同位素稀释质谱法在血清尿酸标物研制及奶粉尿素检测中的应用(可编辑)

同位素稀释质谱法在血清尿酸标物研制及奶粉尿素检测中的应用(可编辑) 同位素稀释质谱法在血清尿酸标物研制及奶粉尿素检 测中的应用 北京化工大学 硕士学位 同位素稀释质谱法在血清尿酸标物研制及奶粉尿素检测中的应 用 姓名:杨梦瑞 申请学位级别:硕士 专业:分析化学 指导教师:杨屹;戴新华 研究生毕业论文 20090521北京化工大学硕: 同位素稀释质谱法在血清尿酸标物研制 及奶粉尿素检测中的应用 摘要 近年来,随着社会的发展,对化学分析检测技术的和要求越来越 高,在高准确度临床检测、食品安全、标准物质研制、环境监测和国际比 对中,同位素稀释质谱法以其独特的优点,被越来越广泛的使用。 本文开展了冷冻人血清尿酸成分分析标准物质的研制,应用高效液相 色谱同位素稀释/质谱法对血清尿酸标准物质进行定值。按照国家一级标 准物质技术规范的要求,对冷冻人血清尿酸标准物质进行了均匀性检验、 稳定性监测和不确定度评价,结果证明该标准物质均匀性良好,年的稳 定性监测结果表明,该标准物质符合国家一级标准物质研制技术要求。该 标准物质的研制填补了国内与国际该项空白,完善了临床尿酸检测溯源的 参考系统。该标准物质可为临床检验、医学、营养学、卫生检验检疫等方 面的测量和研究工作提供技术支撑和量值溯源保障。 建立了气相色谱同位素稀释/质谱法测定奶粉中尿素含量的方法,以 ,尿素标记物为内标,对奶粉及液态奶中尿素进行了检测。讨论 了样品前处理过程,衍生化反应的温度和时问,以及色谱质谱测定条件。 方法的精密度较好, 回收率在.%. %之间。在 /~/的浓度范围内该方法的线性良好。该方法作为一种高北京化大学硕士研 究生毕业论文 准确度的检测方法,为乳制品行业的食品安全和质量保证提供了有力的技 术支持。 :同位素稀释质谱法,标准物质,血清,尿酸,奶粉,尿素,液相 关键字 色谱,气相色谱 北京化丁人学硕:研究生毕业论文?‘ ? ’ ? 一 ??? , . , , ,. /. , , .. ? . ,, . 北京化工大学硕士研究生毕业论文/ ,.,,. .% . / / %,..:/, ,, , ,,, 北京化工大学位论文原创性声明 本人郑重声明: 所呈交的学位论文,是本人在导师的指导下,独立 进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外,本论文不含 任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重 要贡献的个人和集体,均己在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声 明的法律结果由本人承担。 日期: :盘竺盏 作者签名 关于论文使用授权的 学位论文作者完全了解北京化工大学有关保留和使用学位论文的 规定,即:研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属北京 化工大学。学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件 和磁盘,允许学位论文被查阅和借阅;学校可以公布学位论文的全部 或部分内容,可以允许采用影印、缩印或其它复制手段保存、汇编学 位论文。 保密论文注释:本学位论文属于保密范围,在?年解密后适用本授 权书。非保密论文注释:本学位论文不属于保密范围,适用本授权书。 作者签名: 日期:丝兰: :圣 导师签名: 聋兰北京化大学硕’研究生毕业论文 第一章前言 .同位素稀释质谱法的特点 ..同位素稀释质谱 同位素稀释质谱法是唯一一种微量、痕量和超痕量元素权威测量的方法。因为 可以通过天平称重和同位素丰度比的质谱测量,将化学成分分析转化为同位素丰 度的质谱测量。因此,兼顾两种方法的优势,具有绝对测量性质,灵敏度高,方法准 确,测量的动态范围宽,样品制备不需要严格定量分离,测量值能够直接溯源到国际 基本单位制的物质量基本单位一摩尔。 年国际物质量咨询委员会在巴黎召开的第六次会议,将同位素稀释 质谱法、精密库仑、电位滴定、凝固点下降法和重量法定位于具有绝对测量性质的方 法。一些发达国家的计量实验室如美国、英国和国际上相关的权威组织 如、、等实验室充分运用上述优势,开展在化学计量中 的应用研究,用所建立的方法为基准或标准物质定值,开展临床医学、环境、食品安 全等样品的痕量元素测量,进行稳定同位素示踪,参加国际比对和国际合作研究。目 前在国际上公认的血清一级标准方法只有同位素稀释法。 ..同位素稀释质谱法的特点 同位素稀释质谱法具有以下特剧】: 、具有绝对测量性质 由同位素稀释质谱法的基本原理可知,是通过三种样品,即稀释剂浓缩同 位素、被测样品和混合样品同位素丰度测定和所加稀释剂的准确称量,借助公式计 算,最终给出被测量样品旱某元素或某同位素标记化合物的浓度或绝对值,单位通常 用/或/表示。在实验程序运作过程中,测量的仅仅是样品中同位素或同位 素标记化合物的摩尔离子数之比,而不是浓度,因此,很少受到各种物理、化学因素 的干扰,即使存在干扰,对同一元素也会以相同的几率贡献给两个同位素的丰度,最 终对同位素丰度比的测量影响将相互抵消。因此,不需要使用参考标准对仪器进行刻 度或校正,同位素丰度比的测量值本身就能代表着样品中两个同位素的原子个数之 比。同时被测量元素中同位素的核质量,目前已有精确数点后?位有效数字的北京化人学硕:研究生毕业论文 国际标准值,它的误差对最终测量值不确定度的贡献可以忽略。稀释剂溶液的浓度, 可用精密库仑直接标定,或用进行反标定。标定值的不确定度一般在.%左右。 混合样品的配制通过精密天平称重计量:称重用的砝码按照国家法定的检定规程校 准;称重误差完全能够估算。由此可见,实验环节的每一步骤不确定度都可以估 算和表达。最后通过误差传递,用每个分量平方和的不方计算和给出总不确定度。 、化学制样无需严格定量分离 在实验过程中,一旦稀释剂和被测物混合,达到化学平衡,在避免外来同位素污 染的情况下,同位素的丰度比例既已恒定。混合后的样品在进行元素分离、浓缩、转 移、样品前处理和样品装载的操作过程中,即使发生丢失,也不会改变同位素组成, 避免了由此带来的测量误差。的这种优势,使样品前处理操作程序相对简捷易行, 是其它仪器分析方法所无法比拟的。 、灵敏度高 待测元素赖以存在的基体种类, 灵敏度取决于待测元素的化学、物理特性, 还和色谱进样方式、样品利用率,色谱分离有关,同时也取决于质谱仪器的整体性能。 由于质谱仪器的高分辨率及高灵敏度的优势,使得同位素稀释质谱法的绝对灵敏度大 大提高。 、动态范围宽 广义上的动态范围,包括使用多种类型质谱仪器;可以测量气态、液态和固态三 种样品形式;能够获取元素周期表中将近%无机元素部分有机态金属元素和有机标 记化合物的信息;欲测量的动态范围在??之间,高达个量级;具有单元素和多 元素分析能力。 、测量值的溯源性 溯源性是计量学的基本属性,它使计量基、标准器、计量或测量基、标准方 法或计量结果通过连续的比较链,以给定的不确定度,与国家或国际的基、标 准装置, 基、标准方法或基、标准物质密切相关连,来表示计量装置、计量方法和计量结果的 可比性和可靠性。量值的溯源性主要通过下列因素来体现: 建立在坚实的理论基础上,以严格的数学表达式为依据; 实验程序清楚、明了,随机误差小,主要系统误差完全可以量化估算和消 除; 的基本计算表达准确、严谨,计算的结果,直接溯源到物质量的基本单位 ; 摩尔 与其它微量或痕量元素测量方法相比,给出的测量值具有最高的计量特性, 不确定度能够准确量化。 北京化工人学硕研究生毕业论文 ..有机同位素稀释质谱法及其应用 同位素稀释法是利用质谱丰度来定量求得样品中某一同位素或一种元素的原子 数目或含量的方法。该方法的基本原理为:把一个已知丰度和重量的同位素稀释 并加入样品中均匀混合,测定样品混合前后丰度变化。有机同位素稀释质谱法采用具 有相同分子结构的稳定同位素,等标记的化合物作为内标,这种内标物的物理、 化学性质与被分析的目标化合物最为接近,可以消除样品在化学和物理的前处理步骤 中所引起的回收率差异。这种特性与质谱的高灵敏度和处理复杂样品的能力结合起 来,使得同位素稀释质谱技术被公认为是一种测量微量及痕量有机物的基准方法。 世纪年代被用于有机化合物的测定。 随着社会的发展,对检测技术的标准和要求越来越高,在高准确度临床检测、食 品安全、环境监测、开展国际比对、标准物质研制中,同位素稀释质谱法成为了一种 痕量、超痕量的标准参考方法。近年来,该方法以其独特的优点被越来越广泛的使用。 等人【】以氘代的烯二酮,标记的一烯二酮、睾丸激素为稳定的同位素 ,对人血浆中的烯二酮、一烯二酮和睾丸激素进行了同时准确定量分内标物 析。此 一烯二 方法灵敏度高,准确度高,可应用为临床评价烯二酮转化成一烯二酮, 酮转化成睾丸激素的参考方法;等人【】以.肌酐为内标物对尿液中的肌酐进 行检测,检测离子分别为/ 、和/、,该方法的线性范围是. /,检测限是. 上,是一种快速,灵敏度高,选择性强的临床检测方法; 等利用液相色谱同位素稀释质谱法对烘烤栗子中的丙烯酰胺的浓度及其时间 对其形成的影响进行了研究,该方法也适用于暑片等烘烤食品中的丙烯酰胺检测【。 中国计量科学院参加的多项国际比对项目中,都采用了同位素稀释质谱法【一】,而且比 对的成绩非常好。年参加的“.冰冻混合人血清中氢化可的松含量的测 定国际比对中,所测定的结果与美国的结果相差仅万分之二。 .冰冻混合人血清尿酸标准物质研制的意义 ..标准物质 ...标准物质的定义 根据指南一引,标准物质及有证标准物质的定义如下:北京化人学硕研究生毕业论文 标准物质 ,具有一种或多种足够均匀和很好确定了的 特性值,用以校准测量装置,评价测量方法或给材料赋值的材料或物质。 ,卜附有证书的标准物质,其 有证标准物质 一种或多种特性值用建立了溯源性的程序确定,使之可溯源到准确复现的表示该特性 值的测量单位,证书上给出的每个特性值都附有给定置信水平的不确定度‘。 ...标准物质的特征 标准物质是以特性量值的均匀性、稳定性和准确性为其主要特征【】。标准物质的 均匀性是标准物质最基本的属性,它是用来描述标准物质特性空间分布特征的。标准 物质的稳定性是指在规定的时间间隔和环境条件下,标准物质的特征量值保持在规定 范围内的性质,规定的时间间隔越长,表明该标准物质的稳定性越好。标准物质的准 确性是指标准物质具有准确计量和严格定义的标准值。当用计量方法确定标准值时, 标准值是被鉴定特性量之真值的最佳估计,标准值与真实值的偏差不超过计量不确定 度。化学分析实验室常用的标准物质一般有基准物质、一级和二级基准物质掣。 ...标准物质的作用 标准物质具有在时间上保存量值,在空间上溯源量值的功能,它与早已被人们所 认识的物理计量标准一样,赋予各种测量结果的溯源性,用于各种测量的质量控制与 质量评价,保证不同时间与空间测量结果的一致性与可比性,统一不同测量手段、不 同测量方法的测试结果,从而达到量值的统一,确保实验室问测量的可比性,这一作 用在实验室认可和能力验证中都得到充分体现【 。标准物质研制的过程就是赋予标 准物质准确量值溯源性的过程。我国对标准物质的研制与法制管理是标准物质量值溯 源性的保证,也是建立国家化学成分量溯源体系的基础,从而才能保证全国的量值统 一【】 作为分析测量的“量具’’,标准物质在检定和校准测量仪器,评价分析测量方法, 确定材料特性量值和考核操作人员的技术水平,以及生产过程中的质量控制等方面起 着不可缺少的重要作用。标准物质作为现代计量科学的一个重要分支和标准化技术的 一个组成部分,经历了从简单到复杂、由不成熟到成熟、不断创新,不断开拓 新的技 术领域的漫长历程。目前标准物质已在化学测量、生物测量、工程测量与物理测量领 域扮演重要角色,在促进测量技术发展,保证测量结果的可靠性和有效性,保证国家 之间、部门之间、商品交换或技术交流之间分析结果的可比性和一致性方面发挥了巨 大的作用,从而在国际贸易、环境保护、人民健康和安全等方面获得了巨大的经济效 益和社会效型?。 标准物质与分析测试技术是密不可分的。现代分析测试技术已经从经典的、单一 北京化工大学硕’:研究生毕业论文 的、简单基体的测试,逐渐演化为现代分析仪器为主的、多组分、痕量、复杂基体测 试,分析测试的难度和复杂程度大幅度增加。例如在临床分析中,血清中的胆固醇的 测试是采用酶转换法【 ,这种方法受试剂和基体的影响非常大,不同批次的试剂、血 清放置的时问、温度都会使测定结果产生偏差,根据卫生部门年的调查,北京、 天津、上海三市所医院实验室间分析测试血清中总胆固醇含量的相对标准偏差达 .%..%,个别实验室的偏差超过%。考虑到血清中胆固醇测量的不确定因素, 产生这样的偏差是难免的。卫生部老年医学研究所为此研制了血清中胆固醇 标准物 质,在使用了标准物质并统一了试剂后,这些实验室间的相对标准偏差显著下降为. %..%。又如,我国开展纳米材料的研究已经较长时间了,但研究成果一直没能很 好地应用推广,主要原因是纳米材料颗粒测试问没有解决,产品质量不能保证。由 于没有纳米颗粒的标准物质检验测试方法, 测试结果无法满足实际要求。 痕量分随着高纯材料、环境科学、食品卫生、 临床分析与资源的深度开发,析技 术也有很大的发展,而痕量分析技术的发展又依赖于痕量组分标准物质。由于分析实 验室采用痕量组分标准物质,大大提高了分析结果的可靠性。目前大量国外临床检验 用分析仪器进入我国,由于缺乏相应的标准物质,许多检验数据都缺乏可比性。如同 一肝炎患者在两家不同医院化验转氨酶,往往得到相差甚远的结果,这是由于没有统 一的量值准确可靠的转氨酶以及各家医院的转氨酶活力量值的不一致所造成的。因 此,研制一系列蛋白质标准物质和非蛋白氮、葡萄糖等标准物质在临床生化领域就显 得十分必要。 ...标准物质的分级【】 标准物质一般分为一级标准物质和二级标准物质。一级标准物质主要用来标 定比 它低一级的标准物质或者用来检定高准确度的计量仪器或用于评定和研究标准方法 或在高准确度要求的关键场合下应用。二级标准物质或工作标准物质一般是为了满足 本单位的需要和社会一般要求的标准物质,作为工作标准直接使用,作为现场方法的 研究和评价、日常实验室内质量保证、以及不同实验之间的质量保证,即用来评定日 常分析操作的测量不确定度。 标准物质技术要求【】 ... 根据.国家一级标准物质技术规范的要求:候选物应满足适用性、代 表性,以及容易复制的原则。候选物的均匀性、稳定性以及特定特性量的量值范围应 适合该标准物质的用途。对于分装成的最小包装单元的标准物质必须进行均匀性检 验,同时抽取的单元数目对样品的总体要求要有足够的代表性,抽取的单元数取决于 总体样品的单元数和对样品均匀程度的了解。标准物质应在规定的贮存或使用条件 下,定期地进行待定特性量值的稳定性检验。稳定性检验的时问间隔可以按照先密后北京化人学硕研究生毕业论文 疏的原则安排。一级标准物质的有效期应在年以上或达到国际上具有先进水平同类 标准物质的有效期限。对于标准物质的定值有三种方式,即高准确度的绝对 或权威测 量方法定值;两种以上不同原理的已知准确度的可靠方法定值;多个实验室合作定值。 每次测量的结果要利用统计学的检验方法对其检验。标准物质的不确定度由三部分组 成,第一部分是通过测量数据的标准偏差、测量次数所要求的置信水平按统计方法计 算出;第二部分是通过对测量影响因素的分析,估计出其大小第三部分是物质不均 匀性在有效期内的变动性所引起的误差。 血清尿酸 .. ...血清尿素及其临床意义 . 尿酸,,羟基嘌呤,简称分子式为。,。。, 。它是一种白 色结晶性物质,极难溶于水、难溶于酸,也难溶于醚和乙醇。具有弱碱性,可以与强酸 成盐。尿酸在生物体内以盐的形式存在,因而溶解度较高。 图尿酸. 尿酸是一种内源性抗氧化剂,主要由细胞代谢分解的核酸和其它嘌呤类化合物以 及食物中的嘌呤经酶的作用分解而来。由于尿酸在人体内浓度高,作为内源性的抗氧 化剂,尿酸能与自由基反应,在血浆中其所发挥的抗氧化能力约占血浆各种成分抗氧 化能力的/,此外尿酸又是损伤的修复剂【】,从而对多发性硬化的病变起抑 制作用。 血液中的尿酸全部从。肾小球滤过,滤过的尿酸%在近曲小管初始阶段被重吸收, %重吸收的尿酸在近曲小管中段又被分泌到肾小管腔内,在近曲小管直段又有% %被分泌后重吸收,最后只有%一%尿酸随尿排出,大约/经肠道,/从尿中 排泄。人体内尿酸异常是人体疾病的反映,可以反映出嘌呤代谢有关的一些疾病【。 尿酸的含量是临床中最常测量的量。血清尿酸含量测定在痛风、急性脑血管病、 北京化工大学硕:研究生毕业论文 心力衰竭疾病、肾脏疾病和糖尿病诊断方面有重要的意义【。】,所以把血清中尿酸的 定量测定作为临床检测的一个重要指标。此外,血尿酸测定也与白血病【】、冠心病、 肺心病和肝硬化的诊断和观察具有一定的意义。可见,血尿酸含量测定越来越多的应 用于临床之中,为临床诊断和观察疾病提供了可靠的依据,并对临床起到了极其重要 的作用【。 ...血清中尿酸标准物质的临床作用 使用量值准确、可溯源的血清生化标准物质不但可以改进临床分析测量的质量, 提高测量准确度,最大程度地保证测量结果的有效性,同时可利用测量结果为临床诊 断和疾病观察提供可靠和坚实的支撑。在检验医学实现自动化的今天,检测质量控制 已提高到标准化、规范化、法制化的高度。各实验室需要实现不同分析系统之间检验 结果的一致性和准确可靠性问题,因此必须建立测量的参考系统。参考系统包括高准 确测量方法和标准物质。其中标准物质是实现临床检测结果可靠和可比的关键。只有 实现了检验结果的可靠和可比,才能适应医疗的改革和发展,真正做到为临床服务, 为患者服由于尿酸的检测和务。尿酸是血中主要非蛋白氮类代谢产物之一, 分析对临 床诊断,了解病情进展,有重要参考价值。开展临床生化指标尿酸系列标准物质的研 制,可以确保国家溯源体系的完整和有效,保证国家测量能力,为我国重要检验领域 的测量量值有效性提供重要保障。 ...血清中尿酸的常规检测与定值方法 简便快速地测定尿酸在临床上具有重要意义。目前,测定尿酸的方法主要有酶法、 伏安法、流动注射法、毛细管电泳法【 、液相色谱法和同位素稀释质谱法等,下面 介绍几种常用的检测方法。 ....酶法 世纪年代酶试剂用于临床生化测定,年代得到了较大发展,也同趋成熟 和完善。从动力学角度对使用的酶试剂分类,可分为单酶法和酶偶联法。目前临床上 常用检测尿酸的方法是单酶法,其基本原理是通过单一的酶促反应后利用各种方法直 接测定底物或产物的浓度来求得待测物含量。反应利用磷酸盐作为缓冲体系,在一定 温度下反应一定时间,观察吸光度值,通过计算可以得到尿酸的浓度值【.。此法虽 然操作简单,但是操作过程太复杂。在此基础上提出了一种利用固相酶技术制作的一 种尿酸传感器检测方法,并且此方法逐渐被尿酸传感器检测方法取代【】。 ....伏安、法 和等人把基于研究电流一电压曲线特性,通过测量电流一电压曲 北京化人学硕研究生毕、论文 线进行分析的方法统称为“伏安法”。伏安法是目常用的检测尿酸的方法,近年来, 伏安法检测尿酸在理论研究和实际运用于临床诊断上都取得了很大的发展。伏安法检 测尿酸常用的方法有以下几种: 微电极差示脉冲伏安法【 在电极表面修饰一层化学物质分子,赋予电极以特定的性质,能有效地降低某 些氧化原物质的过电位,从而达到分离或同时测定的目的。目前,微电极差示脉冲伏 安法常用的是聚甘氨酸修饰碳纤维微电极差示脉冲伏安法,利用碳纤维微电 极 经过特定的电化学方法活化,活化后的表面修饰一层聚甘氨酸膜,该膜电极对 尿酸有近可逆的响应,借助于差示脉冲伏安法技术,它检测尿酸的灵敏度达 ~. 一/,检测线性范围为. 。/。该方法测定结果 准确,可望用于在线检测,但应用不是十分广泛。 吸附溶出伏安法【】 此法是一种高灵敏度,有一定选择性的电分析方法,是测定尿酸的新方法。实验 方法足在电解池中加入.缓冲液.和适量的尿酸溶液,定溶后 通氮气除氧气,插入三电极系统,选择合适的富集时间,在...范围内 用溶出伏安仪记录其伏安曲线,可用于尿酸及血浆中的尿酸分析。此方法的线性范围 为.。~.~/,检出限量为.×/,该法抗干扰能力强,操作简 便,样品处理简单,易于推广。 ....高效液相色谱法 . 该方法是较常用、较基本的尿酸检测方法,所用流动相简单,分离效果较好,操 作简便、快速。等人【】采用反相液相色谱测定血清中的尿酸。色谱条件:. 反相柱,流动相为/的乙酸胺与 /的甲醇混合溶液,.,方法 的回收率为.%,检测限./,达到很好的效果。但缺点是常常需要麻烦费 时的样品预处理或使用复杂的柱切换设备,等人【】采用柱切换技术检测血清中的 尿酸,他们运用了种不同的柱子连接后对样品进行分离和定值。 ....高效毛细管区带电泳技术测定尿酸 近年来,研究了应用高效毛细管区带电泳技术【】测定尿酸的新方法,尿液经过样 品处理后,在毛细管区带电泳条件下测定,就可得到受试者的尿酸分析结果。 等人采用.未涂层硅毛细管柱,将硼酸钠作为缓冲体系,,紫外 检测波长为,得到很好的重现性。此法用于尿酸的测定,无需进行特殊的样品 预处理,可直接进行定量分析。该方法操作简单,重现性好,分析速度快,样品用量 少,一般用于血清中尿酸的常规检测,特别适用于临床检验。 同位素稀释质谱法【】测定尿酸 .... 气相色谱/同位素稀释质谱 等【】提出将,】尿酸标记物加入血清样品中,室温下充分混合北京化工人学顾:研究生毕业论文 ,用离子交换色谱进行净化,用乙酸将尿酸沈提出来,?氮气吹干,将残留 物用甲基氨溶解,再次吹干。用~甲基三甲硅烷基三氟乙酰胺进行三甲基硅烷化 衍生,掣采用四甲基硅烷与进行衍生,最后用气相色谱/质谱联用 技术进行检测,并根据同位素稀释的原理计算出血清中尿酸的含量。 等【】采用摩尔比为.的与, 】尿酸的混合溶液作标记物, 平衡后的混合液经过阴离子交换色谱树脂柱,最后用的乙酸洗提尿酸。用一 甲基三甲硅烷基三氟乙酰胺进行衍生。质谱测定尿酸含量。同位素的比值变化很 小时也可以很快地测出尿酸含量,且方法的精确度很高。采用不同的色谱条件和不同 的电离技术测量同一种物质时,整个过程没有严重的偏差。 液相色谱/同位素稀释质谱 在./分析中,需要采用样品预处理手段,包括净化、离子交换、衍生化 等等。因此样品的前处理过程比较复杂、费时、且成本高。而研究开发的./ 方法样品前处理比较简单,一般只需要沉淀蛋白和过滤,然后直接可以利用液相色谱 柱将尿酸进行分离和定量【 。血清测定尿酸的影响因素很多,要使各实验室分析结果 具有横向和纵向的可比性,需要做到测定标准化。开展尿酸标准化的常用模式是先建 立可靠的参考系统作准确性基础,再通过一定手段将准确性转移到常规分析中【。 等人研究建立的方法【,填补了这方面的空白。通过研究同位素稀释法测定尿酸, 可以对不同实验室分析结果进行比对,并可以使我国与国际接轨,参与国际参考实验 室的分析结果比对,迅速提高我国的疾病防治水平【。 .奶粉中尿素含量检测方法研究的意义 ..尿素 尿素又称脲,是一种由碳、氮、氧和氢组成的有机化合物,其化学式为 。结构式如图。摩尔质量. /,熔点.?分解,密度./。 外观为白色晶体或粉末。 叫八呲 图尿素 . 尿素在肝内合成,是哺乳动物体内蛋白质分解代谢的最终产物,可自由地从肾小 北京化人学硕研究牛毕业论文 球滤出,%.%在肾小管的基部髓质部被动性地被重吸收。血中尿素浓度随饮 食中的蛋白质含量成正比例地改变,组织分解中蛋白代谢率和肝功能状态成比例地改 变。尿素是一种内源性的代谢产物,所以它存在于哺乳动物的血清、尿液、汗液、组 织、乳汁中。因此也有少量存在于牛奶中。牛奶中尿素的下常值为./】。 现在食品生产的奶粉多采用高温闪蒸技术,奶粉种的尿素含量约为原料乳的.倍。 在工业上,尿素可以大量作为三聚氰胺、脲醛树酯、水合阱、四环素、苯巴比妥、 咖啡因、味精等多种产品的生产原料 ..奶粉中尿素检测的意义 目前市售的奶粉中掺假现象时有发生,其中向牛奶奶粉中加入尿素等含氮物以提 高蛋白质的检测值是常用手段之一,掺尿素的牛奶不但影响成品奶的口感和味道,而 且还会损害消费者的身体健康,甚至出现中毒现象。年月,在震惊全国的三鹿 毒奶粉事件发生后,有关部门对全国的乳品行业进行了抽样检测,检测结果再次震惊 ,同时也为我们敲响了食品安全的警钟。因此牛奶及奶粉中尿素的检测国人 就成为奶 制品质量监测和食品安全的一项重要内容。 ..尿素的检测方法 ...二乙酰肟法 二乙酰肟反应是唯一的直接化学分析尿素的方法图.。最先观察 乙酰肟可与几种伯、仲胺反应。二乙酰肟不直接有尿素反应,而首先水解形成二乙酰 和羟铵,二乙酰与尿素在酸性溶液中缩合,形成一种黄颜色的二嗪产物。在监 测颜色变化。这种色素在也能监测其荧光变化。有几种化学物质可提高和稳定 直接的如氨基硫脲、铁离子或葡萄糖醛酸二乙酰肟生成的颜色产物的变化, 内酯 或间接的排除最初水解中形成函数的羟胺硫酸钾类化合物】。 北京化大学顾:研究生毕业论文一一....:兰? ,?一.。上譬 ?十 ,..., 一 一??二二? 图二乙酰肟法 , ...酶解一水杨酸盐光度法 这种新的检测方法以刀豆粉提取液作脲酶催化尿素水解产生氨,氨在碱性条件下 由亚硝基铁氰化钠催化,与次氯酸盐和水杨酸作用,生成绿色化合物,可比色测定【】, 该方法具有灵敏度高,重现性好等优点。反应如图?所示。 脲酶 ,: , ,,一, , ‘, 形磷旌 际硒卜 : 图.酶解.水杨酸盐光度法 . ? 毛细管电泳/电化学法 ... 毛细管电泳法与安培检测方法联用,对电活性物质具有较高的灵敏度和 选择性。胡盛华等人首次利用毛细管区带电泳和电化学检测法/测定了人体唾 液中的尿素含量【】。研究表明,在氢氧化钠碱性溶液中,尿素在铜电极上具有良好的 圳一马?北京化入学硕研究生毕业论文 响应,其灵敏度足以用于唾液中尿素含量的测定。同时,生物样品在该碱性体系中对 毛细管壁的吸附现象得到了很好的抑制。 ...气相色谱/质谱法 近年来结合分离系统的质谱方法被应用到临床药物及其新陈代谢研究中。气相色 谱质谱联用可在尿素的定性及定量分析中提供极高专一性和灵敏度 ’。等 【】以.尿素为内标,从血清中分离出尿素,将其衍生后在毛细管气相色谱上 分离, 质谱仪上测量标记与未标记的尿素衍生物的离子。此方法精密度高,无测量干扰。由 于此方法有足够的准确度与精密度,其可作为参考方法。 ..液相色谱/大气压电离质谱法 气相色谱质诺法中尿素需要经过复杂的衍生化反应才能适合气相色谱分析。大气 压化学电离源质谱被认为是高效液相色谱分析的很有力的检测器, 大气压电离质谱法在尿素直并已用于生物活性物质的定量分析。液相色谱/ 接定性及定 量分析中比气相色谱质谱法的样品前处理简单。】建立了一个简单快速测定 尿素的液相色谱/大气压电离质谱..方法。 .研究的目标及内容 ..血清标物的研究 ...研究目标 本项目跟踪国际化学计量、临床化学溯源性研究的发展和先进分析技术的发展, 应当前国内临床检验标准物质市场的需求,在前期高准确度分析方法的研究基础上, 利用先进的分析仪器和良好的实验条件,用已经建立的高准确度测量方法一高效液相 色谱/同位素稀释质谱测量人血清中尿酸成分量的方法,研制冰冻人血清中尿酸成分 分析标准物质,使其成为高水平的、满足科研和社会需求的标准物质,同时为临床、 生化、医疗、环境等方面的标准物质研制提供灵敏、准确的高准确度分析方 法和技术。 ...研究内容 选择合适的血清标准物质的制备方法,同时使制备的血清具有典型代表性 研究适合于高效液相色谱一同位素稀释质谱分析的血清样品的『处理方法。 在前期研究工作的基础上,研究高效液相色谱一同位素稀释质谱测量血清样 品中 北京化大学侦研究生毕业论义 尿酸的高准确度分析方法。 合作定值研究 研制支冷冻人血清中尿酸成分分析国家级标准物质。 ...研究 、尿酸浓度合适、均匀性和稳定性良好的血清制备技术。 、选择液相色谱一同位素稀释质谱法/和/或气相色谱一同位素稀释 质谱法?/等对血清各组分进行定值;两家或以上权威实验室进行联合 定值。 、血清中尿酸均匀性检验 、血清中尿酸稳定性考察 、定值数据的统计处理和不确定度分析 项目实施的技术路线:北京化人学颀:研究生毕论文 ..气相色谱同位素稀释质谱测定奶粉尿素含量的研究 ...研究的目标 本课题针对国家食品安全应急分析的需求,通过研究和建立高准确度的气相 色谱 同位素稀释/质谱法测定奶粉及牛奶中尿素含量的分析方法,为食品安全检 测提供技术 保证,同时为建立奶粉中尿素检测的参考方法和奶粉基体标准物质的研制提供技术支 持。 北京化大学硕.研究生毕业论文 ...研究的内容 奶粉样品的前处理及衍生化条件的优化。 气相色谱同位素稀释/质谱法测定尿素方法的建立。 对该方法进行精密度、回收率实验。 应用该方法对不同品牌奶粉抽样检测。北京化工人学坝研究生毕论文 质谱法研制冰冻混合人血清尿酸 第二章液相色谱同位素稀释/ 标准物质 本课题利用液相色谱同位素稀释/质谱法,采用单点法校正,根据国家一级标准 物质技术规范要求,对冰冻人血清尿酸标准物质进行了定值、均匀性、稳定性考察, 不确定度评价。 .仪器及试剂 ..实验仪器 美国; 液相色谱一质谱联用仪:,公司, 液相色谱一质谱联用仪://,公司,美国; 天平: ;.,塞多利斯公司,德国; 天平: .,.梅特勒,德国; 漩涡振荡器: ,日本; 氮气吹干装置:.,八方世纪公司,中国; 离心机:.,北京医用离心机厂,中国; 公司, 芬兰; 移液器:、, 安瓿瓶:、山东力诺集团有限责任公司,中国; 离心机:公司,美国; 滤膜:,美国; :,美国; 滤器 搅拌器:上海司乐仪器厂,中国; :上海康华医疗器械厂,中国; 分装器 火焰封口机:河南太古机械厂,中国。 ..实验试剂 甲醇:高效液相色谱级,公司,美国; 乙腈:高效液相色谱级,公司,美国; 北京化人学硕:研究生毕业论文 高纯三次水:,.,美国; 乙酸铵:分析纯, .,美国; 血清样品:冰冻混合人血清军事医学科学院野战输血研究所提供 尿酸标记物:,,纯度.%,剑桥同位素实验室,英国; 尿酸纯品标准物质:,纯度.%,不确定度为.%,国家标准物质 研究中心; 苯息丁:分析纯,北京市东环联合化工厂,中国; 冰醋酸、、.北京市化工厂、分析纯,中国; 庆大霉素:,美国。 .血清样品采集 健康人血清标准物质是用于校准测量器具及评价测量方法并在医药卫生、科 学研 究、临床检验等方面作为测量标准,能准确测定血清人及动物中有关量值的 物质。 根据国标/.,制备了“健康人血清有机成分标准物质”。 “健康人血 清有机成分标准物质”制备流程图如图.。 北京化人学硕研究生毕业论文 具有采供血资质单位的确定与洽商 军事医学科学院 供血健康人个体的确定 临床初检 上 血液采集与初检 按国家规定进行 土 血样复检按国家规定进行 合格的血液血液的处理、血清的分离与检验 理化学检验 向幻蛋白测定 微生物学检验 \ // 合格血清的冻存、混合 杂质去除、除菌分 装 图人血清有机成分标准物质制备流程图 . 北京化大学硕:研究生毕业论文 ..血液的采集与检验 对献血者进行血型及项指标艾滋、梅毒、乙肝、丙肝、转氨酶检测。初检 合格者,采集血液收集到真空三联袋内不含任何添加剂或抗凝剂并留取备检样品 进行复检。详细记录每份样品的初检和复检结果,汇集成表格并加盖检验单位公章和 相关人员签名。 ..血清分离、混合、净化和分装 再在?放置?小时以保证血液充 血液采集后在室温或?放置小时后, 分凝固。剔除溶血或乳糜血。血清分离采用低温大容量血液离心机,/, ,离心次,小心将血清移入另一不含任何添加剂或抗凝剂的采血袋分钟 中,.? 分别保存,以备血清混合和后续工艺。 将预定数量的合乎要求的血清融化混合,放入相应体积容器如大立瓶,此 容器应按照严格程序进行清洗和灭菌除热原,混合时间不少于分钟以保证充分混 匀。其中,加入%的/硫酸庆大霉素作为抗菌剂。 将混匀后的血清无菌转入已经处理的离心瓶,在高速冷冻离心机,/, ?离心分钟,以去除纤维蛋白等固形物质,放入混合容器。小心收集离心上清液, 必要时可进行再离心以保证完全清除纤维蛋白。 除菌过滤和分装在百级分装间进行,严格按血液生物制品的除菌分装程序操作。 混合后的血清经.“.滤膜过滤至大立瓶,大立瓶放在搅拌器上进行搅拌, 以防止血清上下分层造成不均匀。分装采用自动分装器,准确分装./安瓿, 为防 止封口时出现污点,分装器前应添加针头。封口采用火焰封口机。封口后应检查每个 安瓿的完整性、有无污点。检查合格的安瓿,应在小时内冻存于.?冰箱中。 .样品的前处理 ..标准溶液配制 精确称取一定质量的尿酸标准纯品溶于一定体积的氨水溶液中浓度的计 算应考虑标准品的纯度,配制成尿酸标准溶液。精确称取一定质量的氮尿酸标记 物纯品溶于一定体积的氨水溶液中,配制成尿酸标记物标准溶液,于冰箱中一 ?下冷藏。 北京化人学硕研究生毕、论文 ..校准比值混合溶液配制 根据血清样品中尿酸的大致浓度常规方法测定,用移液器取一定体积的尿酸 标准溶液,按标准溶液中尿酸的含量与标记溶液中尿酸标记物含量的比值接近/, 加入一定体积的尿酸标记物标准溶液。称量,记录读数。混匀、充分平衡。 ..血清样品制备 待血清样品室温平衡后,称取一定质量的血清,称取前轻摇混匀且于下层吸取防 止吸入气泡。根据血清样品中尿酸的大致浓度常规方法测定,向样品中加入一定体 积的氮标记的尿酸标记物溶液,使加入的尿酸标记物含量与血清中尿酸含量的比 值接近/,称量,记录读数,振荡混匀。 称量好的血清样品在室温下平衡一个小时,加入一定体积乙腈试剂血清与乙 腈 体积比为/,沉淀蛋白质,混合均匀,离心后取上层清液,过.的滤膜,滤 液在室温下氮气吹干。氨水复溶后进行//分析。 .样品定值方法 本研究中尿酸含量采用高效液相色谱一同位素稀释质谱法定值,中国计量科 学研 ,多家单位进行验证,同时采用高效液相色谱法进行旁证。 究院独家定值 ..液相色谱条件 : 色谱柱 色谱柱. ..,.; 流动相:%水/醋酸胺,.%乙腈; 流速:./; 进样量:; 色谱柱温度:。 色谱柱 ..,; .色谱柱. 流动相:%水/醋酸胺,..%腈; 流速:./ 分流:; 北京化人学硕:研究生毕业论文 进样量:: 色谱柱温度:。。 ..质谱条件 一级/条件: 离子极性:负离子模式; 喷雾电压:.; 毛细管温度:?; 毛细管电压:..: 圆筒透镜电压:..: 选择离子扫描:/和/。 二级//条件: :负离子模式; 质谱条件 离子源:; :; 干燥器温度 干燥器流量:/; 雾化器压力:: 毛细管电压:; 多重反应监测检测条件:如表. ..结果计算 样品中尿酸与标记尿酸的浓度比和响应峰面积比符合校准曲线的线性关系, 血清 中尿酸的质量浓度可按单点法,由公式.计算 北京化人学顾研究牛毕业沦文 内标法计算样品中待测物质尿酸含量公式: 协?, 惫×篆× 乙: 每克样品中所含的相应待测组分的质量浓度/ 爪?: 仪器测得的样品中待测组分与相应标记物的峰面积比 “: 仪器测得的标准溶液中待测组分与相应标记物的峰面积比 朋:样品中标记物的质量曲 :标准溶液中标记物的质量 :标准溶液中各待测组分的质量? :样品质量 :标准物质的纯度 利用内标法计算实际血清样品中尿酸含量的公式如.:丝×耸丝只 /彳: 彳 . :血清中尿酸的含量?/ 以:仪器测得的血清样品中尿酸峰面积 以:仪器测得的血清中尿酸标记物峰面积 月:仪器测得的标准溶液中尿酸峰面积 :仪器测得的标准溶液中尿酸标记物峰面积 朋:血清样品中尿酸标记物的质量 :标准溶液中的尿酸标记物的质量 :标准溶液中尿酸的质量 。:血清样品的质量 :尿素标准物质的纯度 .结果与讨论 ..定值方法 本课题采用高效液相色谱同位素稀释质谱法作为定值方法。国内外已有很多 关于 液相色谱法测定血清尿酸的研究报道,对于液相色谱条件,以及血清样品的前处理过 程,在文献【删中已经进行了讨论和条件优化实验,本文主要采用了该文献液相色谱和 样品前处理的方法,在此不做详细的讨论。本课题根据不同原理的质谱仪器的差异和北京化学硕研究生毕论立 状忐做了质谱条件优化,对定值方法进行了验证考察 质谱条件优化 . 正离子、负离子模式的选择 分别试验正离子和负离子模式下尿酸和标记尿酸混合溶液经过色谱分离后在质 谱中监测情况.采用全扫描/,~,质谱囤如图和: ?‘??巾恻四? 一一一一一??。一魁&』繁?一。 图正离子模式下尿酸和标记屎酸的全扫质谱圈.耻‘ 】 ‘ ; 砷 。 叭. 蓍??~ ?????:??????々::::?::?:::?。 围盘离子模式下尿酸和标记尿醴的垒扫质谱围 . 从以上谱图可以看出,在负离了模式下,尿酸和标记尿酸容易失去个而形成 分子离子【?.即/和/。而『离子模式下,没有得到明显的尿酸分子 离子和标记尿酸分子离于。由此可知,尿酸容易在负离子模式下离子化,所以选择负 离子模式。 .选择离子扫描模式确定 从图可以看出,/和/分别是屎酸和标记尿酸的分子离子峰,其北京化人学硬十究生毕业论文 ,可以作为一级质谱监测离子,对血清屎酸进行定量。为了充分发挥三响应高 重四极 杆质谱仪器特点,更好地进行定性和定量,本实验同时进行了二级质谱的研究。对母 离子进行二次打碎,得到子离子/和/,如图。 日 州?一’?’‘ 矗 , 。一 ?”?等。?嚣。。:”“ 图“尿酸和标记屎酸的缓质语图柚 培.// 在一级质谱中,采用模式,/和/为定量离子;在二级质谱中, 采用多重反应监测模式,/、和/、为定量离子对。 对于质谱定量更为准确。 ... 选择 和 在一级质谱扫描中为了达到最大响应,提高灵敏度,需要寻找最优碎裂电压 ,在相同的条件下,通过改变碎裂电压来优化,如图: ’ \ \ / ?一?::一: 圈?不同碎裂电压下色谱质谱峰的响应圈 %塞些三苎兰壁:墅墨生些堡苎 见表?: 上图中不同碎裂电压下的色谱峰面积也不同,表不同碎裂电压对应峰面积 继丝继坐丛墅堕哑& 螋 堕 垫 垡巴坚坚 盟 塑 些耍塑 垫? ? 丝塑 从表的数据得到最优碎裂电压参数为。当确定了碎裂电压,在进行二级 打碎时所需最佳碰撞能量的优化,如图是在多重反应监测下,改变碰撞 能量所得到的色谱.质谱图。 圈不同碰撞能量下色谱.质谱峰的响应图 ./ 不同碰撞能量下的色谱蜂面积也不同,见表 表不同碰撞能量对应峰面积 曼坐三坌璧塑堡壁坐业坚强 望 业曼 ? 鲤 垡 坚 坚耍塑鲤 鲤? 通过以上优化过程,得到最佳的一级碎裂电压和二耋碰撞能量参数分别为, 。在上述优化好的色谱质谱条件下得到尿酸标准品和血清样品的色谱圈,如 图北京化。凡学哦:,注毕论土 图 ? ? ? ? ? ? ? ? 图校准溶液/谱图 醵/ 北廓化犬学醺士研究生毕业论文 ?? ‘, ? ? ? ” 。二』?&&?等南?』&?』 ”。”。一 。一。“。 :? 圈加标的血精样品蜊谱田 ? 虹. ..样品检颡与结果计算 样品分析顺序按:标准一样品?标准一样品一标准的顺序进行,采用单点校准法 】计算样品中屎酸的浓度。所有样品平行钡定次。每次都对标准品重新分析,取多 次测量的平均值进行计算。测量的结果计算采用内标法。 ...方法的精密度与重复性 称取血清三份,其中一份作为基准,另外两份添加不同浓度的尿酸标准溶液,充 分平衡后进行样品前处理,测定结果见表。由于尿酸是内源性代谢物,加标样品 的浓度是基准血清与添加标准的浓度和。由表的数据可以充分证明此方法具有较 好回收率和重复性。北京化人学硕研究生毕业论文 表?加标尿酸的回收率 璺垒竺兰墨 坚 ?堡坚坚坚苎竺璺翌墼型巴 样品 添加值 理论值 实测值 回收率 堡型鳘 巴型曼 堡型曼 墅. 丝 . . . . . . . . . . . . 为考察方法的精密度和重复性,做如下实验设计:取两个样品,每个样品均匀分 成三份进行平行处理,处理后的每个样品重复进样次,测试的结果如表.所示。 表血清尿酸.精密度和重复性实验结果 :量 堡 翌苎翌堕曼巳竺塑翌堡坚 竺璺 垒翌 竺巴 苎垒竺 ??????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????一?????????????????????????????????????????????。?。。。。。。。。。。。。。。。。。一 样品 批次 平均值 标准偏差 总平均值 总标准偏 总 % 著 % 批内 ? ?‘? ? ? ?,‘? ? ??????, ..样品的定值结果 中国计量科学研究院采用方法测量血清中尿酸浓度时,随机抽取本项 目研制的人血清标准物质支,进行样品的前处理和质谱测量,该标准物质的标准值 为个测量值的平均值。 为了检测实际样品,先进行尿酸浓度的初步测量,然后根据测定的浓度值使 配制 的标准溶液浓度尽量接近样品中尿酸的浓度值。样品的分析顺序按“标准一 样品一标 准一样品一标准顺序进行,以便使用单点法计算样品中尿酸的浓度。两次检 测结果 的变异系数应该小于%,否则需要重新测试。所有样品都需检测次以上,每次 都 北京化人学顾研彳‘生毕业论文 取多次测量的平均值进行计算。 对标准样品重新分析, ...中国计量科学研究院的定值结果 中国计量科学研究院的定值结果如表所示 表中国计量科学研究院血清尿酸的定值结果 序号 定值结果 序号 定值结果 平均值 翌型塞曼 墅 里型垦曼 苎 坐型笙曼 厶 . . . . 孓 . . 舡 . . . . . . . . . . . . 孓 . . . . . ?,????? . . 总平均值 / 总的标准偏差 . / 总的相对标准 . 偏差% ...血清尿酸多家合作定值结果 样品的定值方法:本项目中尿酸含量均采用高效液相色谱~同位素稀释质谱法定 ,同时采用高效液相色谱法进行了旁证。 值 每家参与合作定值的单位,都随机抽取本项目研制的人血清标准物质支,其中 一支作为练习样品,其它支样品每支分为个子样独立的进行前处理,每个处理后 的子样重复测定三次。采用了柯克伦检验无异常值,说明四家单位所采用的方法是等 精度的。其次,采用狄克逊准则对家的个平均值进行统计检验无异常值,说明没 有界外值见表.,因此该标准物质中尿酸的标准值为上述多家合作定值的结果,北京化人学硕研究乍毕业论文 总的平均值作为最终的测定结果。参与合作定值的单位分别为:中国计量科学研究院化学分析所:高效液相色谱一同位素稀释质谱法 ? 中国医学科学院药物研究所:高效液相色谱一同位素稀释质谱法中国人民解放军总医院:高效液相色谱一同位素稀释串联质谱法中国检验检疫科学研究院:高效液相色谱一同位素稀释串联质谱法 表?血清中尿酸含量的多家合作定值结果/ 注:为每组实验测每次数;为实验测鼙纽数 ..均匀性检验 均匀性是标准物质最基本的属性之一,是标准物质制备过程中的关键一环。它是 指物质的一种或几种特性具有相同组分或相同结构的空间分布的表征。为了检验样品 是否均匀,通常随机抽取一定数量的样品,采用精密度高的试验方法,对抽取的样品 北京化丁人学硕.究生毕业论文 在同样的实验条件下进行测定,从而使样品间的差异完全由样品本身的不均匀性反映 出来。本项目研制的人血清尿酸标准物质均匀性检验中,采用高效液相色谱一同位素 稀释质谱法进行定值。 ...样品的选取 ?的要求: 根据国家一级标准物质技术规范 检测项目:血清中尿酸的含量 检测数目:血清标准物质是液体,应属于均匀性良好的样品;当总体单元数小于 时,抽取单元数不少于个。本工作共制备了血