吞噬细胞介导的不同脂肪乳剂的脂质过氧化以及维生素E的抗氧化作用

吞噬细胞介导的不同脂肪乳剂的脂质过氧化以及维生素E的抗氧化作用 吞噬细胞介导的不同脂肪乳剂的脂质过氧 化以及维生素E的抗氧化作用 ChineseJourna【ofC]ini~【Nutrltion,Ju.e1999,Vo]7.No2 ? 论着? 吞噬细胞介导的不同脂肪乳剂的脂质过氧化 以及维生素E的抗氧化作用 昊国豪Connie]arstrandJorgenNordenstrom 【摘要】评估维生素E在体外的抗氧化,预防脂质过氧化的作用,比较各种不同类型脂肪乳剂对氧自由基产 生及脂质过氧化的影响.取18倒健康志愿者静脉血.采用Boyum法提取多桉白细胞(PMN)并在俸外培养PMN. 实验分单纯PMN组,lntralipld组(100%LCT),Vasolipid组(50%LCT,50%MCT)Sttnactolipld组(63%LCT,37% MCT).各组均分为静止和刺激(用热灭括白色粘株菌刺激pMN)两种状态.采用NBT还原试验测定氧自由基产 生量.根据以上分组在体外孵育PMN,并再分为掭加?tE组和无VitE组采用比色法--LPO-586测定脂质过 氧化的终产物Malonaldehyde(MDA)和4-hydroxyalkerml来计算脂质过氧化程度.刺激组的氧自由基产生量明显高 于静止组(0.795?0.180vs0405?0.090,P<0.001).脂肪乳剂可明显降 低各组的NBT值,脂肪乳剂浓度与 NBT值之间呈负线性相关(r=一0.83,P<0.001).三组不同脂肪乳剂 之间,其NBT值元统计学差异(P>005). 刺激组的脂质过氧化产物明显高于静止组 (315?1l2w134?0.72,P<000t).各脂肪乳剂缎的脂质过氧化 产物明显高于单纯PMN组,而lntralipid组脂质过氧化值高于 Vasolipid组和Straetolipid组,差异有显着性.艟着 PMN孵育时间的延长,各组的脂质过氧化值增加,6小时后接近最大 值.在体外,维生素E可明显抑{6l脂质过氧化 的产生,8pg/m[的维生素E可抑制70—80%PMN所致的脂质过氧化. 脂肪乳剂在体外可增加由吞噬细胞介导的 脂质过氧化,所增加的脂质过氧化可通过添加维生素E而得到有效 的抑制. 【关t词1吞噬细胞脂肪乳剂脂质过氧化维生素E PhaI}0qe—jnd? oedlipidperoxJdationofdlfferelltintrm~.,nonsfatemulsionsandcounteractiv eeffectofvitaminEGuo— haoWu,ConnieJarstrand,JorgenNordenstrom AbstractUnsaturatedfattyacids,8majorcornpone~ltoffatemulsionsusedin parenteralnutritionti~t’eprgnetop一 oxidationthatmaybeanimportantfeatureofoxygen-associatedti~uedamag eWeusedthenitrobluetetrazolium(NnT) reductiontesttom~uretheproductionofsuperoxideradicalsbystimulatedpofymorphonucle~rneutrophils(PMN)inthe presenceofdifferentfatemulsions:Intralipid~(containing100%long-chaintriglycerides,LCT),Vasolipid~(aphysical mixtureof50%LCTand50%medium—chaintliglycerides,MCT),andStrue tollpid(stracturedtriglycetidescontaining 63%LCTand37%MCT)WemeasuredthealfflountofmalonaldehydefMDA)and4-hydmxyalhermltodeterminethe lipidperoxidationofthethreefatemulsionsinthepresenceofstimulatedneutrophilsFurther,weinvestigatedtheroleof vitaminE(口.tocophero1)inpreventing1ipidperoxidationinvitroTheresultsshowedthatthev~duesofNBTreductionof PMN船 significantlydecreasedineachofthethreefatemulsionsandthatincreasingconcentrationsoffatemulsionswet,e a~ocfatedwithdecreasedvaluesofNBTreductions,inttdose—dependentwa y(P<0001).Therewas,however,nostatisti. tallysignificantdifferencesbetweenthevaluesofthethl-~edifferenttypesoffatemulsions(P>0.05)lipidperoxafation increasedsignificantlyinthepresealeeofallthreetSrp~~offatemulsions.and,asmorepronouncedforIntralipidthanfor VasolipidandStructolipidafter1and2hoursofincubationwithrestingaswellaswithstimulatedphagocyt~Thein— creasdlipperoxidatloaofthefatemulsionswasmarkedlyreducedby协 nE,andtheinhAbktionwas?noemrat dependentInconclusion,lipidperoxidationinvitroismorepronouncedwhenPMN5areineubatedwithfatemulsions.This increaseinlJpidperoxJdationCSYIbereducedhyaddingvitaminEtothefatemulsions 【Keywolds】 FreeradicalsNitmbluetetrazolium(NBT)testLipidperoxidationVitaminE(a-toeo. phe~o)FatemulsionNeutrophil 作者单位:200032上海压科大学中山医院普外科(吴国豪);瑞典哈丁 大学医院(c?nieJa埘rand.J曙Nrdenstr0me) 中国馅床营养杂志1999年6月第7卷第2期 自由基所致的氧化应激,组织损伤是近年来日 益关注的课题.氧自由基及羟自由基作用于细胞膜 上的不饱和脂肪酸,产生链式反应,改变细胞膜结 构,影响细胞功能和造成组织损伤.脂肪乳剂是肠 外营养的重要组成部分,其优点早为人们所熟知. 近年来有学者指出,静脉输注富含多不饱和脂肪酸 的脂肪乳剂将增加机体的脂质过氧化,从而造成组 织,脏器的损伤_],21.然而,脂肪乳剂是否会增加脂 质过氧化的产生是临床上普遍关注的问题,也是目 前脂肪乳剂研究领域的新课题之一.本研究目的是 在体外测定脂肪乳剂对白细胞的氧自由基产生的影 响;测定脂肪乳剂所致的脂质过氧化情况;评价维生 素E在体外防止脂质过氧化的作用. 和方法 一 ,多核白细胞(PMN)提取 选择18位硅康志愿者(18,65岁),各取4O, 50ml静脉血,按照Boyum法加入含甲基泛影酸钠 和甲基纤维素的柱子中,静置1小时后取上清液,加 入等体积的Hank’s液,混匀离心后取上清液,取样 着色后在显微镜下计数PMN,再加入pH为7.2, 74的Eagle’s液,将PMN稀释成5×10个/ml浓 度备用. 二,硝基蓝四氨唑(Nitrobluetetrazolium,NBT) 还原试验 NBT是电子受体,通常被用来问接测定由 PMN所产生的氧自由基的量,其表示式如下:NBT +一formazan+O2,黄色的水溶性NBT与氧自 由基结合后可转化为暗蓝色的不溶于水的甲腊 (gorma~an),甲腊可通过分光光度测定法测定,该方 法可以间接了解多核白细胞在吞噬过程中氧化代谢 (线粒体呼吸链的呼吸爆发)情况. 实验分单纯PMN组,Intralipid组(100% LCT)Vasolipid组(50%LCT,50%MCT)和Struc— tolipid.组(63%LCT,37%MCT).各组均分为静止 和刺激(用热灭活白色牯株菌刺激PMN)两种状态. 取96孔的平板,0.1mlPMN液中各加入三种不同 浓度(0.33,3.33,33.33mgTG/m1)不同的脂肪乳剂 0.03ml,刺激组加入0001ml3×10/ml浓度的热 灭活白色粘株菌,然后加入005mlNBT液,密封平 板置37?温箱中孵育60分钟,然后加入0.iml,0.5 NHCI终止反应.离心10分钟后移去上清液,再加 入0.2ml的DMSO液以提取甲脯,平板再次密封后 震荡20分钟,在570nm波长用分光光度仪测定光 密度. 三,脂质过氧化测定 采用一种新型的比色测定法LPO-586(OXIS- 21012.英国生物工程公司)测定脂质过氧化的终产 物Malonaldehyde(MDA)和4-hydroxyalkenal. MDA和4-hydroxy~dkerM是多饱和脂肪酸过氧化的 分解产物,其量的太小与脂质过氧化程度相关 取16位健康志愿者(18,60岁)静脉血,按照 与NBT试验相同的方法提取PMN,所不同的是用 20/xmol/mtTfis-HCI缓冲液代替Eae’s液.按照 NBT试验相同方法分组和刺激PMN,并再分为添 加维生素E组(a—tocopherol,0.045m1,10gg/m1)和 不用维生素E组.取0.5mlPMN液分别与三种脂 肪乳剂(0.15ml,0.33mgTG/m1)混合,在37?温箱 中孵育60或120分钟.为观察脂质过氧化的全过 程,我们选其中8位志愿者的PMN孵育1,2,4,6,8 和10小时,测定不同时间的MDA和4-hydrox— yalkenaI量,同时选择五种不同浓度的维生素E (2.5,5,8,10,15gg/m1)与脂肪乳剂混合,孵育6小 时.经过上述各种不同条件的孵育后,取0.2ml样 本置干净的玻璃试管中,加入0.65ml试剂R.,混匀 后再加0.15ml试剂R2,混匀后密封试管置45?水 浴40分钟.然后,混浊的溶液高速离心10分钟,取 上清液冷却后在586nm波长下分光光度计上比色. 我们用Tris—HCI液作空白对照,单纯PMN液作为 对照,同时测定各种脂肪乳剂中的MDA和4.hy. droxyalkenal量,以测定各种脂肪乳剂在储存时的脂 质过氧化情况. 所有数据均采用均数?差表示,应用变量 分析软件(ANOvA)作统计学分析. 结果 PMN介导的NBT还原反应见表1.结果显 示:刺激组的氧自由基产生量明显高于静止组;脂肪 乳剂可明显降低各组的NBT值,脂肪乳剂浓度与 NBT值之间呈负线性相关(r=一083,P<0001); 三组不同脂肪乳剂之间,其NBT值无统计学意(P >005).吞噬细胞介那里的脂及乳剂的脂质过氧 化见表2.结果显示:刺激组的过氧化物明显高于 静止组(P<0.001);各脂肪乳剂组的脂质过氧化产 物明显高于单纯PMN组.而Intralipid组脂质过氧 化值高于Vasolipid组和Structolipid组,差异有显着 性(P<0.001).随着PMN孵育时问的延长,各组 的脂质过氧化值增加,6小时后接近最大值,Strue— tolipid所致的脂质过氧化值在4小时后超过Va— solipid值.结果还显示,在体外,维生素E可明显抑 制脂质过氧化的产生(表2),加入维生素E后, PMN孵育全过程中脂质过氧化值均明显下降.维 ChineseJ?IofClinicNutndon,June1999,Yea7,No2 生素E对脂质过氧化的抑制与其浓度相关,维生素 E对三种脂肪乳剂所致的脂质过氧化的抑制程度相 似,其抑制程度与维生素E浓度之问并非呈线性相 关,在体外,8p.g/ml浓度的维生素E可抑制70%, 80%左右的PMN所致的脂质过氧化. 裹l吞噬细胞体外孵育时的NBT还原反应 *加脂肪乳剂与加脂肪乳剂比较P<o001 表2吞噬细胞舟导的脂肪乳剂的脂质过氧化和维生素E的抗氧化作 用 加维生衷E与不加维生衷E比较,P<0001;各脂肪乳耐蛆与对照蛆 比较,P<0001 讨论 当吞噬细胞受到微生物或其他刺激时,其活性 增加.氧化代谢和氧自由基产生增加是吞噬细胞呼 吸爆发的特征.氧自由基的化学特性有限,但在一 些金属离子的存在时可产生H2和羟自由基 (OH),后者可引起机体的脂质过氧化….尽管吞噬 细胞的氧化代谢是正常生理防御反应,但所产生的 自由基不仅破坏吞噬细胞本身,而且还可造成周围 组织的损害J.吞噬细胞产生的氧自由基可通过 NBT试验测得.本研究结果显示,在体外,脂肪乳 剂可明显降低NBT值,且下降程度与脂肪乳剂的浓 度呈线性相关.该研究与我们早年的研究结果相 似H.其机制早年被认为是因为脂肪乳剂改变了 吞噬细胞的膜结构,影响吞噬细胞功能,导致氧自由 基产生下降.目前,我们认为,脂肪乳剂降低NBT 值并非是抑制了吞噬细胞的氧自由基的产生,而是 所产生的氧自由基部分与脂肪乳剂反应产生脂质过 氧化,从而减少了与NBT的结台所致. 近年来有少数有关自由基所致的脂肪乳剂的脂 质过氧化对机体危害的报道,其所采用的方法和结 果各不一致-8].我们采用一种新型的比色法,在 体外可以准确地测定脂质过氧化的终产物MDA和 4-hydroxyalkenal,以此来判断脂质过氧化的程度. 该方法具有很高的敏感性和较强的特异性?】. 本研究结果表明,在体外,脂肪乳剂可明显增加吞噬 中国临床营养杂志1999年6月第7卷第2期 细胞介导的脂质过氧化,其中以IntraIipid作用最明 显,可能与其富含一6多不饱和脂肪酸(PUFA)有 关.Vaso|ipid所致的脂质过氧化作用低于In— tralipid,可能是因为其PUFA含量低于lntralipid之 故.Structolipid在体外孵育1,2小时,其所产生的 脂质过氧化值是三种脂肪乳剂中最低,但在孵育4 小时后却超过Vasolipid,我们认为此现象可能是与 结构脂肪乳剂的结构特征有关. 维生素E在自然界以a一,D一,占.,y-tocopherol和 8一,占-,一tocotrienols八种形式存在.其中以一to— copherol的生物活性最强.维生素E的主要生物功 能是抗氧化作用,是生物膜中一种脂溶性的阻断链 式反应的抗氧化剂.可有效地维护生物膜的稳定 性,防止生物膜因受氧自由基或脂质过氧化产物的 损害_1l?l2J.目前太多数脂肪乳剂来源于大豆油,其 中含有不同成分的tocopherol,可防止脂肪乳荆被氧 化.有研究发现,不同脂肪乳剂由于其所含的to12o— pherol成分不同,因而在储存时或混合营养液中的 过氧化程度也不同_12.我们发现本研究所用的 三种不同脂肪乳剂中的MDA和4-hydroxya[kena[ 量基本相似,几乎与空白对照值相同,表明这些脂肪 乳剂中所含的tocopherol能有效地防止脂肪乳剂被 氧化.但是,当脂肪乳剂与吞噬细胞一起时,尤其是 吞噬细胞被激活时,其脂质过氧化值明显增加,这与 吞噬细胞激活后自由基产生量增加有关.IntraIipid 所致的脂质过氧化值最高,可能与其y-tocopheml含 量相对较高,而Q—tocopheml含量较低有关”“. 因此,从理论上说,脂肪乳剂中加入适量的维生素E 可有效防止脂质过氧化的产生.本研究结果证明, 在体外,添加维生素E可有效地抑制吞噬细胞介导 的脂肪乳剂的脂质过氧化,其抑制程度与维生素E 浓度有关. 由此可见,在体外,临床上应用的脂肪乳剂可增 加吞噬细胞介导的脂质过氧化,而加入维生素E则 可有效地抑制脂质地氧化的产生.但是,临床上输 注脂肪乳剂是否会增加机体脂质过氧化尚有待进一 步的研究. 参考文献 lRosenGM.Pous,RamosCL.etaleradicalsandphagocytic cellsFAsEBJ,1995,92【H] 2M~lenMTReactiveoxygenspeci~innormalphysiology.?I【injury andphagocyto~sFr瞠radi~IsindignosticmedicineEditedby ArmstrongDPLenumPress,NewYork,1994 3Fsidovichl:Supetoxidedi~mtase:Anadaptationtoaparamagnetic gasJBinlChem,1989,264:7761. 4UrbanT.JarstrandCSeleniumeffectsonhumanneutrophdiegrmau /ocytenl.ninvitroImmuaopharmacology,1986,12:167 5GossunaAV,SkariffR,Lemo!rneM,etIncreasedtlpidpemxida— tionafterlipidinfusionasm~uredbyb~athpontaneoutputAmJ ClinNutr.198848:1394 6PitkaOHidlmanM,Anda~SGenerationoffreetadicalsin lipidemulsionudinp~nteralnutritionPediatrRes.1991.29: 56 7PitkanenOPemxidatinnofLipid~u2alons:Ah~aedfortheprenm 【ureinfant…Ivin日parenteralnutrid~FreeRa出?lBiology& Medicine,1992.13:239 8HelbockH.MotchtfikPA.AIIII~BN,T_1xlchydroperoxidesinln【工a v~ouslipidemulsionsusedinprete~infersPediatrics,l993,91: 83 9EsterbauerH.Cheesem~KHDe【ermi?an0nofaldahydiclipidper- oxidationproducts:Malo~idehydeand4-hydroxy~onena[Meth Et~ymol,1990,186:407 10JaneroDR.Mat~aldohydeandthiobarbituricacidreact[vttyasdi— agn~tlcindicesofLipidperoxidat~onperoxidative?injury F…RadB【Med,1990,9:515 11Mos]enMTReactiveoxygenspeciesinnodalphotogy,cellin— juryandphag~yiosisFreeradicalsindnomedicine.Editedby ArmstrongDPie.urnPros,NewYork,1994. 12FridovichISuperoxidedismutasetAnadaptationtoaparamagnetic agsJBiotChe.m.1989,264:7761 13Tra~rMG.CatpentierYA,Kayd叽.stalA[ternad~sinptas …and7t~ophero[concentratinnsintointraveno~in fusionoflipidemtdsio~inhuma~.Me~bolism,1993,42:701 14StagerPJK,MuhiebachSFInvitrooxidasionofIVLipidemds~ns indiffe~ntall—in—onendmixt~bagsassessedbyaniodometrlc一 sayandgasLiquidchromatographyNutrRion,1997,13:133 【5StagerPJK,MuhiebachSFLipidperoxidationofIVlipidemuLsi~s inTPNbags:Theinfluenceoft~ophero[sNutrition1998,14: 179 (牧稿:1998,08—10惨回:l99812417)