沙门氏菌检验

沙门氏菌检验 一、培养基和试剂: 1、 缓冲蛋白胨水(BP):按GB4789.28中4.12 2、 氯化镁孔雀绿(MM)增菌液:按GB4789.28中4.13规定 3、 四硫酸钠煌绿(TTB)增菌液:按GB4789.28中4.14、4.15规定 4、 亚硒酸盐胱氨酸(SC)增菌液:GB4789.28中4.16规定 5、 亚硫酸铋琼脂(BS):按GB4789.28中4. 19规定 6、 DHL琼脂:按GB4789.28中4. 20规定 7、 HE琼脂:按GB4789.28中4.21规定 8、 WS琼脂:按GB4789.28中4.23规定 9、 SS琼脂:按GB4789.28中4.22规定 10、三糖铁琼脂:按GB4789.28中4.26、27规定 11、蛋白胨水靛基质试剂:按GB4789.28中3.13规定 12、尿素琼脂(Ph7.2):按GB4789.28中3.15规定 13、氰化钾(KCN)培养基:按GB4789.28中3.16规定 14、氨基酸脱羧酶试验培养基:按GB4789.28中3.12规定 15、糖发酵管:按GB4789.28中3.2规定 16、ONPC培养基:按GB4789.28中3.3规定 17、半固体脂:按GB4789.28中4.30规定 18、丙二酸钠培养基:按GB4789.28中3.7规定 19、沙门氏菌因子血清:按26种用于初步分型;57种用于进一步分型;163种用于 详细分型。 二、沙门氏菌检验程序: 检 样 前增菌法 冻肉、蛋品、乳品直接增菌法鲜肉、鲜花蛋或其他未 及其他加工食品25g+BP 经加工的食品25g+灭菌生理盐水 225ml 25ml，做成检样匀液 10ml+MM(或)10ml+SC 检样匀液25mnl+MM(或检样匀液+B100ml 100ml TTB)100ml 25ml+SC100ml BS DHL(或JE、WS、SS) 挑取可疑菌落 TSL(斜面、底层、产气、HS)，蛋白胨水(靛基质)，尿2 素(Ph 7.2),KCN,赖氨酸 H2S+靛基质H2S+靛基质H2S+靛基质非如左述的各 种反应结果 —尿素—KCN—尿素—KCN—尿素—KCN —赖氨酸+ —赖氨酸+ —赖氨酸+/- 甘露醇、山梨醇 ONPG 非沙门氏菌 沙门氏菌血沙门氏菌血非沙门氏菌 清学试验 清学试验 报 告 三、操作步骤: (一)、前增菌和增菌 冻肉、蛋品、乳品及其他加工食品均应经过前增菌。各称取检样25g，加在装有255ml缓冲蛋白胨水的500ml广口瓶内。固体食品可先应用均质器以8000~100000r/min打碎1min，或用乳钵加灭菌砂磨碎，粉状食品用灭菌匙或玻棒研磨使乳化，于36?1?培养4h(干蛋品培养18~24h)移取10ml，转种于100ml氯化镁孔雀绿增菌液或四硫酸钠煌绿增菌液内，于42?培养18~24h。同时，另取10ml，转种于100ml亚硒酸盐胱氨酸增菌液内，于36?1?培养18~24h.。 鲜肉、鲜蛋、鲜乳或其他未经加工的食品不必经过前增菌。各取25g(25ml)加入灭菌生理盐水25ml，按前法做成检样匀液;取25ml接种于100ml氯化镁孔雀绿增菌液或四硫磺酸钠煌绿增菌液内，于42?培养24h;另取25ml接种于100ml亚硒酸盐胱氨酸增菌液内，于36?1?培养18~24h。 (二)分离: 取增菌液1环，划线接种于一个亚硫酸铋琼脂平板和一个DHL琼脂平板(或HE琼脂平板、WS或SS琼脂平板)。两种增菌液可同时划线接种在同一平地板上。于36?1?分别培养18~24h(DHL、HE、WS、SS)或40~48h(BS)，观察各个平板上生长的菌落，沙门氏菌?????和沙门氏菌?在各个平板上的菌落特征见表1。 表1 沙门氏菌各群在各种选择性琼脂平板上的菌落特征 选择性琼脂平板 沙门氏菌????? 沙门氏菌?(即亚利桑那菌) 亚硫酸铋琼脂 产硫化氢菌落为黑色有金属黑色有金属光泽 光泽、棕褐色或灰色，菌落周 围培养基可呈黑色或棕色;有 些菌株不产生硫化氢，形成灰 绿色的菌落，周围培养基不变 DHL琼脂 无色半透明;产硫化氢菌落中乳糖迟缓阳性或阴性的菌株 心带黑色或几乎全黑色 与沙门氏菌?????相同; 乳糖阳性的菌株为粉红色，中 心带黑色 HW琼脂 蓝绿色或蓝色，多数菌株产硫乳糖阳性的菌株为黄色，中心WS琼脂 化氢，菌落中心黑色或几乎全黑色或几乎全黑色;乳糖迟缓 黑色 阳性或阴性的菌株为蓝绿色 蓝色，中心黑色或几乎黑色 SS琼脂 无色半透明;产硫化氢菌株有乳糖迟缓阳性或阴性的菌株 的菌落中心带黑色，但不如以与沙门氏菌?????相同; 上培养基明显 乳糖阳性的菌株为粉红色，中 心带黑色，但中心无黑色形成 时与大肠艾希氏菌不能区别 (三)生化试验 1、自选择性琼脂平板上直接挑取数个可疑菌落，分别接种三糖铁琼脂。在三糖铁琼脂内，肠杆菌科常见属种的瓜结果见表2。 表2 肠杆菌科各属在三糖铁琼脂内的瓜结果 斜面 底层 产气 硫化氢 可能的菌属和种 沙门氏菌属、弗 劳地氏柠檬酸杆- + +/- + 菌、变形杆菌属、 缓慢德华氏菌 沙门氏菌?、弗 劳地氏柠檬酸杆+ + +/- + 菌、普通变形杆 菌 沙门氏菌属、大 肠埃希氏力、蜂- + + - 窝哈夫尼亚菌、 摩根氏菌、普罗 菲登斯菌属 伤寒沙门氏菌、 鸡沙门氏菌，志 贺氏菌属、大肠- + - - 埃希氏菌、蜂窝 哈夫尼亚菌、摩 根氏菌、普罗莫 菲登斯菌属 大肠埃希氏菌、 肠杆菌属、克雷+ + +/- - 伯氏菌属、沙雷 氏菌属、弗劳地 氏柠檬酸杆菌 注:+ 阳性; - 阴性; +/- 多数阳性，少数阴性 表2说明在三糖铁琼脂内只有斜面产酸并同时硫化氢(H2S)阴性的菌株可以排除，其 他的反应结果均有沙门氏菌的可能，同时了均有不是沙门氏菌的可能。 2、在接种三糖铁琼脂肪的同时，再接种蛋白胨水(供做靛基质试验)、尿素琼脂(Ph7.2)、 氰化钾(KCN)培养基和赖氨酸脱羧酶试验培养基及对照培养基各1管，于36?1?培养 18~24h，必要时可延长至48h，按表3判定结果。按反应序号分类，沙门氏菌属的结果应属 于A1、A2和B1，其他5种反应结果均可以排除。 表3肠杆菌各属生化反应初步鉴别表 反应序号 硫化氢靛基质 Ph7.2尿素 氰化钾赖氨酸脱羧酶 判定菌属 (H2S) (KCN) A1 + - - - + 沙门氏菌属 A2 + + - - + 沙门氏菌属(少见)缓慢 爱德氏菌 A3 + - + + - 弗劳地氏柠檬酸杆菌，厅 异京戏形杆菌 A4 + + + + - 普通变形杆菌 B1 - - - - + 沙门氏菌属、大肠埃希氏 - - - - - 菌、甲型副伤寒沙门氏 菌、大肠埃希氏菌、志贺 氏菌属 B2 - + - - + 大肠埃希氏菌、志贺氏菌 - + - - - 属 B3 - - +/- + + 克雷伯氏菌族各属阴沟 - - + + - 肠杆菌、弗劳地氏柠檬酸 杆菌 B4 - + +/- + - 摩根氏摩根氏菌、普罗菲 登斯菌属 注:?三糖铁琼脂底层均产酸;不产酸者可排除;斜面产酸与产气与否均不限。 ?KCN和赖氨酸可选用其中一项，但不能判定结果时，仍需补做另一项。 ?+表示阳性;-表示阴性;+/-表示多数阳性，少数阴性。 反应序号A1:典型反应判定为沙门氏菌属。如尿素、KCN和赖氨酸3项中有1项异常，按表4可判定为沙门氏菌。如有2项异常，则按A3判定为弗劳地氏柠檬酸杆菌。 表4 pH7.2尿素 氰化钾(KCN) 赖氨酸 判定结果 - - - 甲型副伤寒沙门氏菌(要求血清学鉴定结果) - + + 沙门氏菌?或?(要求符合本群生化特性) + - + 沙门氏菌个别变体(要求血清学鉴定结果) 注:+表示阳性;-表示阴性。 反应序号A2:补做甘露醇和山梨醇试验，按表5判定结果。 甘露醇 山梨醇 判定结果 + + 沙门氏菌靛基质阳性变体(要求血清学鉴定结果) - - 绒缓慢爱德华氏菌 注:+表示阳性;-表示阴性。 反应序号B1:补做ONPG。ONPG+为大肠埃希氏菌，ONPG-为沙门氏菌。同时，沙门氏菌应为赖氨酸+，但甲型副伤寒沙门氏菌为赖氨酸-。 必要时按表6进行沙门氏菌生化群的鉴别。 表6 沙门氏菌属各生化群的鉴别 项目 ? ? ? ? ? ? 卫矛醇 + + - - + - 山梨醇 + + + + + - 水杨苷 - - - + - - INPG - - + - + - 丙二酸盐 - + + - - - KNC - - - + + - 注:+表示阳性;-表示阴性。 血清学分型鉴定 1、 抗原的准备 一般采用1.5%琼脂斜面培养物作为玻片凝集试验用的抗原。 O血清不凝集时，将菌株接种在琼脂量较高的(如2.5%~3%)培养基上再检查;如果是由于Vi抗原的存在而阴止了O凝集反应时，可挑取菌苔于1ml生理盐水中做成浓菌液，于酒精灯火焰上煮沸后再检查。H抗原发育不良时，将菌株接种在0.7%~0.8%半固体琼脂平板的中央，俟菌落蔓延生长时，在其边缘部分取菌检查;或将菌株通过装有0.3%~0.4%半固体琼脂的小玻管1~2次，自远端取菌培养后再检查。 2、 抗原的鉴定 用A~F多价O血清凝集者，依次用O4;O3、10;O7;O8;O9;O2和O11因子血清做凝 集试验。根据试验结果，判定O群。被O3、10血清凝集的菌株，再用O10、O15;O34; O19单因子血清做凝集试验，判定E1、E2、E3、E4各亚群，每一个O抗原成分的最后确 定均应根据O单因子血清做凝集试验，没有O单因子血清的要用两个O复合因子血清进 行核对。 不被A~F多价O血清凝集者,先用57种或163种沙门氏菌因子血清中的9种多价O血 清检查,如有其中一种血清凝集,则用这种血清所包括的O群血清逐一检查,以确定O群. 每种多价O血肖所包括的O 因子如下: O 多价1 A,B,C,D,E,F群(并包括6,14群) O多价2 13,16,17,18,21群 O多价3 28,30,35,38,39群 O多价4 40,41,42,43群 O多价5 44,45,47,48群 O多价6 50,51,52,53群 O多价7 55,56,57,58群 O多价8 59,60,61,62群 O多价9 63,65,66,67群 H 抗原的鉴定 属于A~F各O群的常见菌型,依次用表7所述H因子血清检查第1和第2相的H抗原.