血红蛋白电泳操作规程

血红蛋白电泳#操作# 一． 项目名称 血红蛋白电泳（HYDRAGEL HEMOGLOBIN） 二． 检验方法名称 琼脂糖凝胶区带电泳 三． 方法学原理 血红蛋白的结构、分子特性取决于形成其肽链的氨基酸顺序和性状。氨基酸不同可形成不同的血红蛋白，其面电荷不同，在电场中的泳动率不同，这还与pH、电泳缓冲液的离子强度等有关。血红蛋白异常有二种类型：血红蛋白性质或结构的异常称之为血红蛋白病。血红蛋白中的一条链合成减少引起血红蛋白性质异常，称之为地中海贫血。实验使用洗涤过红细胞的溶血液来进行，在碱性的凝胶片上进行电泳来分离血红蛋白，分离出来的片段通过氨基黑染色剂来显色，烘干后的凝胶片就可以用来解释结果了。 四． 方法学溯源 自1930年由Tiselius发现了移界电泳（moving boundary eectrophoresis），而后，这种技术的各种局限性已逐渐被区带电泳（zone elecrrophoresis）所克服，区带电泳的条件和支持介质的选择是电泳成败的关键。 五． 仪器 （一） 型号：SEBIA  HYDRASYS (PN1210) （二） 分析和计算参数： 1． 处理量：约45个样本/小时 2． 所需样本量：10ul 3． 检验时间：约半小时 4． 重复性：有良好的批内和批间重复性 5． 电泳参数：电压0－300V（可选至3000V） 电流0－500mA 功率0－100W 六． 试剂及配套品 （一） 试剂 1． HYDRAGEL 7 HEMOGLOBIN（E）试剂盒 HYDRAGEL 15 HEMOGLOBIN（E）试剂盒 （1） 商标：SEBIA （2） 包装规格：70测试/150测试 （3） 货号：PN4106/ PN4126 2． 脱色液         （1）  商标：SEBIA         （2）  包装规格：Pack for 10×100ml （3）  货号：PN4540 (4)    成分：柠檬酸 3．洗涤液 （1） 商标：SEBIA （2） 包装规格：Pack for 10×80ml （3） 货号：PN4541 （4） 成分：叠氮钠 4．生理盐水 （二） 配套品 血红蛋白质控 （1） 商标：SEBIA (2)  包装规格：Pack for 1×1ml (3)  货号：PN4791 七． 操作步骤 ㈠ 开机，启动电泳仪。 ㈡ 将加样梳置于平板上，有数字的一端向上，在2分钟内完成每块加样梳的加样，每孔加10ul样品，然后齿梳向上把加样梳放于湿盒内5分钟。 ㈢ 选择“7/15Hb”电泳程序。当预期HYDRAGEL 7 / 15 HEMOGLOBIN(E)凝胶片上出现HbF和HbS，为了更好的分离，推荐使用“7/15 Hb F-S”电泳程序。 ㈣ 从包装袋内取出缓冲条，将其固定在电极支架背侧的钉上，再取出凝胶，用薄滤纸快速轻轻地吸去凝胶表面多余的液体，在温控板表面下1/3处加120μl[HYDRAGEL 7 HEMOGLOBIN（E）]或200ul[HYDRAGEL 15 HEMOGLOBIN（E）]蒸馏水或去离子水，将凝胶片底边紧靠框架底边，边缘对齐边线，略弯曲凝胶片慢慢放平，注意凝胶片下面勿出现气泡。 ㈤ 自然放下支架，从湿盒中取出加样梳并去除齿梳下的保护支架，“7/15Hb”电泳程序时，将加样梳放在4号位置，“7/15 Hb F-S”电泳程序时，将加样梳放在3号位置。注意点样梳上的数字必须面对操作者，关上电泳舱盖，按下键盘左侧的绿色箭头“START”键，电泳开始，确保仪器右侧的空气通道不被堵塞。 ㈥ 电泳仪自动发出蜂鸣声,提示电泳结束，打开电泳盖，将加样梳和缓冲条丢弃，取出已烘干的胶片，用湿纸巾擦拭电极和温控板，将胶片固定于凝胶支架上放入染色空间中，在检查染色液瓶内是否有300ml染色液，脱色液瓶内是否有1000ml脱色液以及是否排空了废液瓶后，选择“PROT./B1-B2/Hb”染色程序并按“start”键开始染色。 ㈦ 在染色、脱色以及干燥步骤完成后，电泳仪自动发出蜂鸣声，取出凝胶支架，将烘干的胶片用光密度仪进行扫描，若希望胶片背景更加清晰，在进行扫描前可以额外增加一个冲洗步骤，程序为“WASH ISOENZ/GEL”。 ㈧ 关机，在电脑系统上对扫描结果进行分析。 八． 参考范围 血红蛋白A    ≥ 96.5% 血红蛋白F    2.0% 血红蛋白A2    ≤ 3.5% 九． 临床意义 使用HYDRAGEL7/15 HEMOGLOBIN（E）试剂可初步筛查有无血红蛋白病和地中海贫血。若发现异常，应采用适当方法如酸性凝胶电泳等进一步分析测定，以确定异常。 以下疾病的异常图谱特征：                                       HbA              HbA2 α地贫                  有H带/Bart’s带    ↓ β地贫                                        ↓            ↑ 〉3.5                                                     〈 8 HbH病                    有H带出现 血        红        蛋        白      B    art胎      儿    水        肿          综      合      症    有      B      a      r    t带出现〉80% S/D病                                            有          S      / D出        现    C/E病                                                    有      C        /        E出      现 一十． 标本要求 ㈠ 建议采用新鲜抗凝血标本。抗凝剂选用EDTA，柠檬酸或肝素均可，避免碘乙酸。采血应按照临床实验室检测要求进行。必要时，可储存于2-8℃，5天。 ㈡ 按照试剂盒内使用说明对标本进行准备： -在进行样品准备前混匀收集试管。 -抗凝血离心，5000rpm，5分钟。 -去除血浆。 -用10倍体积的生理盐水洗涤红细胞2次。若红细胞体积小于10μl，需特别小心。 -在将10μl的样本加到溶血液前，去除红细胞上层多余的生理盐水并震荡混匀。 -体积10μl红细胞加入130μl溶血液造成溶血。 -震荡混匀10秒钟，室温下培育5分钟即可。 注意：对于中度（10g/dl）或重度（7g/dl）贫血的病例，点样量应分别增大为15ul或20ul，其结果不受影响。 H 带的血红蛋白液的制备 -在进行样品准备前混匀收集试管。 -抗凝血离心，5000rpm，5分钟。 -去除血浆。 -用10倍体积的生理盐水洗涤红细胞2次。若红细胞体积小于10μl，需特别小心。 -在将40μl的样本加到溶血液前，去除红细胞上层多余的生理盐水并震荡混匀。 -体积40μl红细胞加入100μl溶血液造成溶血。 -震荡混匀10秒钟，室温下培育5分钟。 -离心，10000rpm，5分钟即可。 ㈢ 避免使用溶血标本。 十一. 操作注意事项 ㈠ 为达到最佳检测效果，同一试剂盒内的所有组分必须一并使用。 ㈡ 氨基黑染液的配制必须按照试剂盒内使用说明配置，否则会降低蛋白片段的检测效果。 ㈢ 用薄滤纸吸去凝胶表面多余液体时，接触时间不能太长，应快速移去，以免凝胶脱水。 ㈣ 注意先挂缓冲条再放凝胶片，缓冲条取出时应均匀挤捏使缓冲液能分布均匀。