中华稻蝗对重金属镉的解毒机制研究（论文资料）

中华稻蝗对重金属镉的解毒机制研究（论文资料） 中华稻蝗对重金属镉的解毒机制研究 【摘要】:镉(Cadmium,Cd)是一种毒性极强的金属元素,能对人体健康造成不良影响。在农业生态环境中,镉可通过农作物的吸收在食物链各环节间转移和累积,对生物体正常的生理生化代谢产生严重影响,同时镉污染还加剧了农业生态环境的恶化,最终影响到人类的身体健康。昆虫是自然界中分布最广泛的动物类群,极易受到重金属等环境因子的胁迫。已有大量研究表明,环境中的镉可通过呼吸、表皮渗透和摄食等途径进入昆虫体内。而在镉胁迫对昆虫的生长发育和生理机能产生影响的同时,昆虫也发展了各种防御或解毒机制来减少过量重金属的危害,维持机体内环境的稳定。植食性昆虫中华稻蝗Oxyachinensis是一种重要的农业害虫,主要以禾本科植物为食。当中华稻蝗取食被镉污染的农作物或其它杂草时,环境中的镉便会通过食物链在其消化道等部位累积。本文以中华稻蝗为实验材料,从生化水平和分子水平对重金属镉的解毒机理进行了深入系统的研究。全文共分为五部分:一、为研究重金属在中华稻蝗自然种群体内的累积分布,以山西省代县水稻田中华稻蝗为研究对象,用火焰原子吸收法测定中华稻蝗不同组织部位的镉和铬含量。研究结果表明:镉和铬在中华稻蝗自然种群不同组织部位的富集量不同,且雌雄间存在差异。镉在雌虫体内的富集顺序为:中肠后肠前肠翅头卵巢足体壁;在雄虫体内为中肠前肠后肠足头体壁。镉在雌雄中华稻蝗消化道内均有较高的富集,其中中肠的累积量最高,且与其它组织部位存在显著差异。中华稻蝗 雌虫各组织部位对铬的累积浓度依次为中肠足体壁头卵巢前肠翅后肠,中华稻蝗雄虫体内铬浓度的分布依次为足体壁中肠头前肠精巢后肠。多因素方差分析结果表明,自然条件下雌雄中华稻蝗对重金属镉和铬的累积具有组织特异性,且两种重金属在中华稻蝗体内的累积规律有所不同。二、为了研究重金属镉在植食性昆虫中的累积和排泄规律,本文通过镉慢性染毒的方法,用不同浓度镉溶液培养的麦苗饲喂中华稻蝗,研究了食物镉染毒对中华稻蝗形态特征的影响,采用原子吸收法测定不同龄期虫体(2龄到成虫)整虫、粪便和蜕中的镉蓄积量。研究结果表明,高浓度镉对中华稻蝗的生长有显著的抑制作用。整虫镉蓄积规律为:对照组不同龄期中华稻蝗的镉累积量较低,且各龄期间不存在统计学上的显著差异;处理组同一发育阶段,镉蓄积浓度以剂量依赖的方式增加,随着中华稻蝗的生长发育(从若虫到成虫),镉累积浓度呈现先增加然后缓慢降低的规律。粪便中的镉蓄积规律为:对照组4龄若虫粪便中的镉蓄积量最高,其它龄期粪便中镉含量无显著差异;处理组在同一发育阶段,镉在中华稻蝗粪便中的累积量随着麦苗中镉含量的增加而增加,且各处理间存在显著差异。蜕中的镉蓄积为:对照组2龄若虫蜕中的镉蓄积量最高,与其它龄期相比差异显著;处理组随着麦苗中镉浓度的增加,蜕中镉蓄积量显著增加,且各处理间差异显著。相关性分析表明,中华稻蝗虫体、粪便和蜕中的镉蓄积量与食物镉含量呈现显著的正相关关系。通过对不同发育阶段中华稻蝗对镉的蓄积和排泄规律研究,表明中华稻蝗取食染镉麦苗后,可以通过粪便和蜕皮排出部分镉,减轻镉对中华稻蝗虫体的毒性作用,但不同龄期 中华稻蝗对镉的蓄积和排泄能力有所差异。三、谷胱甘肽S-转移酶(GlutathioneS-transferases,GST)和羧酸酯酶(Carboxylesterase,CarE)是昆虫体内重要的解毒酶系,在内源性和外源性化合物的解毒过程中发挥着重要作用。本文通过食物镉慢性染毒研究了镉对不同发育阶段的中华稻蝗GST和CarE活性的影响。研究结果表明,不同发育期的中华稻蝗GST和CarE活性差异显著,表明GST和CarE在中华稻蝗正常的生理代谢过程中发挥着重要作用;镉胁迫对中华稻蝗若虫GST活性有诱导作用,表明GST可能参与若虫对镉的解毒过程,而由于发育阶段生理代谢的差异,成虫GST活性被镉抑制。镉浓度、发育阶段和酶作用底物显著影响中华稻蝗CarE活性。以a-NA为作用底物的测定结果显示,镉对2龄和5龄若虫CarE活性具有显著的诱导效应,而对其它龄期中华稻蝗CarE活性的无明显的诱导效应。以β-NA为作用底物的测定结果显示,2龄若虫和3龄若虫CarE活性在镉胁迫下差异显著。而4龄若虫、5龄若虫和成虫的CarE活性在镉胁迫下无显著差异。两种底物测定结果对比发现,中华稻蝗CarE的活性以a-NA为底物测定的活性大于以p-NA为底物时的活性。本研究结果显示虽然GST和CarE可以作为环境镉污染的监测指标,但在研究GST和CarE对镉的解毒机理方面,虫体的发育阶段及酶作用底物等都是需要充分考虑的因素。四、金属硫蛋白(Meatllothionein,MT)能被重金属等多种因素诱导。当生物体受到镉胁迫时,可通过增加MT的表达以抵御重金属的危害。为了系统研究镉胁迫下中华稻蝗不同组织和不同发育阶段MT的表达和镉蓄积状况,本研究通过食物镉慢性染毒和急性镉注 射方法,研究了镉对中华稻蝗MT的诱导效应,并采用RT-PCR技术进行中华稻蝗MT基因片段的克隆。研究结果表明,MT在中华稻蝗不同组织的表达水平具有明显的组织特异性和剂量依赖性,其中中肠的镉含量和MT表达水平最高;对照组不同发育阶段中华稻蝗MT表达水平差异显著,其表达顺序依次为5龄3龄和成虫4龄和2龄;而在同一发育阶段,MT的表达水平与镉蓄积浓度具有显著的正相关关系;镉急性注射未能诱导MT的表达。这一结果表明中华稻蝗MT可以作为环境镉污染监测的生物标志物。五、昆虫能通过合成热休克蛋白(Heatshockproteins,Hsps)来适应外界压力。Hsps作为分子标记应用于生态毒理学研究较传统的生物学指标更为敏感。本文通过RT-PCR和RACE-PCR技术从中华稻蝗克隆获得四个hsps基因的cDNA全长序列,分别为葡萄糖调节蛋白(OcGrp78)、热休克蛋白70(Ochsp70)、热休克蛋白90(Ochsp90)和热休克蛋白40(Ochsp40)。本文采用Real-timePCR方法了这四种热休克蛋白基因在中华稻蝗不同组织部位和不同发育阶段的表达。结果表明,中华稻蝗Hsps基因的表达具组织特异性和发育阶段特异性,表明Hsps家族在中华稻蝗的发育过程中起着重要的生物学作用。镉诱导实验结果表明,急性镉暴露能诱导OcGrp78、Ochsp70、Ochsp90和Ochsp40基因的表达,且这四种hsps基因在镉急性诱导下的表达模式基本相同:即在短时间(6h)内表达量达最大值,12h时表达量已开始明显下调,48h时降至对照水平或低于对照水平;就诱导效率而言,Ochsp70的诱导效率最高,是对急性镉胁迫最敏感的hsps基因。镉慢性染毒结果显示,OcGrp78、Ochsp70、 Ochsp90和Ochsp40的表达模式明显不同:食物镉慢性染毒能引起OcGrp78、Ochsp90和Ochsp40基因表达不同程度的上调,而长期取食被镉污染的食物则显著抑制了Ochsp70基因的表达。根据本文研究结果,建议可将OcGrp78、Ochsp70、Ochsp90和Ochsp40作为环境镉急性污染的分子标记,其中Ochsp70对镉胁迫最为敏感。而OcGrp78、Ochsp70、Ochsp90和Ochsp40是否可以作为镉慢性污染的分子标记还有待深入研究。综上所述,环境中的重金属镉可以通过食物链在中华稻蝗体内蓄积于不同的组织部位。重金属在中华稻蝗体内的过量累积对中华稻蝗的形态特征(体长、体重等)有抑制作用。中华稻蝗可通过体内重要酶系、金属硫蛋白和热休克蛋白等的作用对机体形成保护作用。本研究为将中华稻蝗作为农业环境中重金属镉污染的生物标志物提供基础资料。【关键词】:中华稻蝗镉解毒酶金属硫蛋白热休克蛋白 【学位授予单位】:山西大学 【学位级别】:博士 【学位授予年份】:2012 【分类号】:X174 【目录】:中文摘要12-15ABSTRACT15-19第一章前言19-331.1镉概述19-221.1.1镉的理化性质191.1.2镉污染概况19-201.1.3镉的毒性作用机理20-221.2昆虫对镉的解毒机制22-241.2.1昆虫对过量镉的储存231.2.2昆虫对镉的排泄调控231.2.3抗氧化系统的作用23-241.2.4金属结合蛋白的解毒241.3金属硫蛋白概述24-281.3.1金 属硫蛋白的理化性质25-261.3.2金属硫蛋白的分类261.3.3金属硫蛋白的生理功能26-271.3.4昆虫金属硫蛋白的研究概况27-281.4热休克蛋白概述28-311.4.1热休克蛋白的分类28-291.4.2热休克蛋白的生物学功能29-301.4.3昆虫热休克蛋白的研究概况30-311.5本论文的研究内容及意义31-33第二章重金属镉和铬在中华稻蝗体内的组织分布33-402.1材料与方法33-342.1.1样本的采集33-342.1.2样本的处理342.1.3重金属含量测定342.1.4统计分析342.2结果34-372.2.1土壤样本和水稻样本镉含量34-352.2.2镉在中华稻蝗体内的累积分布35-362.2.3铬在中华稻蝗体内的累积分布362.2.4镉和铬累积的多因素方差分析36-372.3讨论37-402.3.1镉在中华稻蝗体内的组织分布37-382.3.2铬在中华稻蝗体内的组织分布38-392.3.3镉、铬的联合作用39-40第三章中华稻蝗对重金属镉的累积和排泄40-493.1材料与方法41-423.1.1麦苗染毒413.1.2中华稻蝗染毒处理413.1.3样本的收集413.1.4形态特征测量413.1.5镉含量的测定41-423.1.6数据处理423.2结果42-463.2.1麦苗中的镉蓄积423.2.2镉对中华稻蝗形态特征的影响423.2.3中华稻蝗体内的镉蓄积42-443.2.4中华稻蝗粪便中的镉蓄积443.2.5中华稻蝗蜕中的镉蓄积44-453.2.6中华稻蝗镉蓄积与麦苗镉含量的相关性45-463.3讨论46-49第四章镉对中华稻蝗谷胱甘肽S-转移酶和羧酸酯酶活性影响49-624.1材料和方法49-514.1.1主要仪器和试剂49-504.1.2镉慢性染毒504.1.3酶液提取504.1.4酶活测定50-514.1.5数据处理514.2结果51-594.2.1镉在麦苗中的累积51-524.2.2谷胱甘肽S-转移酶活性变化52-534.2.3羧酸酯酶活性变化 53-584.2.4多因素方差分析58-594.3讨论59-62第五章镉诱导中华稻蝗金属硫蛋白表达及镉蓄积研究62-755.1材料与方法62-655.1.1实验材料625.1.2主要试剂和仪器62-635.1.3镉慢性染毒635.1.4镉急性染毒635.1.5镉浓度的测定635.1.6MT含量测定63-645.1.7MT基因cDNA全长的克隆64-655.1.8数据分析655.2结果65-715.2.1中华稻蝗不同组织部位的镉蓄积665.2.2中华稻蝗不同组织部位的MT表达66-675.2.3中华稻蝗不同组织部位镉蓄积与MT表达的相关性675.2.4中华稻蝗不同发育阶段的镉蓄积675.2.5中华稻蝗不同发育阶段的MT表达67-695.2.6中华稻蝗不同发育阶段镉蓄积和MT表达的相关性695.2.7镉急性诱导中华稻蝗MT的表达695.2.8中华稻蝗MT基因cDNA片段的克隆69-715.3讨论71-755.3.1镉浓度的选择715.3.2中华稻蝗不同组织部位的镉蓄积和MT表达71-725.3.3中华稻蝗不同发育阶段的镉蓄积和MT表达72-735.3.4镉急性诱导中华稻蝗MT表达735.3.5中华稻蝗MT基因克隆结果分析73-745.3.6MT与环境镉污染监测74-75第六章中华稻蝗热休克蛋白基因cDNA全长克隆及镉胁迫条件下的表达75-956.1材料与方法75-806.1.1主要仪器和试剂75-766.1.2实验材料766.1.3PCR引物766.1.4总RNA提取和第一链cDNA合成766.1.5中华稻蝗hsps基因cDNA片段的克隆76-786.1.65’和3’末端基因序列的扩增78-796.1.7序列分析796.1.8中华稻蝗hsps基因的定量分析79-806.2结果80-906.2.1中华稻蝗hsps基因的全长序列分析80-866.2.2中华稻蝗hsps基因的组织特异性表达86-876.2.3中华稻蝗hsps基因在不同发育阶段的特异性表达 87-886.2.4急性镉诱导中华稻蝗hsps基因的表达88-896.2.5慢性镉诱导中华稻蝗hsps基因的表达89-906.3讨论90-956.3.1中华稻蝗hsps基因的序列分析90-916.3.2中华稻蝗hsps基因组织和发育阶段的特异表达91-926.3.3镉诱导中华稻蝗hsps基因的表达92-946.3.4中华稻蝗hsps基因作为环境镉污染的分子标记94-95第七章结论95-97参考文献97-118攻读学位期间取得的研究成果118-120致谢120-121个人简况及联系方式121-123 本论文购买请联系页眉网站。