重组大肠杆菌DH5α发酵培养基的优化

重组大肠杆菌DH5α发酵培养基的优化 重组大肠杆菌DH5α发酵培养基的优化 ? 128?广州化工2009年37卷第3期 重组大肠杆菌DH50(发酵培养基的优化 张怡洁-,李聪z,王鹏,申烨华z,一,张英起 (1西北大学生命科学院,陕西西安710069; 2西北大学合成与天然功能分子化学教育部重点实验室,化学与材料科学学院,新 药研究所,陕西西安710069; 3第四军医大学药学系生物技术中心,陕西西安710033) 摘要:为了提高重组大肠杆菌DH5Ot生产rNGR—Turn一5,研究了培养基中不同 种类的碳氮源物质和微量元素对工程菌生产蛋 白能力的影响.得出在培养基组分(%)为:甘油1,酵母粉3,蛋白胨1,氯化钠0.5,微量 元素母液150时,重组大肠杆菌DH5生产 rNGR-Tum一5最强,较初始培养基提高了5倍. 关键词:重组大肠杆菌;培养基优化;rNGR—Tum一5 OptimizationforFermentationMediumofRecombinantE.cofiDH5 ZHANGYi-jie1,LIConf,WANGPengSHENYe-hua~3,ZHANGYing-qi (1DepartmentofLifeScience,NoflhwestUniversity,ShaanxiXi'an710069;2KeyLaborato ryof SyntheticandNaturalFunctionalMoleculeChemistryofMintistryofEduction,CollegeofC hemistryand MaterialsScience,InstituteofDrugDiscovery,No~hwestUniversity,ShaanxiXi'an710069 ; 3BiotechnologyCenter,SchoolofPharmacy,FourthMilitaryMedicalUniversity,Shaanxi Xi'an710033,Chin~ Abstract:ToimprovetheproductivityofrNGR—Tum一 5fromrecombinantEcolDH5,theeffectofdifferenttypesof carbon.nitrogensourcesandtraceelementsintheculturemediumontheyieldofrNGR—Turn一5wereinvestigatedwith shakingflaskmethod.ItwasfoundthattheproductivityofI?NCR—Turn一5fromrecombinantEcoliDH5wastl1ehighestand raisedfivetimesoverthatintheinitialculturemediumundertheconditionof1%glycerol,3%y eastextract,l%peptone, 0.5%sodiumchlorideand150traceelementssolutionintheculturemedium(w/w). Keywords:recombinantE.coli;theoptimizationofculturemedium;rNGR—Tum一5 Tumstatin(胶原1Vd3链的非胶原区域1)是一种内源性血管 生长抑制因子.Turn一5是由Tumstatin接近N端的54—132位氨基 酸组成的,它是Tumstatin抗血管形成的功能结构域,含有5个半 胱氨基酸,与全长的Tumstatin具有同等的抗血管生成效能,但可 降低其引起肺一肾出血综合症的副作用【1'.NGR是从噬菌体展示 文库中筛选出的一种可以和肿瘤新生血管特异性结合,含13个氨 基酸的寡肽.目前,基于NGR导向肽所建立的以肿瘤血管为靶位 的治疗策略已经广为应用.rNGR—Turn,5是一种抗肿瘤血管生成 的基因工程药物,既具有肿瘤血管导向性,又是内源性肿瘤血管生 成抑制剂的衍生物.本研究对培养基的主要成分—碳,氮源进行 了优选,并考察了微量元素对菌体生长和蛋白达的影响,以期提 高rNGR—Turn一5的产量,为其工业化生产提供依据. 1材料与方法 1.1菌种 E.eoliDH50[/pQE—TN(rNGR—Turn一5)工程菌由第四军医大学 生物技术中心构建. 1.2培养基 常用培养基LB,M9,SOB,MBL. 微量元素母液的配制:每1L溶液中含有:FeC1,?6H203.24 g,ZnC120.22g,CoC12'6H2O0.24g,NaMoO4'2H200.24g,CaC12' 2H2OO.12g,CuSO4'5H2O0.20g,H3BO31.0g,MgSO40.74g. 1.3试剂 酵母粉,蛋白胨系英国Oxoid产品,蔗糖,葡萄糖,甘油, NHC1,NaCl等均系国产分析纯试剂. 1.4培养方法 一 70?甘油管冻存之工程菌划线接种于含氨苄(Amp)的LB 固体琼脂平板中,37~C孵箱放置12h,挑取单克隆接种于装有5 mL指定培养基的小试管中,在30~C,200rpm的摇床上活化振荡 过夜.8h后取2mL菌液以1:100比例接种于装有200mL指定 培养基(含100g/mLAmp)的摇瓶中,37?进行培养.进入对数 期中期后,加入IPTG(0,5mmol/L)诱导,4h后4200rpm离心20 基金项目:第四军医大学博士后基金,陕西省科学技术研究发展计划,2005K— G1(8);陕西省教育厅产业化教育项目05JC30. 作者简介:张怡洁(1983一),女,西北大学,硕士.联系人:申烨华,女,教授,博士生导 师,Email:yhshen@llWHedu.cn. 2009年37卷第3期广州化工?129? min,收菌. 1.5菌体浓度的测定 比色法测定,以600nm波长处的光密度0D表示. 1.6蛋白rNGR—Tum一5表达量的测定 发酵液菌体做SDS—PAGE【5J,用Band—scan软件测定rN— GR—Turn一5表达量. 2结果与讨论 2.1不同培养基对菌种生长及蛋白表达量的影响 提取菌种质粒,并转化至感受态细胞,在LB琼脂培养基上 划板,挑选出表达量高的单克隆做为菌种以供后续实验使用.分 别用培养基LB,M.,SOB,MBL在同一条件下培养菌种,分别考查 不同培养基对重组大肠杆菌DH5的生长量和目标蛋白一 GR—Tum一5表达量的影响,实验结果见表1.由表1可见,工程菌 在LB培养基中生产rNGR—Tum一5的能力最大,为0.54.所以选 定LB培养基进行优化实验. 表1四种培养基中蛋白生产能力 2_2培养基中碳源的优化 工程菌多采用甘油,葡萄糖,蔗糖做为碳源,因此分别添加 不同浓度的甘油,葡萄糖,蔗糖与不含碳源的初始LB培养基作 对照,考查不同种类,不同浓度的碳源物质对重组大肠杆菌 DH5的生长量和rNGR—Turn一5表达量的影响情况,实验结果 见图1和图2. 由图1可知,添加甘油和葡萄糖后,终止OD由4.5最高可 增长到6.9(葡萄糖或甘油1%处),高于不加碳源时的水平;而 添加蔗糖时,对终止0D影响程度较小,由4.5最高可增长到 5.9;随着碳源浓度的增高,终止0D都是先升高后降低,有一个 最优值.这可能是因为碳源浓度过高时,糖代谢产生过量的酸l生 物质,使菌体生长的微环境恶化,影响某些酶的活性阚,抑制了菌 体的生长. 由图2可知,培养基添加碳源后,rNGR—Tum一5的表达都有 不同程度的提高.其中甘油的添加影响效果最明显,使目标蛋白 8 6 4 0 2 () 0l23 碳源浓度/% — ._一甘油 — ?一葡萄糖 —一 蔗糖 图1碳源对工程菌生长情况的影响 冰\ 血4 懈 f 暑 I 0 毛 — '一甘油 — —一葡萄糖 — 矗一蔗糖 碳源浓度/% 图2碳源对rNGR—Tum一5表达量的影响 的表达量由12%提高到28%,添加葡萄糖,蔗糖使目标蛋白的 表达量由12%分别提高到22%和2O%.并且随着碳源浓度的 增加,目标蛋白的表达同样经历了一个先升后降的过程. 以碳源浓度为横坐标,rNGR—Turn一5的生产能力为纵坐标, 作图3,可看出甘油浓度在1%时,工程菌生产NGR—Tum一5的能力 最强,所以选定1%的甘油为碳源物质. 蛊 基 r_ 0 毛 2 1.5 O.5 0 3 ?甘油 — ?一葡萄糖 —一 蔗糖 碳源浓度,% 图3碳源对工程菌生产rNGR—Tum一5能力的影响 2.3培养基中氦源的优化 原LB培养基中含有2种氮源(酵母粉和蛋白胨),蛋白胨 含量保持不变(1%),酵母粉的添加量发生变化;酵母粉含量保 持不变(0.5%),蛋白胨的添加量发生变化;酵母粉(0.5%)和 蛋白胨(1%)含量都不变,氯化铵的添加量发生变化.选择1% 的甘油为碳源物质,氯化钠含量保持不变,考察不同种类,不同 浓度的氮源物质对菌种生长和rNGR—Turn一5表达情况的影响. 实验结果见图4,图5. 由图4可知,与含有单一氮源物质相比,增加有机氮源酵母粉 和蛋白胨能有效促进菌体的生长,酵母粉的添加使终止0D从 3.5提高到8.1,蛋白胨的添加使终止0D从3.8提高到7.8.在复 合氮源(酵母粉0.5%,蛋白胨1%)的基础上,添加无机氮源氯化 铵的影响甚微,使终止0D从6.9提高到7.3.与碳源的添加类 似,随着氮源浓度的升高,终止0D有一个先升后降的趋势. ,氮源物质的添加能不同程度提高蛋白的表达 由图5可知 量.其中酵母粉的添加能使蛋白的最高表达量从12%提高到38 %,而蛋白胨和氯化铵的添加分别使蛋白的最高表达量从10%和 28%提高到35%和37%.并且随着氮源浓度的增大,目标蛋白的 表达仍经历了一个先增后减的过程,可能是因为氮源过多时,氨 基酸的代谢产物对菌体生长和目标蛋白的表达有抑制作用【引. ? 130?广州化工2009年37卷第3期 堡 咖1 哼 蓉 车 R 避 {L 善 置 毫 O246 碳源浓度,% — ?一酵母粉 — ?一蛋白胨 —一 氯化铵 图4氮源对工程菌生长情况的影响 — ?一酵母粉 — -一蛋白胨 —一 氯化铵 碳源浓度/% 图5氮源对rNGR—Tum一5表达量的影响 — ?一酵母粉 — ?,蛋白胨 —一氯化铵 碳源浓度,% 图6氮源浓度对工程菌生产rNGR—Tum一5能力的影响 以氮源浓度横坐标,rNGR—Tum一5的生产能力为纵坐标, 作图6.由图6可看出,在酵母粉浓度为3%,蛋白胨浓度为1% 时,目标蛋白生产能力最强,可达3.4.所以选定氮源成分为3% 的酵母粉和1%的蛋白胨. 2.4培养基中微量元素的优化 微生物在生长繁殖过程中,需要某些无机盐如磷,镁,硫, 钾,钠等,以作为其生理活性物质的组成或生理活性作用的调节 物.这些物质一般在低浓度时对微生物生长和产物合成有促进 作用,在高浓度时常表现出明显的抑制作用.而各种不同微生物 及同种微生物在不同的生长阶段对这些物质的最适浓度要求均 不相同,因此在生产中要通过实验预先了解菌种对微量元素的 最适需求量,以稳定或提高产量[司. 在100mL选定的培养基中分别添加0,50,100,150,200l 微量元素母液,培养基用空白,A,B,C,D表示.实验结果见表2. 由表2可见,添加微量元素后,终止0D和目标蛋白的表达略 有提高,其中添加微量元素母液150L时,终止0D最大,为 表2微量元素对工程菌生长情况及蛋白表达的影响 8I4,同时rNGR—Tum一5表达量也最大,为42%. 2.5优化培养基实验 优化后的培养基记为LB1,组成成分是甘油1%,酵母粉3 %,蛋白胨1%,氯化钠0.5%.LB1与LB培养基的实验结果见表 3.图7为rNGR—Turn一5在两种培养基中表达量的对比. 由表3可,与初始LB培养基相比,优化后培养基LBI使菌 表3初始培养基LB与优化后培养基LB1的对比 NGR—Tum一5 图7初始培养基LB与优化后培养基LBI的对照 1Marker2诱导前3LB4LB1 体终止0D由4.5提高到8.4,rNGR—Tum一5表达量由12%提高 到42%,目标蛋白的生产能力也随着大幅增长,由0.54增长到 3.5,较初始提高了5倍,为工程菌的高密度发酵奠定基础. 参考文献 [11HellmarkT,BurkhardtH,WieslanderJ.GoodpasturediseaseCharacteri- zationofasingleeonformationalepitopeasthetargetofpathogenicalJ— toantibodies?.BiolChem.1999,274(36):25862-25869. 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