医学论文-使用FLAG标签肽及慢病毒载体共同筛选小鼠foxp3基因RNA干扰的有效靶点

医学论文-使用FLAG标签肽及慢病毒载体共同筛选小鼠foxp3基因RNA干扰的有效靶点 使用FLAG标签肽及慢病毒载体共同筛选小鼠foxp3 基因RNA干扰的有效靶点 作者:史艳侠， 韩文杰， 彭柔君， 张景航， 黄慧强 姜 文奇 【摘要】 【目的】 筛选高效的foxp3 RNA干扰的靶点用于阻断 CD4+CD25+Treg细胞的免疫抑制功能。【方法】使用oligoengine软件设计 foxp3基因 shRNA 序列，化学合成法合成4条shRNA 序列，构建含foxp3 的 靶序列的慢病毒载体;构建出表达FLAG融合蛋白和目的基因的工具细胞293T 细胞用于筛选RNA干扰的有效靶点;【结果】成功包装了4条foxp3基因靶序 列相应的慢病毒颗粒;成功构建了表达融合蛋白和目的基因的293T工具细胞; 在工具细胞上筛选出了2条RNAi效率分别为91.3,和95.6 ,的有效靶点。 【结论】使用FLAG融合蛋白和慢病毒载体能够筛选出Foxp3基因的RNAi最佳 靶点。 【关键词】 foxp3; FLAG蛋白; 慢病毒载体, CD4+CD25+Treg， RNA干扰 Abstract:【Objective】 To screen the high effective RNA intervening targets of foxp3 gene to block the immunosuppression of CD4+CD25+Tregs. 【Method】 Four shRNA sequences were designed by oligoengine software and synthesized by chemical method. Lentiviral vector that consists target sequences of foxp3 was constructed. The 293T tool cell line that express FLAG fusion protein and target gene was constructed to screen the effective targets for RNA interference. 【Result】 Lentiviral vector that contains foxp3 cDNA sequences was constructed successfully. The 293T tool cells that express FLAG fusion protein and foxp3 gene fragments were constructed successfully. Two effective targets for RNAi were screened in 293T tool cells, the blocking efficiency were 91.3% and 95.6 % respectively. 【Conclusion】 The optimal targets of Foxp3 gene for RNAi can be screened by FLAG fusion protein and lentivirus vector. Key words: Foxp3; FLAG fusion protein; Lentiviral, CD4+CD25+Treg , RNA interfere Foxp3是一种转录抑制因子，是forkhead/winged-helix 家族成员，和细胞 生长发育的调控有关[1]，后来越来越多的证据表明foxp3可能是一种 CD4+CD25+Treg免疫抑制性调节细胞发育、分化的至关重要的基因，并在其表 型和功能的维持中起非常关键的作用[2-5]。目前foxp3基因已经成为免疫治疗 的一个重要的靶点，引起越来越多的关注。但是CD4+CD25+ Treg细胞仅占外周CD4+T淋巴细胞的 10%,15%，体外分离的成本高昂而且目前还没有很好的体外扩增方法，这为进一步的体外研究带来很大困难。使用慢病毒为载体进行RNA干扰阻断foxp3的功能并使之能在Treg细胞中长期表达是解决这一问的较好的方法。Flag是一个由十几个氨基酸组成的蛋白标签，由目的蛋白(target protein)和标签(tag)共同构成的蛋白嵌合体，常标记于重组蛋白质的氨基端以帮助分析靶蛋白的生物学功能，用于目的细胞暂时不易得到或目的细胞转染效率非常低基因靶点的筛选[6]。本实验采用FLAG融合蛋白和foxp3基因共同构建靶基因重组真核表达质粒，瞬时转染进293T工具细胞中，筛选出具有RNAi效率的有效靶点，为进一步敲除foxp3基因功能的免疫治疗研究奠定基础。 1 材料和方法 1.1 动物与细胞 8 周龄雌性C57BL/6小鼠, 由中山大学实验动物中心提供。 1.2 试剂 小鼠CD4+CD25+Treg细胞磁珠分离试剂盒、小鼠CD4-FITC单抗、小鼠CD25-PE单克隆抗体均购自MiltenyiBiotec公司。HRP标记的羊抗小鼠IgG及小鼠mAbIg亚类检测试剂盒均购自Sigma公司。RPMI 1640培养基购自Gibco公司。小牛血清购自Gibco公司。羊抗小鼠foxp3mAb购自eBioscience公司。foxp3慢病毒载体由本试验室构建。Foxp3引物由上海吉凯公司合成, Foxp3-Hind ?/ Foxp3-Kpn?的引物序列为:Forward， 5′CAGATCTCGAGCTCAAGCTTGGATGCCCAACCCTAGGCCAGC 3′:Reverse，5′GATCCCGGGCCCGCG GTACCTCACTTGTCGTCATCGTCTTTGTAGTCAGGGCAGGGATTGGAGCACTTG 3′。 1.3 器 材 硝酸纤维素膜(NC膜)购自Amersham公司。SDS-PAGE设备购自BIO-RAD公司。流式细胞仪为美国BECKMAN-COUTER 公司产品。 1.4 CD4+CD25+Treg细胞的分离 颈脱臼法处死小鼠,取脾脏,在200目滤网上磨碎脾脏，红细胞裂解液裂解红细胞，按照小鼠CD4+CD25+Treg细胞磁珠分离试剂盒说明书进行操作，先阴性选择获得CD4+T细胞;加入FITC标记抗小鼠CD25单克隆抗体,再加入磁珠标记抗FITC,阳性选择获得CD25+T细胞,阴性选择获得CD25-T细胞,通过流式细胞仪(BD FACS Calibur)分析获得的CD4+CD25+T细胞纯度。 1.5 Foxp3总RNA抽提和RT-PCR 测定foxp3 mRNA 水平 取1×106细胞,加入1 mL Trizol,提取总RNA,根据试剂盒说明书进行操作，将总RNA 反转录为cDNA。PCR总反应体系50 μL，循环参数:94 ? 30 min预变性，94 ? 30 s，55 ? 30 s，72 ? 1 min，共30个循环，最后以72? 延伸10 min。 1.6 表达mfoxp3的293T细胞制备 回收mfoxp3 PCR产物后进行Hind ?，Kpn?酶切，回收酶切片段后可以进入后续克隆构建入真核表达载体中。将pEGFP,C1: Hind?，Kpn?酶切，回收4.7 Kb片段，使用连接酶连接mfoxp3酶切产物和pEGFP,C1，形成mfoxp3R-seq+EGFP-C-F 阳性克隆。PCR 片段长度为701 bp。将阳性克隆送上海Invitrogen公司进行3730型测序仪进行测序分析，引物序列如下:foxp3-Hind?，CAGATCTCGAGCTCAAGCTTGGATGCCCAACCCTAGGCCAGC;foxp3-Kpn?，GATCCCGGGCCCGCG GTACCTCACTTGTCGTCATCGTCTTTGTAGTCAGGGCAGGGATTGGAGCACT;foxp3R-seq，AACCAGG CCACTTGCAGAC;EGFP-C-F，CATGGTCCTGCTG GAGTTCGTG。 用无血清培养基把293T细胞悬液稀释到200,2 000个/mL，在0.1 mL的细胞悬液中加入0.1 mL的4 g/L的台盼兰溶液。轻轻混匀，数分钟后计数细胞。取培养2,3 d生长旺盛的细胞，用培养液将细胞配成2×106,2×107细胞/mL。在6孔培养板中每孔加入2 mL细胞悬液，培养24 h后细胞融合度控制在70%,80%。将6孔板的每个孔的培养液体积调整至1 mL, 用2 × g mfoxp3 DNA质粒与240(L DMEM混合。把稀释后的DNA与稀释后的Lipofectamine 2 000进行混合，轻轻地颠倒混匀。混合后，在室温下温育20 min，以便形成质粒DNA与Lipofectamine 2 000稀释液的转染复合物。加入转染复合物培养细胞，在转染满8 h后需更换新鲜的含血清的培养液。转染后36 h取一部分细胞用western blot检测mfoxp3的表达。另一部分细胞扩大培养，进入靶点筛选流程。 1.7 foxp3有效靶点的筛选 使用Oligotide软件设计foxp3基因 shRNA 序列，化学合成法合成四条shRNA 序列，分别为:1# 1-TAAGGTGCAGAGTAGAGCTGGCTTCAAGAGA GCCAGCTCTACTCTGCACCTTTTTTTTC;2-TCGAG AAAAAAAAGGTGCAGAGTAGAGCTGGCTCTCTTGAAGCCAGCTCTACTCTGCACCTTA。2# 1-TGAG GACACTCAATGAAATCTATTCAAGAGATAGATTTCATTGAGTGTCCTCTTTTTTC;2-TCGAGAAAAAA GAGGACACTCAATGAAATCTATCTCTTGAATAGATTTCATTGAGTGTCCTCA。3# 1-TGAGAGAAGT GGTGCAGTCTCTTTCAAGAGAAGAGACTGCACCACTTCTCTCTTTTTTC;2-TCGAGAAAAAAGAGAG AAGTGGTGCAGTCTCTTCTCTTGAAAGAGACTGCACCACTTCTCTCA。4# 1-TCAGACCACACTTCAT GCATCATTCAAGAGATGATGCATGAAGTGTGGTCTGTTTTTTC;2-TCGAGAAAAAACAGACCACACT TCATGCATCATCTCTTGAATGATGCATGAAGTGTGGTCTGA。分别构建含有以上4条foxp3 RNAi shRNA的4种慢病毒载体。 使用慢病毒感染前1 d，以30%,40%的融合度进行目的细胞的接种培养。感染当天，加入适量的病毒。12 h后观察细胞状态，如果没有明显的细胞毒性作用，待到48 h以后更换为正常培养基。如果有明显的细胞毒性作用，12 h以后马上更换为正常 培养基。感染3 d后首先观察基因GFP的表达情况，感染效率大于70%，收集总蛋白进入后续WesternBlot的实验。 2 结 果 2.1 CD4+CD25+Treg细胞的分离 使用小鼠CD4+CD25+Treg细胞磁珠分离试剂盒从脾脏分离出了小鼠CD4+CD25+Treg细胞，经流式细胞仪鉴定其纯度达到了92%。 2.2 foxp3总RNA抽提和RT-PCR 测定foxp3 mRNA 水平 我们从小鼠CD4+CD25+T细胞中提取出总RNA，如图1所示，总RNA样品质量良好,无明显降解现象,可以进入RT-PCR实验。之后应用RT-PCR方法成功克隆出foxp3 cDNA片段长度为1 356 bp(图2)。 2.3 表达mfoxp3的293T细胞制备 按照1.6的实验步骤构建Foxp3R-seq+EGFP-C-F 阳性克隆，然后使用lipofectamine2000转染进293T细胞，使293T细胞能够表达FLAG融合蛋白(图3)以用于RNA干扰有效靶点筛选。 2.4 Foxp3有效靶点的筛选 将含有合成的4条shRNA互补DNA双链的慢病毒颗粒分别转染工具细胞，如图4、5中所示，在干扰质粒:过表达质粒=1 ? 2时4条shRNA互补双链都具有阻断效率;但当干扰质粒:过表达质粒=1 ? 1、1 ? 0.5时只有1#和2#靶点具有阻断效率;再次重复干扰质粒:过表达质粒=1?1的实验仍然得到相同的结果，从而筛选出了具有阻断效率的1#和2#靶点，其阻断效率分别为91.3,和95.6 ,。 3 讨 论 CD4+CD25+Treg在人和小鼠的免疫耐受和肿瘤免疫抑制方面都具有十分重要的作用，它具有免疫抑制性和免疫无能性两大特点。而foxp3 是CD4+CD25+Treg细胞中最重要的免疫抑制性调节因子，可能是Treg细胞启动免疫抑制功能的“开关”。在小鼠，它的移码突变导致半合子的雄性小鼠发生X连锁的致死性淋巴增殖性疾病，在出生后3周内死亡[2]。 foxp3基因位于X染色体, cDNA全长为 3 739 bp，编码的蛋白质(Scurfy)由 429个氨基酸组成，其结构和功能均与人类类似，但是它特异性表达于 CD4+CD25+Treg细胞，是其特异性的核转录因子，被看作是Treg 细胞的管家基因[2,5]。在人类 foxp3不仅可表达于CD4+CD25+Treg细胞 ,还可表达于 CD8+ CD25+ 等抑制型T细胞 。它定位于Xp11.23,Xq13.3，包含 11个外显子和 10个内含子,cDNA全长 1 869 bp。 本实验使用RT-PCR方法从CD4+CD25+ Treg中克隆出了foxp3基因的cDNA 片段，长度为1 536 bp，测序发现其序列与Genebank上的foxp3(054 039) 序列具有同源性，证实了CD4+CD25+Treg中确实存在foxp3基因表达。本实验 也证实了CD4+CD25+Treg细胞约占外周CD4+T细胞的5%,10%，从107,2×107 小鼠脾脏CD4+T细胞中仅能够分选出106,1.2×106 CD4+CD25+ Treg细胞，这 与以前的研究结果相符合[7]。本实验还发现分选出的CD4+CD25+Treg细胞在含 有20 U/mL IL-2 的1640培养液(含10% FBS)中可以存活，但是细胞不增 殖，增加IL-2达到1500 U/mL时细胞仍不增殖，这种原因仍不清楚， Shevach[8]认为CD4+CD25+Treg细胞作为一种Treg细胞，在体外不具有自我扩 增增殖的能力，只有在高剂量的IL-2和CD3、CD28持续共刺激的情况下才具有 低水平扩增的能力。目前尚无一个可靠的、稳定的CD4+CD25+Treg 细胞的体外 扩增方法，这为体外研究CD4+CD25+Treg的功能和其作用的分子机制带来很大 困难。 由于慢病毒载体可以转染非分裂细胞，同时对CD4+T细胞具有高度的亲和 力，并能整合入细胞的基因组中长期持续的表达外源基因，因此对于 CD4+CD25+Treg细胞来说是比较理想的基因转染的载体。FLAG融合蛋白作为一 种筛选靶点的工具，具有不受细胞数量限制，对于在体外难于转染的细胞的靶 点筛选准确的优点【8-10】。本研究利用PCR 扩增出目的片段,设计引物时在 上游与下游引物5′端分别加入不同的酶切位点:Hind? 和Kpn?。可确保片段 酶切位点的正确性。本实验利用FLAG融合蛋白作为一种筛选靶点的工具筛选出 了具有RNAi阻断效率的1#、2# 靶点，并构建了包含该片段的慢病毒载体，该 载体可以直接封闭foxp3基因的表达，为进行foxp3基因功能的研究提供了重 要的工具，亦可以直接应用于阻断foxp3基因的免疫治疗的研究，本研究也为 受细胞数量限制、难于转染的细胞的RNAi靶点的筛选奠定了方法学基础，因此 具有很高的实用价值。 【参考文献】 COFFER P J, BURGERING B M. Forkhead-box transcription factors and their role in the immune system [J]. Nat Rev Immunol, 2004, 4(11):889-899. HORI S, NOMURA T, SAKAGUCHI S. Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3 [J]. Science, 2003, 299(5609):1057-1061. MORGAN M E, VAN BILSEN J H, BAKKER A M, et al. Expression of FOXP3 mRNA is not confined to CD4+CD25+T regulatory cells in humans [J]. Hum Immunol, 2005, 66(1):13-20. SUCIU-FOCA N, MANAVALAN J S, SCOTTO L, et al. Molecular characterization of allospecific T suppressor and tolerogenic dendritic cells: review [J]. Int Immunopharmacol, 2005, 5(1):7-11. FONTENOT J D, GAVIN M A, RUDENSKY A Y. Foxp3 programs the development and function of CD4+CD25+ regulatory T cells [J]. Nat Immunol, 2003, 4(4):330-336. KURACHI S, KOIZUMI N, SAKURAI F, et al. adenovirus vectors containing heterologous peptides in the fiber knob, protein IX, or hexon ,,,. Gene Ther， 2007， 14(3):266-274. BLUESTONE J A, ABBAS A K. Natural versus adaptive regulatory T cells [J]. Nat Rev Immunol, 2003, 3 (3): 253-257. SHEVACH E M. CD4 + CD25 + suppressor T cells: more questions than answers [J]. Nat Rev Immunol, 2002, 2 (6):389-400. CORDELIER P, STRAYER D S. Using gene delivery to protect HIV-susceptible CNS cells: inhibiting HIV replication in microglia ,,,. Virus Res, 2006,118(1-2):87-97. 黄云剑，赵景宏， 杨唐俊，等. Smad6和Smad7基因腺相关病毒载体的构建及 其表达 ,,,. 细胞与分子免疫学杂志, 2004 , 20(3):274-277.