,使植物多酚具有很强的抗氧化 性和清除自由基的能力。 另外,植物多酚在一之间还有着较强的吸收紫外光能力。随着植物 多酚结构和化学性质研究工作的不断深入,人们对植物多酚的认识了解逐步加深,同 时也为植物多酚在多领域中的应用奠定了理论基础。 ..植物多酚的应用 在以前的研究中,人们曾经主要关注植物多酚的抗营养性。等报道植 物多酚中的儿茶酚、花青素、异黄酮和缩合单宁都能与蛋白质结合或与消化道内的酶 结合降低蛋白质的消化性,影响其营养成分的吸收【】。因此,植物多酚化学家、食品 营养方面的专家关心的是如何除去多酚,并对相应的方法进行了大量的研究。例如证 实了饲料、牧草中多酚的含量与家禽、牲畜的生长状况呈负相关,即植物多酚具有抗 营养性。 然而,随着植物多酚化学和药理学的发展,人们逐渐认识到多酚其实是一类具有 独特生理活性和药理活性的天然产物。随着当前“追求自然”消费观念的兴起,多酚 在制药、生化、日化、食品以及精细化工等高科技领域具有广阔的应用前景。人们在 植物多酚的精细化工和高附加值利用如生理活性、医药、食品及营养方面的研究 更为活跃‘。目前,植物多酚主要被应用于以下几个方面: ...植物多酚的药理应用 抗氧化 人们同常呼吸的氧气是最稳定的三线态氧,当受到紫外光等能量和代谢激发 时,处于高能态,形成单线态,具有非常强的氧化性质,例如对比通常的币 氧化亚油酸的速度,后者要比前者大倍。活性氧分子再经得失电子形成活前言 性氧自由基如?。、?、.、?等与一起统称为活性氧 。这个过程可以在黄嘌呤氧化酶催化下进行,也可在非酶促情况 下”催化形成。活性氧自由基反应性强,能够攻击其它分子形成新的自由基,造 成连锁反应 。 当前的研究表明,氧自由基引起的连锁反应不仅是体 外脂类过氧化反应机理,而且经体内代谢后会引起脂质、、蛋白质、细胞膜等体 内大分子损伤,是多种疾病,例如老化、癌症、心血管疾病、发炎、肾炎等的引发原 因瞄,。 现代医学研究证明,植物多酚有着出色的抗氧化能力,能够有效地清除人体内的 过剩自由基。因此,利用植物多酚的这一性质,就能减缓人体组织器官的衰老。并且 可以对自由基诱发的生物大分子损伤起保护作用【训。 抗心脑血管疾病 据报道【,血液流变性降低,血脂浓度增高,血小板功能异常是诱发心脑血管疾 病的重要原因。植物多酚物质能够抑制血小板的聚集粘连,诱导血管舒张, 并抑制脂 新陈代谢中的酶作用,有助于防止冠心病、动脉粥样硬化和中风等常见心脑血管疾病 的发生【。 抗癌 多酚类物质在哺乳动物细胞中有广泛的生物效应。大量的流行病学研究以及动物 实验都证明多酚类物质可以阻止和抑制癌症的发病。多酚的抗癌作用是多个方面的, 可以对癌变的不同阶段进行相应抑制。多酚是一种十分有效的抗诱变剂,能够减少诱 变剂的致癌作用,并提高染色体精确修复能力,从而达到提高细胞免疫力和抑制肿瘤 细胞生长的目的。 亚硝酸盐类化合物具有致癌性,而植物多酚中的茶多酚对亚硝酸盐化合物有抑制 作用,从而具有抗癌的功效。长期饮用绿茶,能够减少癌症和肿瘾的发病率。有统计 资料显示,在日本国内,凡绿茶消费较多的地区,胃癌发病率较低。而寓含多酚物质 的水果果肉,其抗癌效果也已得到验证,虽然果肉本身抗癌细胞的增殖能力较差,但 在其多酚类提取物的长期作用下,也能够达到抑制癌细胞增殖的目的引。 抑菌消炎和抗病毒 植物多酚对多种细菌、真菌、酵母菌都有明显的抑制作用,尤其对霍乱菌、金黄 色葡萄球菌和大肠杆菌等常见致病细菌有很强的抑制能力,并且不影响生物体本身的 生长发育【冽。比如,茶多酚就可以用作胃炎和溃疡药物的成分,抑制幽门螺旋杆菌的 生长和抑制链球菌在牙齿表面的吸附。 近年来大量的研究表明,治疗流感、胞疹都与植物多酚抗病毒作用有关。目前, 尚无治疗爱滋病的有效方法,而植物多酚可用于抗爱滋病的研究,低分子量的水解单 宁被发现可用作口服剂来抑制爱滋病,延长潜伏期。例如茶多酚在用于抗病毒方面的 研究发现红茶和绿茶提取物能够抑制甲、乙型流感病毒;儿茶素能够抑制人体呼吸系 统合孢体病毒【。茶多酚对于肠胃炎病毒和甲肝病毒等也有较强的对抗抑制作用。天津科技大学硕:学位论文 ...食品中的应用 植物多酚有一定的苦涩味,这是其收敛性刺激口腔触觉神经末梢的结果。因此, 其在食品中应用受到一定限制,但在饮料工业中应用较多。多酚与唾液蛋白结合成为 食品涩味的原因,也是由于氧化偶合及分子降解生成天然色素而改变食品的色泽的原 因。因此,多酚从味觉和视觉两方面影响着食品的风味和色泽,特别对于多种饮料如 茶、咖啡、葡萄酒、啤酒,涩味对产品独特口感的形成起到不可替代的作用。多酚的 氧化反应使某些食品如红茶和红葡萄酒色泽漂亮;另外,对一些天然的花色素还有辅 色作用。植物多酚是一类抗氧化和清除自由基的活性物质,从植物中分离提取物可作 为天然食品添加剂中的抗氧化剂和防腐剂【?。 ...日用化学品中应用 植物多酚在一之间还有着较强的紫外吸收能力。尤其是对能量高、 破坏力大的紫外区有更强的吸收作用,因此植物多酚可以作为抗老化剂和防晒剂的有 效成分。多酚类物质能够阻止皮肤黑色素的生成,可起到防晒作用【。 由于多酚具有清除自由基及抗皱作用,又由于植物多酚可与多糖透明质酸、 多元醇如乙二醇、脂质如磷脂和多肽如丝肽等形成分子复合物,因此可 制成效果良好的保湿剂、染发剂、调理剂、祛斑利。 ...其他方面应用 植物多酚因含有大量酚羟基,具有亲水性和吸附能力,可作为石油钻探中泥浆处 理剂。在陶瓷、水泥和耐火材料生产中,以缩合单宁为原料,可配制成胶黏剂,又可 作为天然、低毒、可生物降解的天然材料用于金属防腐涂料的配制,以防止金属生锈 和腐蚀,另外,又是一种天然色素和染料,可用于食品着色剂,还可用于聚酰胺类纤 维的固化。低分子多酚可用于匀染剂和作为合成染料的中间体。尼龙针织染色时,单 宁酸是最常用的固化剂。植物多酚又是一类点化学活性物质,用多酚配制成多酚?金 属盐络合物可有效地吸附、硫醇和氨气,达到去除异味、净化室内空气的目的】。 .多酚类物质研究进展概述 下如前文所述,多酚类物质具有及其广阔的应用前景,然而对于我国分布广泛的 野生酸枣,目『为止,除了利用其枣仁作为中药材外,酸枣皮肉没有得到很好的利用 【】,如何将此野生资源充分有效地利用长期以来一直为各界所寻求。袁月莲,林秋华 等人对酸枣皮素的提取及其理化性质进行了研究,证明其具有很好的抗氧化 活性, 可以作为天然抗氧化剂对其进行利用。同时,在探讨果皮颜色差异形成的研究中,诸 多学者【认为果皮颜色与所含多酚密切相关,颜色较深的果皮含多酚物质的含量, 所以对酸枣皮中多酚类物质的研究具有相当重要的意义。 ..多酚类物质的提取方法 ...溶剂提取法 将溶剂加入固相或另一液相混合物中,使其中所含的一种或几种组分溶出,从而 使混合物得到完全或部分分离的过程,统称溶剂萃取。溶质在溶剂中的溶解符合“相前言 似相溶’’规律,待提取成分与溶剂的分子极性越相似,其溶解度越大。 具体操作是:根据所要提取的成分的性质,选择合适的溶剂,加到适当粉碎过的 原料中,溶剂由于扩散、渗透作用会逐渐通过细胞壁透入到细胞内,溶解可溶性物质, 而造成细胞内外的浓度差,于是细胞内的浓溶液不断向外扩散,细胞外的溶剂则不断 进入原料组织细胞中,如此往返多次,直至细胞内外溶液浓度达到动态平衡时,将此 饱和溶液滤出,浓缩;继续往过滤后的原料渣中加入新溶剂,重复以上过程, 反复多 次就可以把所需要的成分近于完全溶出或基本溶出,合并所有的浓缩液,即为含有所 需有效成分的混合液。 常用的溶剂提取法有:浸渍法、渗漉法、煎煮法、浸提提取法及连续回流提取法 索氏提取法等。 ...微波辅助提取法 微波辅助提取法 自于年首次 提出后在中药提取领域表现出良好的应用前景。微波技术在化学、食品、生物、医药 提取工业:内应用研究虽然起步仅几年时间,但已有的研究和应用成果己足以显示以下 优越性:质量高,可有效地保护食品、药品以及其他化工物料中的功能成分;产率高; 对提取物具有高选择性;反应或提取快,省时,可节省%%的时间;溶剂用量 少可较常规方法少%%;耗能低;安全,无污染,属绿色工程;生产线组成 简单,节省投资,后处理方便。近年来微波辅助提取技术已广泛应用于提取有机样品 中有机污染物、天然化合物、生物活性成分、痕量金属等方面到。 微波辅助提取法本质上是微波加热原理的应用,而介质在微波场中的加热同时存 在两种机理,即离子传导和偶极子转动。微波提取的机理主要为两个方面,一方面微 波所产生的电磁场加速被提取物质向提取溶剂界面扩散。用水作溶剂时,在微波场中, 水分子高速转动成为激发态,这是一种高能量不稳定状态,或者水分子汽化,加强提 取组分的驱动力:或者水分子本身释放能量回到基态,所释放的能量传递给其他物质 分子,加速其热运动,缩短提取组分的分子由物料内部扩散到提取溶剂界面的时间, 从而使提取速率提高数倍,同时还降低了提取温度,最大限度保证提取质量。另一方 面,微波辐射过程是高频电磁波穿透提取介质,到达物料内部纤维管束和腺胞系统。 在离子迁移和偶极子转动的作用下产生键的振动、撕裂和粒子间的相互摩擦、碰撞, 促使分子活性部分极性部分更好的接触和反应,同时迅速生成大量热能,细胞内 部温度迅速上升,使其细胞内部压力超过细胞壁膨胀承受能力,促使细胞破裂,细胞 内有效成分自由流出,在较低温度条件下被提取介质捕获并溶解。通过上一步分离, 即可获得目标物质。在不同提取系统中两种机理作用同时存在引。 ..多酚类物质的纯化工艺 经粗提得到的植物提取物活性物质含量不高,需进一步除去杂质,进行分离、纯 化、精制,才能得到含量较高的有效部位或有效成分。分离精制的经典方法包括:溶 剂分离法、两相溶剂萃取法、沉淀法、盐析法、透析法、结晶法、色谱法和大孔吸附 丕鎏型垫厶堂塑主堂丝迨塞 ? 树脂法等。 ...有机溶剂萃取法 有机溶剂萃取法主要用于分离可溶性酚类化合物。由于多酚物质在分子结构中具 有酚羟基、羟基、羧基等,具有一定的极性,在植物体内通常与蛋白质、多糖以氢键 和疏水键形式形成稳定的化合物,而有机溶剂具有断裂氢键的作用,因此可以用乙酸 乙酯、丙酮、乙醇等有机溶剂萃取。一般来说,以酸酯多酚为主体的酚类可采用丙酮 一水体系萃取,因醇类溶剂易造成醇解反应使多酚分子降解;而以缩合单宁为主体的 酚类可采用弱酸性醇一水体系萃取,使以共价键与植物组织分子相联的单宁降解溶 出;从乙醚萃取物中可得到低分子量酚类物质,用乙酸乙酯或丙酮一水溶液萃取可得 到中等分子量单宁化合物,而在热碱浸提物中可得到大分子量多酚。 影响溶剂萃取法效率的因素很多,包括溶剂种类、体积、温度、提取次数和样品 颗粒大小等。有研究分别采用甲醇、乙醇、丙酮或水对香蕉皮多酚进行提取,发现样 品中多酚提取率的高低与溶剂的极性有关,以水作溶剂时多酚的提取率最高,其次为 甲醇和丙酮,乙醇的多酚提取率最低,而种有机溶剂分别与水混合作为溶剂时,香 蕉皮多酚的提取率高于水及其相应的纯溶剂。 ...大孑吸附树脂分离纯化技术 大孔吸附树脂是世纪年代发展起来的一类不含离子基团、具有网状结构的高 分子聚合物吸附剂,具有吸附性强,解吸附容易,机械强度好,可反复使用和流体阻 力小等优点。国外最早用于废水处理、医药工业、分析化学、临床鉴定等领域,我国 主要用于医药工业的药物及天然活性物质的提纯和中草药有效成分的分离纯化。 大孔树脂的结构、特性与分离原理 大孔吸附树脂是一类新型的非离子型高分子化合物,一般为白色颗粒状,粒度多 为目,理化性质稳定,不溶于酸、碱及有机溶剂中。对有机物选择性好,不受无 机盐等离子和低分子化合物的影响。大孔吸附树脂是吸附性和分子筛性原理相结合的 分离材料,它的吸附性是由于范德华力或产生氢键的结果,分子筛性是由于其本身多 孔性结构的性质所决定。 大孔吸附树脂可以有效地吸附具有不同化学性质的各种类型化合物。以范德华力 从很低浓度的溶液中吸附有机物,其吸附性能主要取决于吸附剂的表面性质,如表面的 亲水性或疏水性决定了它对不同有机化合物的吸附特性。 根据树脂的表面性质,可将其分为非极性、中极性和极性三类。非极性吸附树脂 适宜于从极性溶剂如水中吸附非极性物质,极性吸附树脂适宜于从非极性溶剂中吸 附极性物质,而中极性吸附树脂则对上述两种情况都具吸附力。大孔吸附树脂根据树 脂孔径、比表面积、树脂结构、极性差异等分为许多类型,在实际应用中, 要根据分 离要求加以选择。在了解大孔树脂结构及分离原理的基础上,必须根据化合物的结构 特征来确定分离条件,才能取得预期的效果。 大孔树脂在中药研究应用的优越性前言 中药的提取分离是中药研究及生产过程中的重要环节,也是目前提高中药质量的 关键问题。老的中药提取工艺及设备已越来越不能满足中药现代化发展进程的需要, 但我国大多还在沿用传统、滞后的工艺方法,致使中药产品粗杂质多、大服用量大、 黑颜色深,制约了中药产业化和市场国际化。与传统分离提纯工艺相比采用大孔树 脂吸附法对中药提取液进行精制具有如下优势:?能有效缩小服用剂量,提高中药制 剂的质量;?减少产品的吸湿性;?实验工艺简便,所需实验设备简单,降低了成本。 ...大孔吸附树脂的应用前景 大孔吸附树脂作为有效的分离手段,在中药有效成分的提取、分离、富集上得到 运用,并取得了良好的效果。世纪年代初,中国医科院药物所植化室采用大孔吸 附树脂对糖、生物碱和黄酮成份等进行吸附,并在此基础上用于天麻、赤芍、灵芝和 照山白等中草药提取分离,结果表明大孔吸附树脂是分离中草药水溶性成份的一种有 效方法。近年来在皂苷类成份的分离纯化上已取得了成功,并在生物碱、黄酮类化合 物和其它苷类成份上也有了较广的应用研究【”。 在中药的研究中,根据化合物更细致的结构类型开发研制高选择性的树脂,提高 中药有效成分分离效率、快捷、省时、低成本是一种趋势,且大孔树脂吸附分离所得 的提取物体积小、不吸潮,更易于制成外型美观的各种剂型,尤其适用于颗粒剂、胶 囊剂和片剂。 目『,大孔树脂吸附技术已广泛的应用于西药的研究及生产中,在中药研究和生 产中应用的探索也越来越多,具有十分广阔的推广前景。但对于大孔树脂的使用尚有 一些争议,如在制孔剂和降解物的毒性方面,大孔树脂大多应用于以水为介质的体系 中,但天然产物中有许多成分是难溶于水的,这使得树脂吸附法在中药活性成分研究 的使用受到了限制,因此,仍需要进一步深入的研究】。 ..多酚类物质的测定方法 目前,国内食品中多酚类化合物的测定方法主要有高锰酸钾滴定法、光谱分析测 定法、色谱分析测定法等。国外在食品中多酚类化合的测定方法的研究起步比我国早, 常用的测定方法有.连氮..乙苯.二噻唑.硫酸测定法【.、,. 联苯..三硝基苯肼测定法、弗雷米自由基还原法、心法还原法【】、化学发 光反应法等,近几年发展的新方法有高效液相色谱、气相色谱、 比色法、循环伏安法【】等。其中色谱法还产生了许多与其他仪器质谱、紫 外联用的新技术,如:.气质联用、.液质联用、.?气相色 谱.质谱.选择离子监测、.紫外探测反相高效液相色谱法、.高 效液相色谱.二极管阵列检测器联用仪等法。 ...高锰酸钾滴定法 此法是传统的测定方法,具有一定的代表性。它是利用多酚类化合物中酚羟基的 还原性,以.%靛红溶液为指示剂,使用高锰酸钾滴定法测定食品中的多酚类物质含 量。高锰酸钾是强氧化剂,被测溶液中的还原性物质一般均能被氧化,所以用这种方天津科技人学硕士学位论文 法测定的选择性不高。虽然误差偏大一些,但因方法简便易行,所以被广泛使用【。 在食品多酚类化合物高锰酸钾测定法中,所涉及的试剂主要是氧化剂高锰酸钾、 指示剂靛红和介质水。通过对高锰酸钾用量的研究发现,高锰酸钾标定后存贮于棕色 瓶中比较稳定,以后使用时不需要再次标定;靛红溶液也较稳定,在空白滴定中,高 锰酸钾消耗量一般在范围内使用均有效,不会造成试剂方面的太大误差, 若低于,则应谨慎使用【】。也有些学者对此法进行了不同研究改进,如为了避 免因靛红不纯而造成的终点不敏锐的现象,采用对靛红进行磺化,方法如下:称取靛 ,在?干燥箱中加热,冷却后加水稀释至,过滤后置 红加入 于棕色瓶中贮存。 ...光谱分析测定法 可见光分光光度测定法 该方法主要利用食品中多酚类化合物与其他试剂发生显色反应来测定食品中的 多酚类化合物含量,此法操作简便,应用广,仪器成本和材料消耗较低,是目前国内 对食品或其他植物中多酚类化合物进行总含量测定最常用的方法。 酒石酸亚铁分光光度法 年等人建立植物多酚的酒石酸亚铁分光光度测定法,主要原理 是在一定条件下,食品或植物组织中的多酚类化合物能与酒石酸亚铁形成蓝紫色络合 物,络合物的吸光度值在一定的浓度范围内与多酚类化合物的浓度成正比。此后有 研究者对此法进行了测定条件和多酚类化合物浓度不同而发生的本底漂移和吸收峰 不对称等因素进行了改进,建立了同类物质多酚类化合物酒石酸亚铁分光光度测定 法,历经完善,延用至今。而且酒石酸亚铁分光光度法是多酚类化合物测定中引用最 多的快速分析方法,也是我国国标采用的方法。 由于测定方法本身的局限性,通常存在以下几个问题:结晶含水量变化 大;缓冲溶液和酒石酸亚铁溶液不稳定;配制的缓冲溶液往往偏离理论值等。 有研究报道认为多酚类化合物的组成不同引起吸收系数不同,使测定结果产生误差 【,建议采用与待测样组成相近的多酚类化合物作为纯品绘制标准曲线,甚至从待测 样品中提取茶多酚纯品绘制标准曲线以减小误差。因为在制备多酚类化合物纯品时, 应有一个公认的流程和方法,原料不同,基准不同,测定值的可比性也就难以确定。 酒石酸亚铁比色法测定结果仅是相对于标准曲线的折算含量,其可靠性取决于方法本 身的准确度与精密度,也依赖于标准曲线对该检测样的适宜度。也有报道认为试剂、 标准物质的选择、显色时间和温度是引起误差的主要因素酬。 基于其他显色反应的可见光分光光度法 比色法 试剂一种强氧化剂,其还原型为蓝色,通常用于蛋白质含量的测 定和某些酶活性的测定,是生物学实验中的重要试剂【】。曹炜等人利用 比色法测定蜂蜜中总酚酸的含量,由于方法干扰因素多,偏差较大,只适用前言 于测定多酚类化合物相对含量较高的对象,微量分析的准确度将难以保证【。方法测 出的是多酚类化合物相对总量,受多酚类物质的结构影响较大。 重氮化.偶合法 利用芳香族伯胺与亚硝酸在低温下反应生成重氮盐,再与食品中多酚类化合物在 碱性溶液中反应生成偶氮化合物。偶氮化合物呈稳定的褐色,从而可用可见分光光度 测定法测定其含量,食品中多酚类化合物含量测定的一种新方法【鲫。 法 利用在酸性介质中,多酚类化合物将还原为,与】生成峰 值吸收波长为的深蓝色配位化合物,此方法较适用于食品中微量 多酚类化合物的测定,与靛红一高锰酸钾滴定法相比较,测定结果基本一致。它的缺 陷是凡能把还原为的物质和因素都将对测定结果产生影响【?。 香荚兰素显色法 食品多酚类化合物中的儿茶素和香荚兰素在强酸性条件下进行经醛缩合反应生 成橘红到紫红的产物,红色的深浅和食品中儿茶素的含量有一定关系。此反应不受花 青苷和黄酮苷的干扰,在某种程度上可以说是儿茶素的特异性显色剂,而且显色灵敏度高,检测限可达. 【。由于醛缩合为有机反应,所以反应速度比较慢需 左右,且不够稳定,存在发生结构变化的可能,同时在实验时要注意显色剂必须过量, 故方法的应用推广受到了一定的限制。 其他显色方法 除了以上几种呈色反应外,还有利用多酚类化合物在碱性条件下能与铁氨离子生 成深红色络合物;多酚化合物在酸性条件下与钼酸铵的显色反应;多酚类化合物与磷 钼酸的显色反应; 试剂法等,测定食品中的多酚类化合物含量唧。这些方 法各有利弊,在此不再赘述。 紫外分光光度法 多酚类化合物的峰值吸收波长特征为:紫外吸收光谱处于段的是天 然酚类儿茶素单体的特征吸收:处于段的为多酚类化合物的或带, 处于~ 和~ 段的为多酚类化合物的带,在 段 处有较弱吸收峰。 原子吸收光谱法 将原子吸收光谱法应用于茶多酚的含量测定,国内外均有过报道,它属于一种问 接测定方法。利用与多酚类化合物反应生成难溶性的.多酚类化合物,经 分离后,用原子吸收光谱法测定溶液中过量的或将沉淀溶解后测定其中的含量, 由此问接测定食品中多酚类化合物的含量。由于生成的.多酚类化合物在水中的 溶解度较大浓度可达 /以上,且食品中的氨基酸有干扰作用,因此误差较大。 原子吸收光谱法选择性比高锰酸钾氧化法要高,但增加了沉淀离心分离步骤,操作比 较繁琐。。与 试剂法相比,本方法更适合于测定食品中的高分子量的 天津科技大学硕士学位论文 多酚类化合物,且干扰要比后者要小。 化学发光法 化学发光法是基于对物质在进行化学反应时吸收反应过程中产生的化学能而使 分子激发发出的光进行测定。鲁米诺是一种常用的化学发光试剂,它产生化 学发光反应的量子效率为...。其发光反应机理如下【】:鲁米诺在碱性溶液中形 成叠氮醌,叠氮醌与氧化剂如作用生成稳定的桥式六元环过氧化物中间体,然 后转化为激发态的氨基邻苯二甲酸根离子。当其价电子从第一电子激发态的最低振动 能级跃迁回基态中各个不同的振动能级时,产生最大发射波长为 的光辐射【, 化学发光法以其高灵敏度,宽线性范围,仪器简单等特性,越来越多的受到人们的重 视,余宇燕,廖晓玲等人基于茶多酚对鲁米诺.化学发光体系抑制作用结合流 动注射技术分别建立了流动注射化学发光法测定茶饮料中的茶多酚的新方法,在国外 ‘】等人研究了茶叶中多酚与化学发光量子产率的关系并用化学发光法 对茶多酚进行了测定。 从..高锰酸钾滴定法以及各种光谱方法的原理及应用看出,它们均为食品中 多酚类化合物总量的测定,测定值也仅是多酚类混合物含量的近似值,这些方法目前 之所以被普遍采用,是因为它们的测定速度较快又有一定准确度。随着多酚 类化合物 在食品、医药等其它行业的进一步应用,总量测定也是分析其性能的重要基本手段之 一 ...色谱分析法 色谱分析测定法是建立在最初期的纸色谱和薄层色谱法基础上,随着工业的发展 出现了现在广泛使用的气相色谱法和液相色谱法。这种方法测定精确度高,还可以 分离样品和分别测定出多酚类化合物的组成成分含量等。 气相色谱法 气相色谱法是英国生物化学家等人在液液分配色谱的基础上,于年 创立的一种极为有效的分离方法,可以分离、分析复杂的多组分混合物?。高效能的 色谱柱、高灵敏度的检测器以及计算机处理技术,使其在食品工业、生物技术、农副 产品等领域都得到了广泛的应用。 高效液相色谱法 高效液相色谱法,简称又称高压或 高速液相色谱法,于年后期开始应用。它是目前实验室应用最广泛、最有效的 分离分析技术之一,具有分辨率高、分析速度快、重复性好、定量分析精确 度高等优 点,并可用作实验室小量色谱纯样品的制备,所以发展特别迅速。是色谱法 中的一个重要分支,据估计,自然界%以上的化合物均可用这种方法分析。在短短 的几年时间内,它被广泛应用于食品中多酚类化合物等非挥发性成分的分离鉴定。目 × , 前,较为常用的高效液相色谱柱是. ,由于固定相相对 较为昂贵,为了优化分析条件,通常采用改变流动相的组成与配比,以提高分离程度前言 和分析速度,因此流动相的选择很重要,常用的流动相有甲醇、乙醇、乙腈、四氢呋 哺或其他多种比例组合。洗脱系统有等度洗脱和梯度洗脱种,采用紫检测器 检测,流速在... /之间,多种分析方法都能实现对儿茶素组分的定量测定。 易湘茜【等人利用高效液相色谱法分析了多酚类物质在菠萝果皮、果肉、果心中 的含量及分布情况。色谱条件:色谱柱为 柱 .,., 流动相为乙睛和.%醋酸溶液,柱温为?,流速为./,线性梯度洗脱, 检测波长为 。在该色谱条件下,各组分均得到良好分离。经测定,菠萝果皮中 含有种酚类物质,为没食子酸、儿茶素、表儿茶素、阿魏酸,含量较高;果肉及果 心中酚类物质为表儿茶素和阿魏酸,含量较低。 孙承锋等人建立了苹果多酚的反相检测方法。该方法的检测限为 ...,加标样品回收率均大%,相对标准偏差为.%..%,说明该方法 准确可靠。用该方法测定了红富士苹果的多酚含量,结果表明,样品中的多酚物质主 要包括绿原酸,.香豆酸、.儿茶素、..表儿茶素、芦、原花青素、根皮苷等。 总之,食品中多酚类化合物的各种测定方法各有利弊,在选择时一定要选择适合 自己的实验,同时还要考虑实验室的条件和实验经费等因素。在科学飞速进步的 今天,很多实验测定都会因科学的发展而提出更高的要求和变化。食品中多酚的测定 也一样,它也在随着其他学科的发展而发展,所以测定方法的改进也要同其他学科协 调发展。 .本课题研究目的和研究内容 ..研究目的 目前酸枣皮中多酚类物质的药理作用和保健功能尚不完全清楚,研究的深度和广 度也有望加大。现在对枣类中多酚物质的研究不多,但已有对金丝小枣、赞 皇大枣和 阜平大枣中多酚物质的研究,证明了其具有一定的生物活性,具有十分广阔的开发前 景,但对酸枣中多酚物质的研究仍是空白。我国酸枣资源十分丰富,但对其利用只是 集中在酸枣仁中药用物质的开发上,对酸枣皮肉的利用十分有限。 医药上,多酚类物质具有抗衰老,抗突变,抗癌,抑制高血压、高血脂及心脑血 管疾病的作用,有抑制脂质过氧化、清除自由基和抑制微生物生长作用,还可对酶类 活性产生影响;能抑制各种炎症、龋齿和脱发。本课题主要目的是对酸枣皮中多酚类 物质的提取精制工艺及其活性进行研究,并对酸枣皮中多酚类物质结构进行了初步的 研究。 ..课题的主要意义 长期以来,人们为了保鲜和防止氧化,一直使用合成抗氧化剂如、、 和等。近年来,人们对于这些人工合成抗氧化剂的安全性问题进行了广泛 的研究。世界卫生组织胱、欧共体儿童保护组织、英国生物工业 协会、同本、美国的政府和组织的研究表明,合成抗氧化剂具有诸多副作用, 天津科技大学硕::学位论文 如对人体的肝、脾、肺均有不利影响,会诱发恶性肿瘤等。所以美国食品药品管理局 建议在一般认为安全的物质中删去;日本有关卫生部门经研究曾做出禁止 使用的结论;对于,虽然美国等少数国家批准了它在某些油脂中的使用, 但欧盟、日本等国家认为它的毒理实验资料不完善,尚未批准使用。总之,人们对人 工合成抗氧化剂存在不安心理。 事实也证明,在人们长期食用的食品中,天然抗氧化剂成分的毒性远远低于人工 合成的抗氧化剂毒性。因此,近年来从自然界寻求天然抗氧化剂的研究已引起各国科 学家的高度重视。而植物类多酚物质正是天然抗氧化剂的典型代表之一。 目前,世界各国开发了大量多酚类天然抗氧化剂产品,受到人们的普遍欢迎。其 天然抗氧化成分的来源包括:某些草本植物、香辛料、茶叶、油料种子、果蔬、酶及 蛋白质水解物等。 因此,对天然抗氧化剂的研究开发具有十分重大的意义和市场前景。而我国酸枣 资源丰富,对其深入开发利用却尚不完全,利用其开发抗氧化剂具有广阔的前景。 ..研究的主要内容 对酸枣皮中多酚类物质的提取主要分为热浸提和微波辅助提取两个部分,分别进 行单因素及正交实验,确定最优提取工艺。热浸提提取从溶剂浓度、提取时间、提取 温度和料液比进行单因素实验,选取适当条件正交实验。微波辅助提取从溶剂浓度、 提取功率、提取时间和料液比进行单因素实验,选取适当条件下交实验。从正交实验 中确定的最优提取条件进行验证实验,确定最优提取工艺。 将最优工艺提取出的多酚类提取物采用两种方法进行纯化:溶剂萃取法和大孔吸 附树脂纯化。将得到的几个萃取相及粗提物和纯化物进行的测定。 研究酸枣皮多酚提取物的体外抗氧化效果以及其对快速老化模型小白鼠 鼠抗氧化系统的影响。对纯化后的提取物各部分与粗提物进行体外抗氧化研究还原 力的测定、测定、自由基清除能力测定、质脂过氧化的测定、羟自由基 清除能力测定、超氧阴离子清除能力测定、清除能力测定;对鼠肝组织 、.、、、活性水平及基因相对表达量进行研究,并 利用组织形态学观察。 并且对酸枣皮中多酚类物质活性成分的组成进行初步分析。材料与方法 材料与方法 .实验材料 ..原料 酸枣皮粉由新鲜酸枣皮晒干后粉碎、过.目筛而成。 ..主要仪器与设备 康达多功能食品粉碎机 天津市达康电器公司 .旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂 ?循环水式多用真空泵 郑州长城科工贸有限公司 一微波炉电子天津电器有限公司 布氏抽滤装置 本实验室装配 全自动光电分析天平 上海天平仪器厂 .紫外/可见分光光度计 同本岛津公司 超低温冰箱 美国 电热鼓风干燥箱 天津天宇机电有限公司 昆山市超声仪器有限公司 型数控超声波清洗器 型圆周振荡器 美国 型 美国奥立龙 台面式/澳试仪 .冷冻干燥机 四环科学仪器厂 荧光化学发光分析仪 酶标仪 美国公司 高剪切分散乳化匀浆机 德国工业设备扩增仪 英玉公司 电泳仪 大连竞迈公司 .凝胶图象采集分析系统 德国公司 公司 荧光实时定量仪 ..主要试剂 品名 纯度 生产厂家 乙醇 分析纯 天津市凯通化学试剂有限公司 盐酸 分析纯 天津市凯通化学试剂有限公司 没食子酸 分析纯 天津市科密欧化学试剂开发中心 福林一酚试液 分析纯 公司 碳酸钠 分析纯 天津市北方天医试剂厂 氢氧化钠 分析纯 天津市凯通化学试剂有限公司 乙腈 色谱纯 天津市瑞金特化学品有限公司 天津科技人学硕士学位论文 冰醋酸 化学纯 天津化学试剂一厂 抗坏血酸 分析纯 天津市瑞金特化学品有限公司 丙酮 分析纯 天津市北方天医化学试剂厂 甲醇 色谱纯 天津市化学试剂一厂 硫酸亚铁 分析纯 天津市耀华化工厂 三氯化铁 分析纯 天津市天大化工实验厂 磷酸氢二钠 分析纯 天津市北方化玻购销中心 磷酸二氢钠 分析纯 天津市北方化玻购销中心 碳酸氢钠 分析纯 天津市化学试剂六厂 水杨酸 分析纯 公私合营育发化学制造厂分装 铁氰化钾 分析纯 北京化工厂 三氯乙酸 分析纯 天津市科密欧化学试剂开发中心 醋酸钠 分析纯 天津市赢达稀贵化学试剂厂 % 分析纯 天津市凯通化学试剂有限公司 碘化钾 分析纯 天津市北方天医化学试剂厂 三氯甲烷 分析纯 天津市北方天医化学试剂厂 没食子酸 分析纯 天津市科密欧化学试剂开发中心 分析纯 公司 . 分析纯 公司 生理盐水注射液 天津市鼎国生物技术有限公司 苦味酸 天津市大茂化学试剂厂 北京科苑华生物技术有限公司 甲酰胺 北京科苑华生物技术有限公司 溴化乙锭 北京科苑华生物技术有限公司 北京科苑华生物技术有限公司 上海生工生物工程公司 上海生工生物工程公司 琼脂糖 上海生工生物工程公司 .逆转录酶 美国公司 天根生化科技北京有限公司 酶抑制剂 天根生化科技北京有限公司 聚合酶 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