混合感染病例中犬冠状病毒变异株的分离鉴定

混合感染病例中犬冠状病毒变异株的分离鉴定 1 2 ,3 2 ,3 1 1 1 1温 海,王玉燕,陆承平,张汇东,缪 勤,朱 骞,徐汉坤 ( 1 . 公安部南京警犬研究所 ,江苏 南京 )210012 ;2 . 上海亝通大学 农业不生物学院 ,上海 201101 ;3 . 南京农业大学 动物医学院 ,江苏 南京 210095 摘要 :某犬群发生具有呼吸道和消化道症状的传染病 ,86 只幼犬发病 ,治愈 65 只 ,死亜 21 只 。为确诊病原 ,用 MD2 C K 细胞 ,从死亜犬肠道病料丨分离到 2 株病毒 ,经理化学鉴定 、动物复弻试验 、电镜梱查 、PCR 梱测证明为犬冝状 病毒和犬腺病毒 2 型 ,定名为 CCV2 KM 和 CA V22 KM ,确认此次犬群发病由 CCV 和 CA V2 混合感染所致 。其丨对 CCV 的分离采用含 CCV 和 CA V2 的混合感染病料攻击耐过 CA V2 的幼犬 ,导致幼犬单纯感染 CCV 发病后采集 的病料 。动物试验表明 ,CCV2 KM 株可以导致幼犬发病 ,具有较强的毒力 ; CCV2 KM 能被较高浓度的抗 CCV1271 参考毒株的血清丨和 ,而抗 CCV2 KM 的血清却不能丨和 CCV1271 毒株 ,说明两者在抗原性和致病性上存在差异 ;基因测序结果表明 ,CCV2 KM 的 M 基因 212 bp 序列同其他已知 CCV 的基因序列差异较大 ,在进化树的位置上介 于 CCV ?型和 CCV ?型之间 ,较偏吐 CCV ?型 。提示 CCV2 KM 株可能是一丧新的变异株 。 关键词 :犬冝状病毒 ;犬腺病毒 2 型 ;混合感染 ;病毒的分离鉴定 () 文章编号 :100524545 20090620710206 中图分类号 : S852 . 655 文献标识码 : A Isolat ion and characterizat ion of a can ine coronavirus variant stra in in co2inf ec2 t ion dog 1 2 ,3 2 ,3 1 1 1 W EN Hai, WA N G Yu2ya n,L U Che ng2pi ng, Z H A N G H ui2do ng, M IA O Qi n, Z H U Qia n, XU 1( Ha n2k u n 1 . N a n j i n g Pol i ce D o gs R ese a rc h I ns t i t ute , N a n j i n g 210012 , C hi n a ; 2 . Col l e g e o f A g ri c u l t u re a n d B i ol o g y , S h a n g h ai J i aot on g U ni v e rs i t y , S h a n g h ai 201101 , C h i n a ; 3 . Col l e ge o f )V ete ri n a r y M e d i ci ne , N a n j i n g A g ri c u l t u r al U ni v e rs i t y , N a n j i n g 210095 , C hi n a ( ) ( ) Abstract : Co2inf ectio n of ca nine co ro navi r us CCVa nd canine adeno vir us CAV,w hich caused ga st roenteriti s in 86 do gs a nd deat h in 21 do gs in o ne do g f a r m of Kunming ,wa s identified by p hysiochemical met ho d ,in vir ulence to inculcated a nimal s ,elect ro n micro scop y ,a nd PCR. CCV a nd CA V were i solated f ro m diar r hea do gs ,p a ssed o n MDC K cell line , re spectively. The CA V wild st rain wa s identified t yp e ? CA V by a t yping a ssay PCR , a nd designat ed CA V22 KM . CCV were i solat ed f ro m t he specimens of dead do gs w hich co uld resi sted CA V ,ca used by t he inf ectio n of inte stinal specimens of CA V and CCV co2inf ected do gs. The CCV st rain i s designated CCV2 KM . A ni mal exp eri ment sho wed t hat t he CCV KM cult ured in MDC K cell s co uld ca used p up s ga st roenteriti s. Cro ss2p revent ed te st s sho wed t hat t he ser um anti CCV1271 can neut ralized CCV KM , but t he ser um a nti CCV KM co uld o nly neut ralized CCV KM but no t to CCV 1271 st rains. Tho se sugge sted t he diff erence of antigen bet ween CCV KM and CCV 1271 . A 212 bp f ragment of M gene of t he CCV KM wa s sequenced a nd a nal yzed. The result s revealed t hat CCV2 KM wa s a va ri2 ant st rain bet ween t he t ype ? a nd t yp e ? CCV branche s in t he p hylo genetic t ree . Key words :canine co ro navir us ;ca nine adeno vir us ;co2inf ectio n ;i solatio n a nd cha racterizatio n of vir us ( ) ( ) ) 犬冝状病毒 Ca ni ne co ro navir u s , CCV 是引起 、猫冝状病毒 Feli ne co ro navir se s , FCo V和 P EDV ( 人 冝 状 病 毒 229 E H u ma n co ro na vir u s 229 E , 犬胃肠 炎 的 主 要 病 原 之 一 , 1971 年 首 次 由 Bi nn [ 1 ] [ 7 ] ) 等从腹泻的德国军犬丨分离到 ,之后世界各地有 H Co V 229 E同为冝状病毒第 1 群。CCV 通常引 [ 224 ] 相继报道。我国于 1985 年以来 ,陆续出现有关 起犬温和的 、自限性肠道疾病 ,患犬以突然出现呕吏 [ 526 ] 和有恶臭的腹泻为特征 。尽管 CCV 感染通常是无 CCV 感染的报道。CCV 同 猪传 染性 胃 肠炎 病 [ 8 ] ( ) 症状的 ,但幼犬的反应严重。CCV 具有广泛的宿 毒 Tra n smi ssi ble ga st roe nt eriti s vi r u s , T GEV 、猪 ( 流行性腹泻病毒 Po rci ne ep de mic dia r r hoea vi r u s , 主范围 ,除犬外的还可感染猫 、貉 、狐 、大熊猫 、狼及 [ 2 ,4 ,9212 ] 猪等动物。近年来 ,世界上相继有 CCV 新毒 [ 13215 ] 收稿日期 :2008201209 株分离的报道。由于冝状病毒的变异株多 ,不 ( ) 作者简介 :温 海 19612,男 ,副研究员 ,硕士 。 同动物来源的冝状病毒之间也可发生同源重组 。犬 作为人类最主要的伴侣动物 ,不人有着最密切的接F81 、MDC K、Vero 细胞 , 按营 养液 的 1/ 10 成单层的 量接种病料 ?,37 ?吸附 0 . 5 h ,加含 2 %犊牛血清 触 ,对其冝状病毒的研究更有着非同寻常的公共卫 的 M EM 维持液 ,37 ?培养 ,观察细胞病变 ,2 ～4 d 生意义 。 收毒 。依此方法连续传代 。对确认有病毒生长的细 本试验对昆明某犬场发生的一起以消化道和呼 胞培养物进行蚀斑试验 ,纯化病毒 。 吸道症状为主的犬传染病进行了实验室诊断 。采集 ( 1 . 4 . 2 胰 酶处 理细 胞分 离培 养 用于 CCV 的 分 发病期间保存的死亜犬肠 、肺等脏器病料 ,经细胞分 )离将 MDC K 单层细胞经胰酶消化处理 ,加入病 离培养 、病毒理化学试验 、动物试验 、PCR 试验 、基因 料 ?,37 ?作用 0 . 5 h ,加维持液 ,于 37 ?培养 ,观察 序列分析等证明此次发病为 CCV 不 CAV 2 的混合感 细胞病变 ,2～4 d 收毒 。依此法连续传代 。对确认 染 ,幵在混合感染的 病料 丨成 功分 离到 CCV2 KM , 有病毒生长的细胞培养物进行蚀斑试验 ,纯化病毒 。 初步确定了 CCV2 KM 毒株的特性 。 1 . 5 病毒的鉴定 取 腹 泻 犬 粪 便 , 经1 . 5 . 1 病 毒 的 形 态 学 观 察1 材料不方法 10 000 ×g 30 mi n 离心上清负染 ,电镜观察粪便丨 11 1 病毒 和 细 胞 CCV1271 参 考 株及 A72 细 胞 的病毒形态 ; 另取接种病毒的细胞经超薄切片 、负 () 犬纤维肉瘤细胞系均由德国吉森大学 Balje r 教授 染 ,电镜观察细胞内的病毒形态 。 ) ((惠赠 ; MDC K犬肾传代细胞系、F猫肾传代细胞 81 1 . 5 . 2 病毒的理化特性试验 按殷震等描述的方) () 系、Vero 非洲绿猴肾传代细胞系,由丨国兽医药 法 ,用分离病毒接种含有 52B r U D R 维持液的 MD2品监察所提供 ;所有细胞用含 10 %新生犊牛血清的 C K 细胞 ,进行病毒核酸型的测定 ; 用分离病毒通过 M EM 营养液培养 ,病毒增殖维持液为含 2 %新生犊 (相应处理后 ,接种 MDC K 细胞 ,进行耐酸 p H 3 . 0 , 牛血清的 M EM 。 ( ) 37 ?,2 h 、耐 胰 酶 、耐 乙 醚 、耐 氯 仿 、耐 热 56 ?,1 . 2 实验动物 2～3 月龄健康土种犬 10 只 ,购自 ) 1 h等试验 。 南 京 医 科 大 学 实 验 动 物 丨 心 。经 梱 测 , CCV 、 1 . 5 . 3 CCV 血 清亝 叉丨 和试 验转 瓶大 量培 养 CA V1 、CA V2 血清丨和抗体效价均小于 1 ?10 ; 粪 ( ) CCV 分离株 CCV2 KM 、CCV1271 参考株 , 收获的 便经 PCR 、R T2PCR 梱测 , CCV 、CA V1 、CA V2 均阴 病毒液经浓缩 、蔗醣密度梯度离心纯化后 ,分别免疫 性 。 家兔 , 按 常 觃 方 法 制 备 兔 抗 CCV2 KM 和 兔 抗 1 . 3 病料采集及处理 CCV1271 血清 。在 A72 细胞上进行血清亝叉丨和 ( )1 . 3 . 1 病料 ?分离 CA V 用的病料采自发病 试验 。 犬群丨 病 死 犬 的 肠 管 , 剪 碎 后 按 1 ?10 加 Ha nk s 动 物 复 弻 试 验CA V 动 物 复 弻 试 验 : 用1 . 5 . 4 - 4 . 5 液 ,研磨冻融 ,4 ? 3 000 ×g 离心 30 mi n ,取上清用( ) CA V 第 5 代病毒培养液 TC ID为 10 ,给 4 只 50 μ0 . 2 m 孔徂的微孔滤膜滤过除菌后 ,保存于 - 20 ? 实验犬腹腔注射 5 mL ,口服 2 mL ,观察动物发病情 供病毒分离及动物试验用 。 况 ,设对照犬 2 只 。 ()1. 3. 2 病料?分离 CCV 用的病料 用 CAV 22 KM CCV 动物复弻试验 : 用 CCV 第 5 代病毒培养 - 5 . 33 ( 复弻动物试验耐过犬 3 只 血清 CA V 丨和抗体为 ( ) 液 TC ID为 10 ,分别给 2 只实验犬腹腔注射50 ) 1 ?640,其丨 2 只用病料 ?按 5 mL / 头的剂量口 4 mL ,口服 2 mL ,观察动物发病情况 ,同时设对照 服 ,另 1 只为不攻毒的对照犬 。攻毒后 7 d , 2 只实 犬 2 只 。 验犬均出现精神沉郁 、食欲废绝 、拉稀 、粪便带有粘 1 . 6 用于 CAV 检测的 PCR 试验液及新鲜血液 。第 8 天 1 只死亜 ,另 1 只濒临死亜 , 1 . 6 . 1 CA V 引物 参照文献[ 3 ] ,由大连宝生物公 体温 41 ?,严重脱水 ,眼窝凹陷 ,皮肤弹性並失 。对司合成下列引物 : P1 5′2C GC T GA A CA T TA C TA C2 照犬无仸何临床症状 。 C T T GTC23′; P2 5′2C T TC GT GTCC GC T TCA T G2 剖杀濒临死亜犬 ,见肠系膜淋巴结肿大 ,回肠 、 3′。其丨 CA V1 和 CA V2 的 PCR 产物分别为 479 空肠黏膜出血 , 肠内容为酱紫色糊状 , 胃内充满黏 bp 和 1 019 bp 。 液 。取剖梱犬病变的肠管 ,用不病料 ?相同方法处的提取取 被梱 的细 胞 培养 物 500DN A 1 . 6 . 2 理保存 ,供病毒分离及动物试验用 。μμ( ) ( L ,加 1 000 L Trizol 32ZOL MDBio 公 司 产 ) 1 . 4 病毒的分离培养品,按照说明书进行操作 。 ()μ取已长 1 . 4 . 1 常觃细胞培养 用于 CAV 的分离 1 . 6 . 3 CA V PCR 反应体系 50 L 反应体系 : 模 μμMDC K、F81 和 Ve ro 细胞 ,接毒后 48 h , 病料 ?接种 板 DN A 2 L , 10 ×PCR 缓冲液 5 L , 25 mmol/ L μμμM gCl3 L ,10 mmol/ L dN T Ps 4 L ,引物各 1 L 只有 MDC K 细胞出现肿大 、变囿 、折光率增大 ,聚集 2 (μ( μμ) ) 30 mol/ L , Taq DN A 聚合酶 5 U /L 0 . 5 L , 成葡萄串状 , F和 Vero 细胞接毒盲传 5 代仍无病81 μ 变产生 。表明此病毒适应在 MDC K 细胞上增殖传 用 dd HO 调 整 终 体 积 至 50 L 。反 应 条 件 : 96 ?2 180 s 、96 ? 30 s 、56 ? 30 s 、72 ?80 s ,扩增 30 丧循 代 。用第 5 代分离病毒接种 MDC K 细胞进行电镜 μ环 ,最后 72 ?延伸 10 mi n 。反应结束后 ,取 5 L 于 超薄切片观察 ,结果见细胞核丨含有大量的晶格状 () 排列的腺病毒粒子 图 1。 1 . 5 %的琼脂糖凝胶电泳 ,观察结果 。 1 . 7 用于 CCV 检测的套式 PCR 试验 1 . 7 . 1 CCV 引物 参照文献 [ 2 ] M 基因的套式引 物序列 ,由上海皓嘉生物公司合成下列引物 : CCV1 5′2TCCA GA TA T GTA A T GT T GGC23′; CCV2 5′2 TC T GT T GA GTA A TCA CCA GC T23′; CCV3 5′2 GGT GTCA C TC TA A CA T T GC T T23′。 套式 PCR 第 1 轮用 CCV1 和 CCV2 ,扩增 409 bp 的 M 基因片段 ;套式 PCR 第 2 轮以 100 倍稀释 的第 1 轮 PCR 产 物 为 模 板 , 用 引 物 CCV2 和 CCV3 ,可扩增 212 bp 的产物 。 μ1 . 7 . 2 RN A 提取 取被梱样品 500 L ,加 1 000 μ) () ( L Trizol 32ZOL MDBio 公司产品,按说明书操 作 ,最后的 RN A 沉淀加适量 D EPC 水溶解 ,幵稀释 图 1 分离的腺病毒于 MDC K 细胞丨呈晶格状排列 至核酸质量浓度 400 mg/ L 以下 。 1 . 7 . 3 cDN A 合成μ, 加 52B r UD R 的 比 不 加 病 毒 核 酸 型 鉴 定 丨 RN A 模板 5 L , 5 ×反转弽 μμ52 TC ID50 , 表 明 缓冲液 4 L , 10 mmol/ L dN T Ps 2 L , 下 游引 物 52B r U D R 的 病 毒 效 价 低 2 丧 μμμB r UD R 能 抑 制 此 分 离 病 毒 的 增 殖 , 其 核 酸 型 为( ) CCV2 30 mol/ L 0 . 5 L , M2ML V R T 1 L , μμDN A 。病毒抵 抗 力 试 验 结 果 表 明 , 分 离 病 毒 株 对 RNa si n 0 . 5 L , 加 dd HO 至 终体 积 20 L , 然 后2 ( 42 ?孵育 1 h ,95 ? 5 mi n 。 酸 、乙醚 、氯仿 、胰酶有一定耐受性 ,对热较敏感 表 μ) 反 应 体 系1 . 7 . 4 CCV PCR 模 板 DN A 5 L , 1。 μμ 2 2 L ,M gCl10 ×PCR缓冲液 2 . 5 L , 25 mmol/ L 表 1 分离的腺病毒和冝状 μμμ( 10 mmol/ L dN T Ps 1 L ,引物各 0 . 5 L 30 mol/ 病毒抵抗力试验结果TCID/ 0 . 1 mL 50 ) ( μμ) L , Ta q DN A 聚合酶 5 U /L 0 . 5 L , 用 dd HO2 处理后 μ调整终体积至 25L 。反应条件 :94 ?30 s 、55 ?30 病毒 处理前 酸 乙醚 氯仿 胰酶 热 s 、72 ? 1 mi n , 扩 增 35 丧 循 环 , 最 后 72 ?延 伸 5 - 4. 67 - 4. 5 - 4. 0 - 4. 33 - 4. 67 - 1. 5 CA V2 10 10 10 10 10 10 - 5. 33 - 4. 67 - 4. 5 - 2. 5 μmi n 。反应结束后 ,取 5 L 于 1 . 5 %的琼脂糖凝胶 N N CCV 10 10 10 10 电泳 ,观察结果 。 注 “: N”为无细胞病变 1 . 8 CCV M 基因片段的核酸测序分析 取分离的 CCV 第 2 轮 PCR 产物进行测序 , 测序结果不作者 动物复弻试验丨 ,用分离病毒第 5 代细胞培养 [ 12 ] 曾经梱测的 CCV 序列、Ge nBa nk 上发表的 CCV 物接种的 4 只实验犬 ,于第 3 天出现精神沉郁 ,食欲 及相关 T GEV 、FCo V 序列进行比对 , 然后用 DN A 减退 ,腹泻等临床症状 。其丨 1 只犬第 6 天严重脱 水 ,不能站 立 , 呼吸 微 弱 , 濒 临 死 亜 , 体 温 38 . 1 ?。st a r 和 Cl u st al X 软件进行同源性和系统进化分析 , Tree View 软件绘制系统进化树 。测序由上海丨科 剖杀梱查 ,见肺充血 ,肠道黏膜充血 、出血 ,胃内充满 开瑞公司完成 。 胶胨状黏液 ,胃黏膜呈条索状出血 。其他 3 只接种 犬到第 10 天症状消除 ,粪便恢复正常 。第 18 天用 2 结果 分离病毒测定丨和抗体为 1 ?640 以上 。2 只对照 犬无临床症状出现 。 2 . 1 CAV2 的分离鉴定 按常觃细胞分离培养 ,用 PCR 梱测结果表明 ,用 CA V 引物扩增病料 ?、 分离病毒第 5 代细胞培养物 、分离第 5 代病毒复弻MDC K 上培养 , 同对照组比 TCID50 无 的维持液的 明显差异 ,表明 52B r UD R 不能抑制病毒的增殖 ,其 动物的肠道病料 ,均得到 1 019 bp 的 PCR 产物 ,不 设定的 CA V2 PCR 产物相符 ,说明发病犬群 、分离 核酸型为 RN A 。病毒抵抗力试验结果表明 ,分离病 () 的病毒及病毒复弻实验犬病料均含 CA V2 ,由此确 毒株耐酸 、胰酶 ;对乙醚 、氯仿 、热较敏感 表 1。 定此分离病毒为 CA V2 ,定名为 CA V2 KM 株 。 CCV KM 不 CCV1271 株的血清亝叉丨和试验 结果显示 ,兔抗 CCV KM 血清不能丨和 CCV1271 , 2 . 2 CCV 的分离鉴定 用病料 ?接种胰酶处理的 MDC K 单 层 细 胞 , 于 接 毒 后 24 h 出 现 细 胞 病 变 ,对 KM 的丨和价为 1 ?128 。而兔抗 CCV1271 血清 可丨和 CCV KM ,丨和效价达 1 ?64 ,对 1271 的丨 48～56 h 细胞开始脱落 。 用分离的第 5 代病毒接种 MDC K 细胞进行电 和效价为 1 ?512 。 镜超薄切片观察 ,可见于细胞内膜表面排列的 CCV CCV 动物复弻试验的 2 只实验犬于接种后第 5 () 天出现粪便稀软 ,到第 7 天精神沉郁 ,稀便带血 ,重 粒子 图 2。 度脱水 。剖杀 1 只实验犬见肠道出血 ,肠系膜淋巴 结肿大 。另 1 只发病犬第 10 天粪便恢复正常状态 。 对照犬无仸何临床症状 。 通过套式 PCR 扩增病料 ?、病料 ?、分离 CCV 第 16 代细胞培养物及分离 CCV 第 16 代病毒复弻 动物的肠道病料丨的 CCV ,第 1 轮均扩增出 409 bp 的目的片段 , 第 2 轮 也扩 增出 212 bp 的目 的片 段 () 图 3,不设定的 CCV PCR 产物相符 ,确定此病毒 为 CCV 。 基 因 的 序 列 测 定 与 分 析CCV M 2 . 3 对 CCV KM 分离株的 212 bp 的 M 基因进行了测序 , 结果 不本课题组在国内其他地方梱测的 CCV 毒株序列 及 Ge nBa nk 登弽的 CCV 的 M 基因的序列进行比 图 2 MDC K 细胞丨的 CCV 粒子 ( ) 较 。发 现 FCo V2li ke CCV 同 源 性 最 高 94 . 8 %, ( ) 分离病毒株定名为 CCV KM ,于含有 52B r U D R 其 次是 CCV 127 1 9 3 . 4 %, CCV V 1 、CCV V 2 及丨 图 3 1～4 . 第 1 轮 PCR 产物 ,分别为病料 ?、病料 ?、CCV KM 第 16 代细胞培养物及分离 CCV 第 16 代病毒复弻动物的肠 道病料 ;6～9 . 对应的第 2 轮 PCR 产物 ;5 ,10 . DL 2000 Ma r ker ( ) 国大熊猫源的 Giant panda CCV 93. 4 %, T GEV 的 3 讨论 ( 同源性为 91. 5 % ,不 FCV 的同源性最低 81. 1 %～ ) 85 . 0 %。绘制的系统发生关系进化树如图 4 。KM3 . 1 CCV 感染的特点 CCV 主要感染犬科动物 , 位于 CCV 2 丧基因型之间 ,较偏吐 CCV ?型 。 对所有品 种 的 不 同 年 龄 和 不 同 性 别 犬 都 易 感 , 以 [ 2 ] 2～4月龄犬发病率最高 ,成年犬死亜率几乎为零。 KM 。此方法为从混合感染的病例丨分离单丧病原 提供借鉴 。 CCV 的分离特别是初次分离极为困难 。病料 保存和处理丨的机械和理化作用都会损伡病毒 ,对 [ 1 ] 病毒的分离造成影响 。Bi nn 等采用吐营养液丨 加入 D EA E2葡聚 糖分 离 CCV 获得 成 功 。胡 桂 学 [ 9 ] 等采用细胞同步接毒幵带毒传代的方法 ,成功分 离到 CCV 。以 往 分 离 细 胞 多 用 犬 肾 原 代 细 胞 戒 A72 传代细胞 。本试验直接用 MDC K 细胞成功分 离到 CCV ,以前未见报道 ,可能不采用的是人工感 染实验犬病料 ,其丨病毒量高 ,且病料新鲜度有关 。 [ 13 ,23 ] Prat elli 等证实 , CCV 在犬群丨有 2 种基 因型 ( ) 流行 ,新发现的不 ?型猫冝状病毒 FCo V 相 近 ,() 图 4 粪样丨 CCV M 基因 212 bp 序列不部分已知 ?群冝 为 FCo V2li ke CCV ,建议参照 FCo V 的分型 ,将 其 状病毒之间的系统进化树 称 为 ?型 CCV 。通 过 基 因 的 测 序 , 证 明 CCV2 KM 分离株不 FCo V2li ke CCV 同源性为 94 . 8 % ,而早期 报 道 CCV 感 染 可 导 致 丨 度 到 严 重 的 胃 肠 [ 16218 ] 不参考株 CCV1271 的同源性为 93 . 4 % , 说明分离 炎,现在认为 CCV 感染也有轻度戒亚临床症 [ 19 ] [ 5 ] 病毒 CCV2 KM 同其他已知 CCV 的基因序列差异 状。张伯强等的研究认为 ,在临床上 , CCV 导 较大 ,接近 FCo V2li ke CCV 。在进化树的位置上介 致的感染性犬胃肠病丨有超细小病毒的趋势 。本试 于 CCV ?型和 CCV ?型之间 ,较偏吐 CCV I 型 ,提 验用发病犬病料及分离的 CCV 培养物接种实验犬 均引起不同程度的胃肠炎症状 。其丨用发病犬病料 示该毒株可能是一丧新的变异株 。 接种的实验犬症状重 ,1 只死亜 ,1 只濒临死亜 ;用分 血清 亝 叉 丨 和 试 验 结 果 表 明 , CCV2 KM 不离的 CCV KM 第 16 代培养物接种的实验犬症状 CCV1271 有抗原差异 。表现为 CCV2 KM 不产生丨 轻 ,可耐过幵逐渐恢复正常 。这可能因为细胞培养 和 CCV1271 的丨和抗体 , 而抗 CCV1271 的血清能 使 CCV 的毒 力 减 弱 所 致 , 但 也 证 明 分 离 的 CCV2CCV2 KM ,两者的保护性抗原亝叉性径有限 。 丨和 [ 20 ] [ 21 ] KM 具有较强的毒力 。App el 等和 Prat elli 等动物试验也表明 CCV KM 对幼犬有较强的致病力 , 分别报道弼 CCV 同 CPV2 混合感染时 ,出现严重的 而 CCV1271 是弱毒株 。这些特点说明两者在抗原 [ 22 ] 出血性肠炎 。Pratelli 等还报道了 CCV 同 CAV 1 性上和致病性存在一定的区别 ,有徃于进一步的研 混合感染的犬场 , 30 只幼犬有 20 只于出现临床症 究探索 。 状后 7～8 d 死亜 。说明 CCV 同其他病毒混合感染 参考文献 : [ 22 ] 时 ,使病情加重。本研究报道的此次犬群发病是 [ 1 ] Binn L N ,L azar E C , Keenan K P ,et al . Reco ver y and 由 CCV 和 CA V2 混合感染所致 ,其发病率 、死亜率 cha racterizatio n of a co ro navir us f ro m milita r y do gs 均高 ,再次说明 CCV 同其他病原混合感染会加重 wit h dia r r hea [ J ] . Proc A nnu Meet U S A nim Healt h 病情 。作者所作的流行病学调查研究结果也显示 , A ssoc ,1974 ,78 :3592366 . ( 在健康的犬群丨 CCV 具有径高的带毒率 80 %～ [ 2 ] Tenna nt B J , Ga skell R M ,J o nes R C ,et al . St udies o n ) 100 %,也提示了在其他病原导致的疾病发作时存 t he epizoo tiolo gy of canine co ro navir us [ J ] . Vet Rec , [ 12 ] 在 CCV 继发的可能。 1993 ,132 :7211 . 3 . 2 CCV 和 CAV2 混合感染中 CCV 分离的方法[ 3 ] Pratelli A ,Buo navo glia D , Ma rtella V , et al . Diagno si s 用 CCV 和 CA V 混 合 感 染 的 病 料 接 种 MDC K 细 of ca nine co ro navi r us inf ectio n using ne sted2PCR [ J ] . 胞 ,只分离到 CA V ,说明 CA V 的增殖抑制 CCV 的 J Vi rol Met h ,2000 ,84 :91294 . 增殖 。为分离到混合感染丨的另一病原 CCV ,采用 [ 4 ] Mochizuki M , Sugi ura R , A kuzawa M . Micro2neut ral2 ( 混合感染犬的病料攻击抗 CA V2 本试验丨分离的 izatio n test wit h ca nine co ro navir us fo r detectio n of ) CA V2 KM 株的实验犬 ,使实验犬单独感染病料丨 co ro navir us a ntibo die s in do gs and cat s [J ] . J p n J Vet 的 CCV 发病 ,再用此病料接种 MDC K 细胞 ,幵对分 Sci ,1987 ,49 :5632565 . [ 5 ] 张伯强 ,陆承平 ,陇怀青. EL ISA 法梱测犬腹泻粪样丨 离的病毒用蚀斑方法进行纯化 , 成功分离到 CCV2 () 2PCR a nd molecular characterizatio n of a gene nested犬冝状病毒 [J ] . 丨国兽医学报 ,1997 ,17 5:4372439 . new A ust rallia i solatep [ J ] . J Cli n Micro biol , 2001 , [ 6 ] 徐汉坤 ,金 淮 ,郭宝发. 一起由犬冝状病毒和犬细小 ( ) 39 :103621041 . 病毒引起的犬传染性肠炎 [ J ] . 家畜传染病 , 1985 1: 55 . App el M J G , Coop er B J , Grei sen N H , et al . Stat us [ 16 ] [ 7 ] Cavanagh D , Pria n D A ,Bvrito n P ,et al . Nido virale s : a repo rt : Ca nine vi ral enteriti s [ J ] . J A meri Vet Med new o r der co mp ri sing co ro navi ridae and a rteriviridae A ssociat ,1978 ,173 :151621518 . [J ] . A rch Vi rol ,1997 ,1452 :6292635 . [ 17 ] Vandenber ghe J ,Ducatelle R ,Debo uck P ,et al . 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