高效液相色谱法测定大蒜中蒜氨酸含量

高效液相色谱法测定大蒜中蒜氨酸含量 高效液相色谱法测定大蒜中蒜氨酸含量 高效液相色谱法测定大蒜中蒜氨酸含量 王伟乔旭光李福伟 1(山东农业大学食品科学与工程学院,泰安,271018)2(山东省科学院分析测试中心,济南,250014) 摘要采用高效液相色谱法对大蒜中的蒜氨酸进行定性定量研究,利用微波灭酶,水煮灭酶,有机溶剂冷冻灭 蒜氨酸的出峰时间为3.717min,测得蒜氨酸酶3种方法对大蒜中蒜氨酸进行提取. 的含量为:0.823%, 0.730%和0.156%.同时对大蒜破碎放置1d后体系中剩余蒜氨酸的含量进行了分析,测得剩余蒜氨酸含量占 蒜氨酸总量的23.0%.通过向破碎的大蒜体系中添加磷酸吡哆醛(PLP),能够显着提高蒜氨酸的转化率. 关键词大蒜,蒜氨酸,高效液相色谱,含量 大蒜(AlliumsativumL)为百合科葱属植物蒜 的鳞茎,含有丰富的营养物质且具有抗肿瘤,保护心 血管系统,降低血糖等功效_lJ.大蒜之所以具有广 泛的药理作用,原因在于大蒜含有的生物活性物质 —— 含硫化合物.蒜氨酸(S一烯丙基一L一半胱氨 酸,Alliin)是大蒜中的一种主要含硫氨基酸.大蒜 破碎后,存在于大蒜细胞质中的风味前体物蒜氨酸被 存在于液泡中的蒜氨酸酶(Alliinase)催化,在磷酸吡 哆醛(PLP)的协同作用下,分解为大蒜素(Allicin)和 丙酮酸I2J.蒜氨酸的传统测定方法有定硫法,硝酸 汞测定法,苯腙法[,茚三酮反应法_4J,这些测定方 法存在专一性差,结果准确度不高等问题,最新的美 国药典I5采用衍生化法测定大蒜中的蒜氨酸,操作 麻烦,气味难闻.文中采用高效液相色谱法,操作简 单,线性关系良好. 1材料与方法 1.1原料 新鲜大蒜,产自山东泰安. 1.2主要仪器 Waters600高效液相色谱仪,多功能食品加工 机,微波炉. 1.3主要试剂 蒜氨酸(纯度90%),Fluka公司. 1.4蒜氨酸溶液的配制 取蒜氨酸10mg,定容至10mL,配制成浓度为 900~g/mL的蒜氨酸溶液.再稀释成450,300,225, 180,150,90肚g/mL的标准溶液. 第一作者:硕士研究生(乔旭光为通讯作者). *国家自然科学基金(No.30270937)和国家863(No 2001AA248021)资助 收稿日期:2005—12—07,改回日期:2006—02—27 1.5蒜氨酸的液相色谱分析条件 Waters600高效液相色谱仪,C18色谱柱(250 Film×4.6mm,5.0111),Waters996检测器,检测波 长为214nFfl,v(甲醇):V(水):60:40,流速为0.8 mL/min,进样量10L. 1.6鲜蒜供试液的制备 (1)微波灭酶后大蒜样品的制备(A):称取10g 大蒜,微波灭酶5min,然后加50mL水破碎,转移至 容量瓶中并加水定容至100mL. (2)水煮灭酶后大蒜样品的制备(B):称取10g 大蒜,沸水煮10min,然后加50mL水破碎,转移至 容量瓶中并加水定容至100mL. (3)有机溶剂冷冻浸提蒜氨酸样品的制备l6J (C):参考文献[6],大蒜称取10g. (4)大蒜未经灭酶处理的样品制备(D):称取10 g大蒜,加50mL的水破碎室温下放置1d,转移至容 量瓶中并加水定容至100mL. (5)大蒜加水破碎反应30min样品的制备(E): 称取10g左右大蒜,加50mL水破碎,室温下放置 30min,然后煮沸10rain,冷却后转移至容量瓶中并 加水定容至100mL. (6)大蒜加5mmol/LPLP溶液反应30min样 品的制备(F):称取10g大蒜,加50mL的5mmol/ LPLP破碎,室温下放置30min,然后煮沸10rain, 冷却后转移至容量瓶中并加水定容至100mL. 1.7高相液相分析前处理 将制备好的供试液静置2h,取上清液离心 (10000r/rain,10min),取10mL离心上清液稀释至 100mL,滤膜过滤,然后上样分析. 2结果与分析 2.1蒜氨酸的液相色谱图 Q生蔓丝整蔓生塑(星蔓Q塑I115f F00DANDFERMENTATIONINDUS,rRIES 纯品蒜氨酸的液相色谱如图1所示,蒜氨酸的保 留时间3.717rain. 图1蒜氨酸的液相色谱图 2.2蒜氨酸的标准曲线 将浓度分别为900,450,300,225,180,150,90 /~g/mL的蒜氨酸标准溶液每个进样3次取平均值, 以峰面积为横坐标,蒜氨酸含量为纵坐标作标准曲 线,得到标准回归曲线方程为: Y=6.1299X一1.8639 式中:Y为蒜氨酸浓度(/~g/mL); X为峰面积(×10). 该回归方程的相关系数为0.999965,可见蒜氨 酸浓度在90,900~g/mL之间,浓度与峰面积的线 性关系良好. 2.3精密度,添加回收率实验 吸取同一浓度的蒜氨酸标准溶液,重复测定5 次,结果见1.准确取已知含量的样品,加入不同 浓度的对照品,按上述色谱条件测得的回收率见表 2 表1蒜氨酸测定的精密度实验 纛加入量.测定次数喜暑回收率 . mL一1旭?LI . mL一.mL一1/oL /旭?mL'/旭?mL'/旭.mL' 和回收率均较高. 2.4蒜氨酸含量的测定 2.4.13种灭酶方法测得的蒜氨酸含量 3种灭酶方法提取的蒜氨酸的液相色谱分析如 图2,图3和图4所示,含量见表3. 2.004.006.008.0010.00 时间/min 图2微波灭酶提取的蒜氨酸的液相色谱(A) 1.50 1.00 0..50 0.00 2.004.006.008.0010.00 时间/min 图3水煮灭酶提取的蒜氨酸的液相色谱(B) 0.20 《 0.00 2.004.006.008.0010.00 时间/rain 图4有机溶剂冷冻浸提蒜氨酸的液相色谱(C) 表33种灭酶方法测得的蒜氯酸含量 2.4.2大蒜破碎放置1d后剩余蒜氨酸的含量 从表1和表2可以看出,这种测定方法的精密度大蒜破碎放置1d后 ,上样进行液相分析,仍可 116lll6VOI.32NO.4(Total220) 检测到蒜氨酸的残留,如图5所示,剩余蒜氨酸的含 量为0.189%. lJ00 0.50 0.00 时间/rain 图5大蒜破碎反应1d后的液相色谱图(D) 2.4.3加5mmol/LPLP对蒜氨酸转化率的影响 由图6知,只加水的破碎大蒜体系中存在大量的 蒜氨酸,含量为0.193%;由图7知,添加5retool/L PLP的破碎大蒜体系中蒜氨酸的含量较图6要少, 蒜氨酸的含量为0.103%. 三0.50 0.00 l_O02.O03.O04.O05.O06.O0 时问/rain 图6大蒜破碎后反应30min的液相色谱(E) lJ50 lJ00 《0.50 n舯 2.004.006.008.0010.00 时问/rain 图7加PLP反应30min的液相色谱(F) 3结论 3.1大蒜中的蒜氨酸的含量 微波,水煮,有机溶剂3种灭酶方法测得的蒜氨 酸的含量分别为0.823%,0.730%,0.156%(鲜重), 可见微波灭酶的效果最好,蒜氨酸的含量为2.39% (干重,鲜蒜含水量65.1%).水煮灭酶法提取的蒜 墨露蕊 氨酸的含量低于微波灭酶法,可能是由于水煮过程不 能快速彻底灭酶而导致一部分的蒜氨酸被酶催化生 成大蒜素.而有机溶剂冷冻浸提因为大蒜未破碎,所 以提取率低,可采用多次冷冻浸提提高蒜氨酸的提取 率. 3.2大蒜破碎后剩余蒜氨酸的含量 大蒜破碎后,体系中的蒜氨酸不能全部转化生成 大蒜素,剩余的蒜氨酸含量占到总含量的23.0%(以 微波灭酶提取的蒜氨酸总量计).对于蒜氨酸的未完 全反应,可能是由于大蒜中的催化蒜氨酸生成大蒜素 的蒜氨酸酶在反应的过程中受到了抑制,失去了进一 步催化蒜氨酸的能力. 3.3磷酸吡哆醛对蒜氨酸转化率的影响 磷酸吡哆醛可以有效的提高蒜氨酸的转化率,通 过添加5mmol/L磷酸吡哆醛可以将蒜氨酸的剩余 率由23.5%降低到12.5%.说明作为蒜氨酸酶的辅 酶,磷酸吡哆醛可以在大蒜的破碎体系中保持蒜氨酸 酶的稳定性,从而提高蒜氨酸的转化率. 参考文献 1钱岳晟,徐定海,王崇行,等.大蒜对高血压患者血脂,血 糖,血压作用的临床研究[J].浙江中医学院,1999,24 (4):45,46 2EllmoreGS,FeldbergRS.Allinlyaselocalizationinbundle sheathsofthegarlicclove(alliumsativun)[J].AmeriJournal ofBotany,1994,81(1):89,94 3张维勤.大蒜及制剂中大蒜辣素的含量测定[J].中草药, 1985,16(10):17 4何照范,张迪青.保健食品化学及其检测技术[M].北京: 中国轻工业出版社,1999.141,142 5TheUnitedStatePharmacopoeialConyention.TheUnited StatePharmacopoeia(Asian).25th.ed.Rockville,2002 6JaneELancaster,KathleenEKelly.QuantitativeAnalysisof theS-alk(en)yl—L—cysteineSulphoxidesinOnion(Allium— cepaL.)[J].JSciFoodAgric,1983,34:1229,1235 7常军民.HPLC测定不同产地大蒜中蒜氨酸的含量[J]. 中成药,2004,26(12):1025,1027 8黄雪松,温丽儿,宴日安.反相高压液相色谱法测定鲜蒜 中的蒜氨酸[J].食品与发酵工业,2005,31(5):106,109 9常军民,陈坚,张丽静.HPLC法测定小鼠血浆中蒜氨 酸的浓度[J].中成药,2003,25(3):230,231 (下转第121页) 堡蔓丝查蔓璺塑星蔓塑J117 检测方法适用于番茄饮料中番茄红素的提取和测定, 为果汁中番茄红素的测定提供了有效的分析方法. (2)应用高效液相色谱方法定性,定量分析了5 种番茄饮料中的类胡萝b素,发现被测样品中的类胡 萝b素主要为番茄红素,番茄红素含量基本达到或高 于国家标准的要求. (3)番茄红素主要存在于番茄果肉中,在通常的 室温或冷藏及光照保存条件下番茄饮料中番茄红素 稳定性良好. 2 3 参考文献 Wilhelms.HelmutS.Lycopene:ABiologicallyimportant carotenoidforhumans[J].ArchivesofBiochemistryand Biophysics,1996,336(1):1,9 NorrishAE,JacksonRT.Prostatecanceranddietary carotenoids[J].AmericanJournalofEpidemiology,2000, 151(2):119,123 中国标准出版社第一编辑室.中国食品工业标准汇编 [M].北京:中国标准出版社,2003.GB10474,89,353, 356 4GranadoF,OlmedillaB,BlancoI.Carotenoidcompositionin rawandcookedSpanishvegetables[J].AgriculturalFood Chemistry,1992,40(11):2135,2140 5CarftNE,StephenA,WiseJ~ephH.Optimizationofan isocratichigh-performanceliquidchromatographicseparation ofcarotenoids[J].JournalChromatography,1992,589:171 —— 176 6RoomnsHS,HarryHS.EvaluationandvalidationofanLC methodfortheanalysisofcarotenoidsinvegetablesandfruit [J].FoodChemistry,1997,59:599,603 7KoningsEJM,ScottKJ,HartDJ.Furtherobservations onproblemsassociatedwiththeanalysisofcarotenoidsby HPLG2:Columntemperature[J].FoodChemistry,1993, 47:403,405 8LinCH,ChenBH.Determinationofcarotenoidsintomato juicebyliquidchromatography[J].JournalofChromato— graphyA,2003,1012:103,109 StudyonAnalysisandStabilityofLycopenefromTomatoJuice ZhuLeiChenMinLiHeZhangYunling (1CollegeofFoodScienceandNutritionalEngineering,ChinaAgriculturalUniversity,Beijing100083,China) ABSTRACTTheextractandanalysismethodsoftheLycopeneintomatojuicewerestudiedbyusingfivetomato juicesamplesfromthemarket.Thebestextractmethodwastousepetroleumastheextractionsolutionandaided byultrasound.andtherecoveryis91%.ThequantitativeanalysisofLycopenewasdiscussedandSpectropho— tometerandHPLCmethodswerecomparedMoreover,thestabilitystudyresultshowedthatLycopenewasvery stableintomatojuicebutquiteunstableinacetonesolutionunderUV. Keyslycopene,tomatojuice,HPLC (上接第117页) DeterminationofAlliininGarlicbyHighPerformance LiquidChromatography WangWeiQiaoXuguangLiFuwei2 1(CollegeofFoodScienceandEngineering,ShandongAgricultureUniversity,Taian271018,China) 2(TestCenter,ShandongAcademyofScience,Jinan250014,China) ABSTRACTThequalitativeandquantitativedeterminationofalliiningarlicwasstudiedbyhighperfclrmanceliq— uidchromatography.Thealliinwasextracledbythereinactivatedenzymemethods,includingmicrowave,boiled water,chilledorganicsolvent.Theretentiontimeofalliinis3.717min.Thealliincontentofgarlicwas0.823%, 0.730%.0.156%.Theresidualquantityofalliinonedaylateris23.0%.Thetransformationratioofalliinwas improvedbytheadditionofpyridoxinephosphate(PLP). Keywordsgarlic,alliin,highperformanceliquidchromatography,content 2oo6年第32卷第4期(总第220期)f121