血管紧张素II和血管内皮生长因子在视网膜新生血管中的表达及意义

血管紧张素II和血管内皮生长因子在视网膜新生血管中的表达及意义 范文 目:血管紧张素II和血管内皮生长因子在 视网膜新生血管中的表达及意义 编辑:司马小 【摘要】 目的:探讨血管紧张素II(angiotensin II, Ang II)和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)在视网膜新生血管发生发展中的作用。方法:随机对照实验研究。选取7d龄C57BL/6J新生小鼠40只～随机分为2组:正常对照组和高氧模型组～每组20只～高氧模型组建立氧诱导视网膜病变模型。采用荧光素血管灌注视网膜铺片观察视网膜血管形态学改变;制作视网膜组织切片并进行HE染色计数突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核数;采用Western blot检测视网膜Ang II和VEGF蛋白的表达。采用独立样本t检验和Pearson相关进行统计学分析～以P<0.05作为差异具有统计学意义。结果:荧光素血管灌注视网膜铺片:高氧模型组较正常对照组可见大量新生血管丛～伴明显荧光渗漏。突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核数:高氧模型组(43.23〒2.57)个较正常对照组(1.37〒0.93)个 明显增多～差异具有统计学意义(P=0.00)。视网膜Ang II蛋白表达水平:高氧模型组(0.365 〒0.004)较正常对照组(0.035 〒 0.003)明显 上调～差异具有统计学意义(P=0.00)。视网膜VEGF蛋白表达水平:高 氧模型组(0.372 〒 0.004)较正常对照组(0.049 〒 0.007)明显上 调～差异具有统计学意义(P=0.00)。结论:Ang II促血管生成的作用 与VEGF存在明确的联系～Ang II通过上调VEGF参与视网膜新生血管 的形成。 【关键词】 视网膜新生血管;肾素血管紧张素系统;血管紧张素II; 血管内皮生长因子 AbstractAIM: To investigate a possible role for the angiotensin II (Ang II) and vascular endothelial growth factor (VEGF) in the development of retinal neovascularization.METHODS: It was a random control divided into two groups randomly including normal control group and hyperoxia model group. Hyperoxia model group were exp retinopathy. Fluorescent angiography was used to assess the vascular pattern of retina. The proliferative neovascular response was quantified by counting the nuclei of new vessels extending from the retina into the vitreous in were measured by Western blot. Significant differences and Pearson correlation analysis. Statictical difference was considered significant at a P value less than : Fluorescent angiography presented increasing neovascular tufts with fluorescein leakage in hyperoxia model group compared to the normal control group. The number of endothelial cells of new vessels extending from retina to vitreous were increased significantly in hyperoxia model group (43.23〒2.57) as compared with normal control group (1.37〒0.93) (P=0.00). The expression of Ang II protein in retinas were increased significantly in hyperoxia model group (0.365〒0.004) compared with normal control group (0.035〒0.003) (P=0.00). The expression of VEGF protein in retinas were increased significantly in hyperoxia model group (0.372〒0.004) compared with normal control group ONCLUSION: There is specific relation between Ang II and VEGF in angiogenesis promoting effect. Ang II participate in the occurrence and development of retinal neovascularization via the upregulation the expression of VEGF. :retinal neovasculariz system;angiotensin II;vascular endothelial growth factor 0引言 视网膜新生血管是糖尿病视网膜病变和早产儿视网膜病变等增生 性视网膜病理改变的主要特征。在这些增生性视网膜病变中～视网膜 新生血管形成导致视网膜水肿、出血、脱离等严重影响视力的并发 症。尽管刺激视网膜新生血管生长的因素还未完全明确～但有证据显 示参与此过程的不仅有血管源性的细胞因子如血管内皮细胞生长因子 (vascular endothelial growth factor～VEGF)～还包括血管活性激 素如血管紧张素II(angiotensin II～Ang II)。在增生性视网膜病变 的发生、发展过程中～肾素血管紧张素系统 system～RAS)中主要效应介质Ang II可能与特异性生长因子特别是 VEGF相互作用来影响视网膜的发育和功能～最终共同导致视网膜新生 血管形成。本研究的目的在于探讨视网膜新生血管发生发展过程中～ Ang II和VEGF影响视网膜新生血管形成的机制。 1材料和方法 1.1材料 实验动物:鼠龄7d的健康C57BL/6J清洁级新生小鼠(中 国医科大学动物部)40只～体质量4.0，5.0g～性别不限～与哺乳母鼠 共同饲养。药品试剂:卡托普利(美国公 司)、缬沙坦(瑞士Novartis公司)、BCA蛋白定量试剂盒(美国Pierce 公司)、ECL发光试剂盒(美国Pierce公司)、异硫氰酸葡聚糖荧光素 (美国Sigma公司)、兔抗小鼠Ang II多克隆抗体(美国Sigma公司)、 兔抗小鼠VEGF多克隆抗体(美国Sigma公司)、羊抗小鼠美 国Sigma公司)。 1.2方法 动物分组和模型建立:将40只7d龄C57BL/6J清洁级新生小鼠随机分为两组:正常对照组和高氧模型组～每组20只。参照Smith等的方法建立氧诱导视网膜病变模型～高氧模型组小鼠及哺乳母鼠臵于密闭氧箱中～控制氧浓度为(75〒2)%～5 d(鼠龄12 d)后回到正常空气环境中～正常对照组一直臵于正常空气环境中。所有动物保持温度(21〒1)?C～光照黑暗循环/12h。荧光素血管灌注视网膜铺片:两组鼠龄17d的小鼠各取2只～将异硫氰酸葡聚糖荧光素(分子量:2〓106)溶于1mL的40g/L多聚甲醛中～经左心室灌注(30mL/kg)～摘取眼球～于40g/L多聚甲醛中固定1h～游离视网膜～以视盘为中心呈放射状对称切开～用抗荧光衰退封片剂将视网膜封片～采用荧光显微镜(日本Olympus公司)观察视网膜血管形态的变化。突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核计数:两组鼠龄17d的小鼠各取3只～摘除眼球后～于40g/L多聚甲醛中固定24h～常规脱水～石蜡包埋～平行于角膜至视盘的矢状位连续6μm切片～苏木素伊红染色。每只眼球取10张切片～每组30张～由同一操作者采用随机、盲法在光学显微镜(日本Olympus公司)下对切片样本计数每张切片突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核数。选取切片时注意避开视盘周围～计数血管内皮细胞核时仅计数与内界膜有紧密联系的细胞核～不包括玻璃体腔内其它与内界膜无联系的血管内皮细胞核。Western blot检测Ang II及VEGF蛋白表达:两组鼠龄17d的小鼠各取15只～每组取5只新生鼠双眼完整的视网膜～提取视网膜组织蛋白质～用BCA蛋白定量试剂盒定量视网膜组织蛋白质含量～每个样品上样含量50μg～以 电泳(4?～120V～2h)分离蛋白质～电转移法将蛋白质转移至硝酸纤维素滤膜上～用40g/L脂奶粉～于4?下过夜封闭硝酸纤维素滤膜的非特异性蛋白质结合位点～将滤膜于兔抗小鼠Ang II多克隆抗体(1?400)、兔抗小鼠VEGF多克隆抗体(1?400)在37?下孵育2h～缓冲液冲洗滤膜3次后～将滤膜转移至二抗羊抗小鼠 ～37?下孵育1h～缓冲液再次冲洗滤膜后～ECL化学发光显影。采用作为内参照。每组样品重复检测3次。应用Quantity One 4.2软件分析～分别比较各组Ang II～VEGF条带灰度值与条带灰度值的比值～表示各组蛋白相对表达水平。 统计学分析:所有数据应用SPSS 16.0 for Windows进行统计学分析～结果以〒s表示～计量资料组间比较采用独立样本t检验～两变 量间相关性采用Pearson相关分析～以P<0.05作为差异有统计学意义。 2结果 2.1荧光素血管灌注视网膜铺片 正常对照组自视盘发出的血管向四周呈放射状均匀分布～直至视网膜周边部～视网膜血管交叉成网状～分深浅两层～浅层血管呈放射状分支形态～深层血管呈多角形网状形态～两层血管通过螺旋血管互相连接(图1A);而高氧模型组视盘周围可见大片无灌注区～视网膜血管不规则扩张～走行迂曲～无灌注区周围可见大量新生血管丛～伴明显荧光渗漏(图1B)。 2.2突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核数 正常对照组未发现或仅在少数切片中发现突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核(图2A);而高氧模型组可见较多突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核～有些单独出现～有些成簇出现(图2B)～与正常对照组比较差异有统计学意义(P=0.00)。 2.3视网膜Ang II和VEGF蛋白表达的变化 Western blot检测发现2组视网膜均有Ang II蛋白表达～Ang II蛋白在正常对照组视网膜中表达微弱～而在高氧模型组视网膜中表达显著上调～与正常对照比较差异有统计学意义(P=0.00;图3)。Western blot检测发现四组视网膜中均有VEGF蛋白表达～VEGF蛋白在正常对照组视网膜中表达微弱～而在高氧模型组视网膜中表达显著上调～与正常对照组比较差异有统计学意义(P=0.00;图3)。经Pearson相关分析～在氧诱导视网膜病变中～Ang II和VEGF蛋白的表达呈明显正相关(r=0.83～P=0.00)。 3讨论 本研究利用氧诱导视网膜病变模型～目的在于探讨Ang II和VEGF在视网膜新生血管发生发展中的作用。我们的研究显示:在视网膜新生血管发生发展过程中～Ang II和VEGF蛋白水平升高～且两者呈正相关。已有研究表明～完整的RAS存在于人类和多种生物的视网膜中。Ang II作为RAS的主要成分和效应分子～由血管紧张素I在血管紧张素转换酶(angiotensin converting enzyme～ACE) 和丝氨酸蛋白酶的作用下转化生成～通过血管紧张素II 1型受体(angiotensin II type 1 receptor～AT1R)和血管紧张素II 2型受体(angiotensin II type 2 receptor～AT2R)发挥作用。Ang II不仅是一种血管活性物质～而且还是一种生长因子～可以促进多种血管细胞的扩散、转移以及合成～从而引起血管生成和重建;同时～Ang II也参与细胞生长、分化、凋亡和细胞外基质沉积等各种细胞性活动;另外～Ang II也在调节血压、交感神经活动和维持水、电解质平衡等许多生理活动中起着关键的作用;最后～Ang II也参与许多病理过程～例如:心肌肥厚、心肌梗死、动脉粥样硬化、肾病以及肿瘤。 VEGF是一种具有良好血管通透性、促进血管生成的活性因子～在缺血缺氧性视网膜病变中～VEGF表达上调并参与血视网膜屏障的破坏～于疾病的早期出现～并持续存在于整个疾病过程中[11,12]。在视网膜周细胞和血管内皮细胞中～Ang II通过AT1R介导VEGF表达～刺激VEGF产生～两者共同存在于视网膜神经节细胞层、Müller细胞层、外核层和视网膜色素上皮层中～影响视网膜微血管系统的发育 。因此～在视网膜微血管系统中～Ang II直接或通过上调其他特异性生长因子特别是VEGF来影响视网膜血管周细胞的功能、发挥促新生血管形成等作用。所以～通过阻滞RAS对以视网膜新生血管为特征的增生性视网膜病变的防治和转归有重要意义。对RAS的阻滞～主要通过ACEI和ARB来抑制Ang II～从而发挥抑制新生血管形成的作用～但两者作用机制有所不同。ACEI是通过阻断ACE～减少Ang II生成来发挥其作用;而ARB则是通过选择性阻断AT1R和Ang II结合而发挥拮抗作用。 实验结果表明～Ang II在视网膜新生血管的发生发展中成为一个关键性的因子～RAS在增生性视网膜病变视网膜新生血管形成中起关键作用～其促血管生成的作用与VEGF存在明确的联系。然而～RAS相对较为复杂～与激肽释放酶激肽系统、血管活性介质等都有交叉相互作用～因此～在增生性视网膜病变的视网膜血管渗漏和新生血管形成的临床前研究有望揭示它们之间的相互作用～特别是RAS阻滞剂抑制视网膜新生血管形成的实验和临床研究可能将会成为预防和治疗视网膜新生血管一个潜在的临床方法。 【参考文献】 1 Battegay EJ. 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